淄博地區(qū)223 368例新生兒遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜法篩查結(jié)果分析

牟 凱, 許 佳, 李雨雨, 李洪俞, 董麗萍, 劉 娜

(山東省淄博市婦幼保健院 醫(yī)學(xué)遺傳科, 山東 淄博, 255000)

新生兒遺傳代謝病(IMD)通常為單基因病,包括氨基酸代謝病(AAD)、有機(jī)酸血癥(OAD)以及脂肪酸氧化障礙(FAOD)等類型[1-2]。研究[3]發(fā)現(xiàn), IMD可影響機(jī)體的正常代謝,如不及時(shí)干預(yù)還可導(dǎo)致兒童生長(zhǎng)和智力發(fā)育異常。目前認(rèn)為通過(guò)早期診斷和治療,能夠有效降低IMD對(duì)新生兒臟器的不可逆損害,顯著改善預(yù)后,促進(jìn)出生人口素質(zhì)提高,減輕家庭和社會(huì)負(fù)擔(dān)[2]。串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)法為新生兒IMD篩查的有效技術(shù)手段,一次取血即可檢測(cè)多種類型疾病,具有檢測(cè)方便、靈敏度高等特征[4]。基因診斷包括高通量測(cè)序(NGS)、全外顯子測(cè)序(WES)等方法,能夠通過(guò)對(duì)IMD新生兒疾病相關(guān)基因進(jìn)行篩查,達(dá)到明確病因的目的。調(diào)查顯示,對(duì)于新生兒IMD,常見(jiàn)的突變基因類型包括MMACHC、ACADM等。其中MMACHC為甲基丙二酸血癥(MMA)合并同型半胱氨酸血癥的常見(jiàn)突變基因類型,報(bào)道的突變位點(diǎn)包括c.609G>A、c.658_660del、c.567dupT等;ACADM為中鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥(MCADD)的常見(jiàn)突變基因類型,報(bào)道的突變位點(diǎn)包括c.449_452del、c.387+1delG、c.467>A(p.C156Y)等[5]。不同地區(qū)新生兒IMD類型和占比以及突變基因類型具有一定差異,本研究對(duì)2015年1月—2022年8月在淄博地區(qū)開(kāi)展MS/MS法篩查的223 368例新生兒IMD情況進(jìn)行分析,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年1月—2022年8月在山東省淄博市婦幼保健院進(jìn)行IMD篩查新生兒的干血濾紙片223 368例,均為活產(chǎn)新生兒,且哺乳充分≥6次,新生兒家長(zhǎng)均自愿開(kāi)展新生兒IMD篩查,均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集: 于新生兒出生3～7 d采集足跟血,經(jīng)自然晾干制作為干血濾紙片,要求血片中血斑直徑超過(guò)8 mm, 密封后送檢。

1.2.2 MS/MS法: 應(yīng)用 Waters1525高效液相泵, 2777c自動(dòng)進(jìn)樣器和 Waters-TQD 串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè), PE公司提供的非衍生化多種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮測(cè)定試劑盒檢測(cè)新生兒AAD、OAD以及FAOD。對(duì)于初篩陽(yáng)性者,召回復(fù)查,若仍為陽(yáng)性則召回確診。其中篩查陽(yáng)性是利用百分位數(shù)法建立淄博串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)切值的上下限,若檢測(cè)指標(biāo)超出切值范圍,則判斷為可疑陽(yáng)性。其中對(duì)于MMA等高發(fā)疾病選用淄博地區(qū)5萬(wàn)例篩查數(shù)據(jù)的第99.5百分位值與第0.5百分位值作為切值的上下限; 對(duì)于發(fā)病率較低的疾病選用第99.9百分位值及第0.1百分位值作為切值的上下限。對(duì)于召回確診陽(yáng)性者,需結(jié)合臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)、基因檢測(cè)結(jié)果等明確診斷。

