生姜蛋白酶無機大分子雜化納米花的制備與研究

羅璇 陳玥 雷晶晶 馬才學 沈瑞敏

摘要：為提高游離生姜蛋白酶的酶活力，文章利用生姜蛋白酶和無機金屬鹽離子通過組裝的方法成功合成了一種具有多級花狀結構的新型納米材料。通過掃描電子顯微鏡確定了生姜蛋白酶-無機雜化納米花的組成和結構，并進一步優化了生姜蛋白酶無機大分子雜化納米花的制備條件，研究了其酶學性質和使用穩定性，初步探索了納米花酶活力與其形貌結構的關系。實驗結果表明，以生姜蛋白酶為有機成分，磷酸銅為無機成分，制備的酶-無機雜化納米花的形貌結構與酶濃度、Cu2＋濃度、pH、溫度等因素密切相關，納米花外表圓潤、花瓣飽滿、形狀規整、粒徑相似時，生姜蛋白酶-無機雜化納米花的酶活也更高。當酶濃度為0.5 mg/mL、CuSO 4濃度為0.8 mol/L、pH為6.0、溫度為4 ℃時，酶活力最高，可達到10 302.2 U/mg，是游離生姜蛋白酶的7 000%，溫度、酸堿穩定性較高，重復使用性較好。

關鍵詞：生姜蛋白酶；無機雜化納米花；形貌結構；固定化酶

中圖分類號：TS201.25? ? ? 文獻標志碼：A? ? ?文章編號：1000-9973（2023）07-0081-07

Abstract： To improve the enzyme ability of free ginger protease， in this paper， a new type of nano material with multistage floral structure is successfully synthesized by assembly of ginger protease and inorganic metal salt ions. The composition and structure of ginger protease-inorganic hybrid nanoflower are determined by scanning electron microscopy， the preparation conditions of ginger protease inorganic macromolecule hybrid nanoflower are further optimized， the enzymatic properties and use stability are studied，and the relationship between nanoflower enzyme activity and its morphological structure is preliminarily explored. Experimental results show that with ginger protease as the organic component， copper phosphate as the inorganic component， the morphological structure of the prepared enzyme-inorganic hybrid nanoflower is closely related to enzyme concentration， Cu2+ concentration， pH， temperature and other factors. When nanoflower has round appearance， plump petals， regular shape and similar particle size， ginger protease-inorganic hybrid nanoflower enzyme activity is higher. When the enzyme concentration is 0.5 mg/mL， the CuSO 4 concentration is 0.8 mol/L， the pH is 6.0， and the temperature is 4 ℃， the enzyme ability is the highest， which can reach 10 302.2 U/mg， 7 000% of free ginger protease enzyme activity. The temperature and acid-base stability is higher， and the reusability is better.

Key words： ginger protease; inorganic hybrid nanoflower; morphological structure; immobilized enzyme

生姜蛋白酶是一種新型天然植物蛋白酶，因為其良好的藥用價值和在食品添加劑中的廣泛應用，具有很大應用前景[1]。但因為游離生姜蛋白酶的不穩定性，利用現有固定化技術，酶活性不高，穩定性不強，導致少有人對其關注，使得該酶未發揮出其應有的作用[2-3]。

通過固定化作用，可以優化酶學性質，增加酶與底物的適用性。酶通過雜化納米修飾具有獨特的優勢，一是因為酶雜化納米花的制備過程簡單，且不涉及任何劇烈的反應條件，因此能有效地降低固定化過程中酶活的損失；二是酶雜化納米花具有獨特的形貌特征和理化特性，如較高的比表面積、穩定的金屬骨架，因此能顯著提升酶的穩定性、催化效率以及重復利用性[4-6]。

近年來，多種酶已經和無機物材料成功形成固定化組裝，并且顯著提高了其酶活、重復使用次數和穩定性。有文獻表明，蔗糖異構酶Pal I結合Cu2+制備納米花固定化酶，其固定化結構明顯提高了酶的穩定性，且具有較好的循環性能[7]；利用含Cu2+的無機物與蛋白質雜化可以形成雜化納米花，并且酶的穩定性及使用效率顯著提高[8]。

本文利用生姜蛋白酶結合Cu2＋成功合成了一種新型納米花結構材料，并且優化了其制備條件，通過掃描電鏡（SEM）確定了生姜蛋白酶-無機雜化納米花的組成和結構，并對其結構和性質進行了分析和測試，研究了其酶活力、穩定性及重復利用性。這種新型的生姜蛋白酶-無機雜化納米生物催化劑將在化工、生化、制藥和生物技術等工業過程中具有廣闊的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮生姜：市售；磷酸氫二鈉、三氯乙酸、氫氧化鈉、三水醋酸鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉、氯化鈉、硫酸銅、葡聚糖凝膠G-50（均為分析純）；干酪素、酪氨酸、福林酚試劑（均為生物純）。