1.2.3 基因檢測(cè): 召回新生兒及其父母分別抽取2 mL靜脈血,進(jìn)行高通量測(cè)序(NGS)來(lái)檢測(cè)基因變異。首先將提取的基因組DNA打斷并制備文庫(kù),對(duì)目標(biāo)基因的外顯子及相鄰的內(nèi)含子區(qū)域進(jìn)行捕獲和富集,利用 NGS平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序獲得的DNA序列與人類基因組hg19參考序列進(jìn)行比對(duì)并對(duì),對(duì)變異進(jìn)行生物信息學(xué)分析和致病性分析,染色體位置明確的核苷酸變異均使用 Sanger 測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。采用其他技術(shù)(如芯片、MLPA等)對(duì)單基因內(nèi)拷貝數(shù)異常變異進(jìn)行驗(yàn)證。通常采用遺傳代謝病相關(guān)的測(cè)序包或全外顯子進(jìn)行基因診斷。含86個(gè)或277個(gè)基因的測(cè)序包常見(jiàn)基因?yàn)?ACADM、ACADS、ACADSB、ACADVLMMAA、MMAB、MMACHC、MMADHC、MMUT、SLC25A13等。新生兒希特林蛋白缺乏癥(NICCD)二階篩查采用包含SLC25A13基因16個(gè)位點(diǎn)的MassArray檢測(cè)技術(shù)。

1.3 觀察指標(biāo)

① 記錄淄博地區(qū)新生兒IMD篩查陽(yáng)性率。② 分析淄博地區(qū)新生兒IMD類型分布。③ 分析淄博地區(qū)IMD新生兒的基因檢測(cè)結(jié)果。④ 將確診的IMD新生兒進(jìn)行專案管理與對(duì)癥治療,并進(jìn)行跟蹤隨訪,記錄淄博地區(qū)IMD新生兒的隨訪結(jié)果,其中隨訪終止事件為發(fā)育遲緩、死亡。末次隨訪截至2022年12月31日。使用Excel 2010記錄數(shù)據(jù),計(jì)數(shù)資料使用[n(%)]表示。

2 結(jié) 果

2.1 新生兒IMD篩查結(jié)果

223 368例新生兒中,初篩超過(guò)截?cái)嘀档目梢申?yáng)性9 065例,初篩陽(yáng)性率為4.06%。召回復(fù)查8 942例,召回率為98.64%, 復(fù)篩陽(yáng)性的1 076例,全部召回,最終確診75例,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為6.97%(75/1 076), 發(fā)病率為0.03%(75/223 368)。其中OAD 51例,占比最高(0.023%, 1/4 380), 其次為AAD 13例(0.006%, 1/17 182)和FAOD 11例(0.005%, 1/20 306)。

2.2 新生兒IMD類型分布

新生兒IMD中,以MMA、MCADD發(fā)生率最高。其中OAD中,以MMA為主。AAD中,以高蛋氨酸血癥、NICCD為主。FAOD中,以MCADD、原發(fā)性肉堿吸收障礙(PCD)為主。見(jiàn)表1。高發(fā)疾病MMA合并型多給予左卡尼汀口服液、維生素 B12注射液、亞葉酸鈣片、甜菜堿及其他對(duì)癥治療; 單純型MMA給予左卡尼汀和特殊奶粉及對(duì)癥治療。MCADD患兒避免長(zhǎng)時(shí)間禁食,避免高脂飲食及富含中鏈脂肪酸奶粉。

表1 淄博地區(qū)新生兒IMD類型分布

2.3 MMA新生兒基因檢測(cè)結(jié)果分析

45例MMA新生兒中, 42例接受基因檢測(cè), 3例拒絕進(jìn)行基因檢測(cè)。其中40例為MMA合并同型半胱氨酸血癥,檢出MMACHC突變。2例為MMA單純型,檢出MUT突變。MMACHC檢出 22種突變位點(diǎn),突變位點(diǎn)數(shù)量為79個(gè),以c.609G>A(29.11%)、c.658_660delAAG(15.19%)、c.482G>A(12.66%)、c.80A>G(8.86%)為主; MUT檢出4種突變位點(diǎn),突變位點(diǎn)數(shù)量為4個(gè)。見(jiàn)表2。