1.2 儀器與設備

JSM-6010LA掃描電子顯微鏡 日本電子株式會社；FD-1A-50真空冷凍干燥機 上海繼譜電子科技有限公司；UV2000紫外可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；TG16-WS離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；AP224X電子天平 島津儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生姜蛋白酶液的制備[9]

取外形完好、無腐爛和機械損傷的新鮮生姜50 g，洗凈，切成小塊后，加入2倍體積的PBS緩沖液（0.05 mol/L，pH 6.0）研磨30 min，過濾，將濾液收集置于4 ℃冰箱中，2 h后以4 000 r/min離心10 min，上清液即為生姜蛋白酶粗酶液。Sephadex G-50純化生姜蛋白酶，選擇磷酸緩沖液（0.05 mol/L，pH 6.0），柱床高度50 cm，上樣量3 mL粗酶，流速45 cm/h，洗脫液總用量150 mL對粗酶液進行Sephadex G-50純化。采用福林酚法測其初始酶活。

1.3.2 酪氨酸標準曲線的制作[10]

參考文獻[10]，以酪氨酸的濃度（μg/mL）為橫坐標、A 660 nm為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.3 生姜蛋白酶酶活的測定

參考團隊前期的研究成果，分別取生姜蛋白酶酶液和離心后剩余的酪蛋白及酶蛋白沉淀物1 mL于水浴預熱2 min，混合均勻后繼續恒溫反應10 min，加入 0.4 mol/L三氯乙酸2 mL，沉淀殘余蛋白。離心，取 1 mL上清液，加入0.4 mol/L的碳酸鈉5 mL和1 mL稀釋后的福林酚試劑，混合均勻，在40 ℃水浴顯色10 min，采用可見分光光度計測其在680 nm處的吸光度。

生姜蛋白酶活力（U）＝A×K×N×7/10。

式中：A為樣品的平均吸光度值；K為100除以酪氨酸標準曲線上100 μg/mL對應680 nm處的吸光度值；N為酶液稀釋倍數；7為反應液總體積；10為酶液分解酪蛋白反應時間10 min。

固定化酶相對酶活力（%）＝每次使用后固定化酶活力/最高固定化酶活力×100。

1.3.4 酶-無機雜化納米花的制備工藝優化[11-12]

1.3.4.1 不同Cu2+濃度下無機雜化納米花的制備

配制不同濃度的CuSO 4溶液（0，0.4，0.8，1.0 mol/L），各取0.2 mL于30 mL燒杯中，并加入用PBS緩沖液配制的酶濃度為1 mg/mL的生姜蛋白酶液30 mL。搖勻后室溫靜置培養72 h，分別取上層液體和下層固體測其酶活，收集沉淀，蒸餾水洗滌3次，然后以4 000 r/min 離心后，收集沉淀，真空冷凍干燥得到納米花。

1.3.4.2 不同酶濃度下無機雜化納米花的制備

用PBS分別配制不同濃度的生姜蛋白酶液（0，0.5，1.0，2.0 mg/mL），取30 mL于燒杯中，并分別加入0.2 mL 0.8 mol/L的CuSO 4溶液，搖勻后靜置培養72 h。

1.3.4.3 不同pH下無機雜化納米花的制備

配制0.01 mol/L、pH 7.4的PBS緩沖液，利用NaOH溶液或者鹽酸溶液將PBS緩沖液的pH分別調至6.0，8.0，10.0，分別配制不同pH的1 mg/mL的生姜蛋白酶溶液，再加入0.2 mL 0.8 mol/L的CuSO 4溶液。

1.3.4.4 不同溫度下無機雜化納米花的制備

將0.8 mol/L的CuSO 4溶液各取0.2 mL加入3個燒杯中，再加入用PBS緩沖液配制的酶濃度為1 mg/mL的生姜蛋白酶液30 mL，分別置于－20，4，20 ℃（室溫）下培養72 h。

1.3.5 酶-無機雜化納米花包埋率的測定

未知樣品中蛋白質含量的測定：取1 mL待測上清液，加入4 mL考馬斯亮藍，在595 nm處測定其吸光度值，根據標準曲線求得上清液中酶的含量。通過比較納米花合成前初始酶濃度與納米花合成后上清液中的酶含量，計算納米花的包埋率：

E=C r-C sC r×100%。

式中：C r為初始酶濃度（mg/mL）；C s為上清液中酶含量（μg/mL）。

1.3.6 酶-無機雜化納米花實際酶含量的測定及其煅燒溫度的確定[13]

實際酶含量的測定：通過高溫煅燒，去除納米花中的有機成分，再通過煅燒前后重量的3次重復對比確定納米花中實際酶含量：

W=G N-G 0G N×100%。

式中： G N為納米花的質量（g）； G 0為Cu 3（PO 4）·3H 2O的質量（g）。

煅燒溫度的確定：分別稱取200 mg納米花樣品于馬弗爐中煅燒2 h，設置煅燒溫度分別為500，550，600，650，700 ℃。觀察煅燒后殘余粉末達到恒重時的溫度即為煅燒溫度。

1.3.7 酶-無機雜化納米花熱穩定性的測定

測定固定化和游離生姜蛋白酶在不同溫度（20～80 ℃）條件下的酶活力，確定最適溫度。然后將兩種酶分別在不同溫度下處理1 h，在最適溫度下檢測各自酶活力，并計算熱處理后的剩余酶活力，分析游離生姜蛋白酶和固定化生姜蛋白酶的熱穩定性。

1.3.8 酶-無機雜化納米花pH穩定性的測定

測定固定化和游離生姜蛋白酶在不同pH （2.0～10.0）條件下的酶活力，確定最適pH。再將兩種酶分別置于不同pH的PBS緩沖液中處理2 h，檢測各自酶活力，計算酸堿處理后剩余的酶活力，分析游離生姜蛋白酶和固定化生姜蛋白酶的pH穩定性。

1.3.9 納米花重復率的測定[14]

測定收集好的納米花的吸光度及酶活，并用去離子水重復洗滌測定后的納米花，以去除納米花表面殘留的底物和產物，并測定納米花的吸光度及酶活。

1.3.10 納米花酶活的測定

通過煅燒法得到了納米花的實際含酶量，稱量一定量的納米花，使其分散于2 mL PBS緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.4）中，配制成均勻酶液，計算其稀釋倍數并測其酶活。

2 結果與分析

2.1 酪氨酸標準曲線

由圖1可知，酪氨酸標準曲線的R2=0.998 1，y=0.010 6x＋0.011 1，說明線性關系良好。

2.2 制備條件對酶-無機雜化納米花形貌表征的影響

根據SEM（掃描電鏡）分析不同條件下生姜蛋白酶-無機雜化納米花的形貌。

2.2.1 不同酶濃度對無機雜化納米花的影響

由圖2可知，在不同酶濃度下合成的納米花緊密度和均勻性都不同，當生姜蛋白酶濃度為0.5 mg/mL時，納米花花瓣的緊密程度最佳。當生姜蛋白酶濃度為0 mg/mL時，沒有花狀結構生成且相當破碎，可能是由于其生成的納米材料中沒有生姜蛋白酶。說明酶是生姜蛋白酶-無機雜化納米花形成的必要條件，當溶液中沒有酶時，就不能同溶液中的Cu 3（PO 4） 2·3H 2O形成生姜蛋白酶-Cu2＋絡合物。

2.2.2 不同Cu2＋濃度對無機雜化納米花的影響

由圖3可知，隨著Cu2＋濃度的增加，納米花花瓣的排列更加緊密，外表也更加圓潤。從納米花外表上看，當Cu2＋濃度為0.8 mol/L時納米花質量最好，當Cu2＋濃度升高到1.0 mol/L時，并沒有出現形狀規則均勻的納米花，只出現了不規則形狀的生姜蛋白酶-Cu2＋絡合物，由此可知，當Cu2＋濃度過大時，會在一定程度上阻礙生姜蛋白酶-無機雜化納米花的形成。

2.2.3 不同pH值對無機雜化納米花的影響

由圖4可知，在溶液pH為6.0時，生姜蛋白酶-無機雜化納米花花瓣連接緊密，納米花分布均勻，且粒徑尺寸比較統一，在10 μm左右。但隨著溶液pH的增加，納米花花瓣結構逐漸破損且納米花表面的孔隙在此條件下生長不完全。所以pH 6.0是生姜蛋白酶-無機雜化納米花的最佳孵育pH。當溶液pH過堿時，納米花不能在溶液中穩定存在，可能是因為此時溶液的pH和生姜蛋白酶-無機雜化納米花的最適合pH相差較大，造成納米花的形態差別較大。

2.2.4 不同溫度對無機雜化納米花的影響

由圖5可知，當溶液放置在－20 ℃下孵育納米花時，生成的生姜蛋白酶-Cu2＋絡合物排列緊密，但從納米花的微觀形態上看，全是破碎的花瓣，表面結構不完整，幾乎沒有完整的納米花。隨著納米花孵育溫度增加到4 ℃，破損的納米花花瓣結構轉變為外表飽滿、花瓣排列緊密的納米花。隨著溫度的繼續增加，納米花花瓣又逐漸破損。由此可知，生姜蛋白酶-無機雜化納米花的最佳孵育溫度為4 ℃。