表2 MMA新生兒基因檢測(cè)結(jié)果分析[n(%)]

2.4 其他類型IMD新生兒基因檢測(cè)分析

30例其他類型IMD新生兒中, 27例接受基因檢測(cè), 3例拒絕基因檢測(cè)。其中6例MCADD中檢出ACADM共8種突變位點(diǎn),突變位點(diǎn)數(shù)量為11個(gè),以c.387+1delG(29.11%)、c.449_452 del CTGA(15.19%)、c.1076C>T(12.66%)為主; 4例NICCD中檢出SLC25A13共5種突變位點(diǎn),以IVS16ins3kb(28.57%)、c.852_855del(28.57%)為主,突變位點(diǎn)數(shù)量為7個(gè); 同型半胱氨酸血癥、2-MBCDD、異戊酸血癥、高蛋氨酸血癥、丙酸血癥、高精氨酸血癥、PCD突變基因中各檢出2種突變位點(diǎn)。見(jiàn)表3。

表3 其他類型IMD新生兒基因檢測(cè)結(jié)果分析[n(%)]

2.5 IMD新生兒父母的基因檢測(cè)結(jié)果分析

75例IMD新生兒父母均未見(jiàn)對(duì)應(yīng)疾病的臨床表現(xiàn)。對(duì)檢出基因突變的60例IMD新生兒父母均進(jìn)行基因檢測(cè)以確認(rèn)變異位點(diǎn)來(lái)源,其中57例(95.00%)來(lái)源于父母雙方各1個(gè)位點(diǎn)的變異, 2例(3.33%)來(lái)源于父母單方, 1例(1.67%)為新發(fā)變異。

2.6 IMD新生兒的隨訪結(jié)果

IMD新生兒隨訪時(shí)間為4～73個(gè)月,中位隨訪時(shí)間為19個(gè)月。其中正常42例(56.00%, 42/75), 發(fā)育遲緩31例(41.33%, 31/75), 死亡2例(2.67%, 2/75)。發(fā)育遲緩均為OAD, 分別為MMA 30例和丙酸血癥1例,死亡患兒發(fā)生于MMA和酪氨酸血癥中,各1例。見(jiàn)表4。

表4 IMD新生兒的隨訪結(jié)果分析[n(%)]

3 討 論

IMD是由基因缺陷引起的維持機(jī)體正常代謝的酶、受體等功能異常性疾病,起病通常較為隱匿,可累及多臟器損害[6]。目前認(rèn)為, IMD各年齡段均可發(fā)病,其中新生兒期和小嬰兒期發(fā)病率較高,可導(dǎo)致敗血癥、發(fā)育遲緩、腦癱甚至死亡[7]。MS/MS的主要原理為物質(zhì)質(zhì)荷比間的差異,檢測(cè)中無(wú)需參考臨床癥狀,能夠有效滿足新生兒疾病篩查的相關(guān)需求,并于1990年首次在新生兒IMD篩查中使用,并逐漸得以推廣[8]。通過(guò)明確淄博地區(qū)新生兒IMD MS/MS法篩查結(jié)果,有助于增強(qiáng)醫(yī)師對(duì)該類型疾病的認(rèn)知,明確相關(guān)疾病譜,為改善出生缺陷、提高診療相關(guān)經(jīng)驗(yàn)、促進(jìn)優(yōu)生優(yōu)育提供參考。

本研究發(fā)現(xiàn),淄博地區(qū)223 368例新生兒中,篩查出IMD共75例,發(fā)病率為0.034%(1/2 978), 高于唐誠(chéng)芳等[9](0.029%, 1/3 444)、陳遲等[10](0.022%, 1/4 535)的研究,進(jìn)一步提示淄博地區(qū)新生兒IMD發(fā)生形勢(shì)可能較為嚴(yán)峻。此外,本研究中,新生兒IMD初篩陽(yáng)性率偏高,這可能是與IMD診斷結(jié)果受參考標(biāo)準(zhǔn)、檢測(cè)人員、儀器、樣本、結(jié)果判讀方法等多方面因素的影響有關(guān)[11]。目前認(rèn)為,初篩陽(yáng)性率的偏高可造成較重的召回負(fù)擔(dān)[12]。本研究中,召回復(fù)查率為98.64%, 與既往研究[13]相似。在淄博地區(qū),臨床工作中應(yīng)加強(qiáng)對(duì)新生兒IMD相關(guān)知識(shí)的普及,增強(qiáng)新生兒家長(zhǎng)對(duì)IMD的認(rèn)知,以進(jìn)一步提高IMD的篩查率; 提高檢測(cè)人員的操作水平,加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控,優(yōu)化結(jié)果判讀方法,并根據(jù)當(dāng)?shù)丶膊∽V等信息選擇合適的參考標(biāo)準(zhǔn),以降低初篩陽(yáng)性率; 可通過(guò)設(shè)立IMD專項(xiàng)救治資金,以減少家長(zhǎng)的憂慮,確保患兒的及時(shí)診斷和救治[14]。此外,本研究75例新生兒IMD中, OAD占比最高(1/4 380), 其次為AAD(1/17 182)和FAOD(1/20 306), 其中OAD的發(fā)病率明顯高于廣州市[10]和吉林省[1]。

調(diào)查[15]顯示,中國(guó)新生兒IMD中,苯丙氨酸羥化酶缺乏癥、PCD以及MMA的發(fā)生率最高。本研究中,新生兒IMD中, MMA、MCADD發(fā)生率最高,與上述調(diào)查結(jié)果具有一定差異,進(jìn)一步提示新生兒IMD分布具有一定的地區(qū)差異。研究[16]發(fā)現(xiàn), MMA屬于OAD中最為常見(jiàn)的類型,中國(guó)MMA發(fā)生率高于美國(guó)、意大利等國(guó)家,而北方MMA發(fā)生率高于南方,患病比例為1/86 000～1/3 000。本研究中, MMA的發(fā)病占比為1/4 964, 提示淄博地區(qū)是MMA的高發(fā)區(qū)域。研究[17]發(fā)現(xiàn), MMA臨床癥狀不典型,多數(shù)患者在新生兒期起病,起病越早,病情越重,且常與敗血癥等疾病混淆,造成誤診等的發(fā)生。也有研究[18]認(rèn)為,不同年齡段發(fā)病的MMA患者臨床表現(xiàn)具有較大差異,對(duì)于新生兒期發(fā)病者,往往具有嗜睡、喂養(yǎng)困難等癥狀; 對(duì)于兒童期發(fā)病者,可表現(xiàn)為生長(zhǎng)發(fā)育滯后、語(yǔ)言功能倒退等癥狀; 對(duì)于成年期發(fā)病者,則往往表現(xiàn)為精神障礙等癥狀。本研究發(fā)現(xiàn), MMA患者基因檢測(cè)結(jié)果中,發(fā)現(xiàn)MMACHC和MUT共2種基因突變類型,并以MMACHC為主。MMACHC中,以c.609G>A(29.11%)、c.658_660delAAG(15.19%)、c.482G>A(12.66%)占比最高,與既往研究[19]結(jié)果相似。本研究發(fā)現(xiàn),隨訪過(guò)程中, 41.33%的MMA患兒合并發(fā)育遲緩, 2.67%死亡,提示MMA患兒的預(yù)后較差,盡早確診并開(kāi)展臨床干預(yù)是改善患兒預(yù)后的主要方法。此外,本研究中,1例酪氨酸血癥患兒死亡,這可能是由于該患兒為急性發(fā)病,迅速進(jìn)展為肝功能衰竭,病情較重有關(guān)。

綜上所述,淄博地區(qū)新生兒IMD發(fā)病率為0.034%(1/2 978), 以O(shè)AD為主,其中MMA發(fā)病率最高,并以MMACHC突變?yōu)橹鳌５潜狙芯坎⑽锤采w淄博地區(qū)所有新生兒,關(guān)于淄博地區(qū)IMD的真實(shí)發(fā)生率仍需擴(kuò)大樣本開(kāi)展進(jìn)一步分析。