通過以上4個生姜蛋白酶-無機雜化納米花最優孵育條件的測定，結合SEM對酶-無機雜化納米花形貌的影響分析可以得出：生姜蛋白酶-無機雜化納米花中最佳CuSO 4添加量為0.8 mol/L，最佳生姜蛋白酶濃度為0.5 mg/mL，最佳孵育溫度為4 ℃，最佳孵育pH為6.0。

當酶濃度為0.5 mg/mL、CuSO 4濃度為0.8 mol/L、pH為6.0、溫度為4 ℃時，測得生姜蛋白酶-無機雜化納米花的酶活力最高，可達10 302.2 U/mg，但預實驗中測得生姜蛋白酶活力為138.143 U/mg，是游離生姜蛋白酶的7 000%，說明以生姜蛋白酶為有機成分、磷酸銅為無機成分，制備的酶-無機雜化納米花的形貌結構與酶濃度、Cu2＋濃度、pH、溫度等因素密切相關，納米花外表圓潤、花瓣飽滿、形狀規整、粒徑相似時，生姜蛋白酶-無機雜化納米花的酶活也更高。

2.3 制備條件對酶-無機雜化納米花催化活性的表征

2.3.1 不同制備條件下納米花的包埋率

2.3.1.1 蛋白質含量標曲的制備

由圖6可知，蛋白質標準曲線線性方程為：y＝0.009 2x＋0.038 5，其中R2＝0.998 5，證明考馬斯亮藍標準曲線性良好，其中x為蛋白濃度，y為吸光值。

2.3.1.2 不同制備pH下的包埋率

不同制備pH下的包埋率見表1。

2.3.1.3 不同制備溫度下的包埋率

不同制備溫度下的包埋率見表2。

2.3.1.4 不同制備酶濃度下的包埋率

不同制備酶濃度下的包埋率見表3。

2.3.1.5 不同制備Cu2+濃度下的包埋率

不同制備Cu2＋濃度下的包埋率見表4。

利用各種不同生成條件下的納米花測定其包埋率，由表3可知，生姜蛋白酶-無機雜化納米花的包埋率在酶濃度為0.5～1.0 mg/mL范圍內隨酶濃度的增加而增加，但當酶濃度過大（2.0 mg/mL）時，包埋率不能繼續增加，過多的酶并不能隨著酶濃度的增加而被固定。由表1～表4可知，納米花的包埋率隨CuSO 4添加量、最佳孵育溫度、最佳孵育pH的變化不顯著。

2.3.2 不同制備條件下納米花的酶活

2.3.2.1 不同制備酶濃度下的酶活

不同制備酶濃度下的酶活見表5。

通過對不同酶濃度下制成的生姜蛋白酶-無機雜化納米花的酶活進行檢測，發現利用生姜蛋白酶濃度分別為0.5，1.0，2.0 mg/mL時，制備出的生姜蛋白酶-無機雜化納米花的平均酶活分別為10 138.7，7 639.4，3 044.8 U/mg。其中納米花酶活最高的為初始生姜酶濃度在0.5 mg/mL時，而在相同條件下所測的游離生姜蛋白酶酶活為138 U/mg，通過計算可得酶濃度在0.5 mg/mL時孵育的納米花的酶活是游離生姜蛋白酶的7 347%，而在初始生姜酶濃度為0.5 mg/mL時形成的納米花花瓣的緊密程度也最佳，由此可以推斷出，生姜蛋白酶-無機雜化納米花的結構完整性和其酶活力有一定的關系。

2.3.2.2 不同制備Cu2+濃度下的酶活

不同制備Cu2＋濃度下的酶活見表6。

從納米花外表看，當Cu2＋濃度為0.8 mol/L時納米花質量最好。經過測定，生姜蛋白酶-無機雜化納米花酶活隨著Cu2＋濃度的增加而增加，當Cu2＋濃度升高到0.8 mol/L時，納米花酶活最高，平均達到13 506 U/mg。但是Cu2＋濃度繼續增加，納米花酶活又逐漸降低到4 390 U/mg左右。在圖3中可以觀察到Cu2＋濃度為1.0 mol/L時只出現了不規則形狀的生姜蛋白酶-Cu2＋絡合物。表明Cu2＋濃度對納米花酶活有顯著的影響，再次印證了納米花的酶活力和其形態結構有一定的關系。

2.3.2.3 不同制備pH下的酶活

不同制備pH下的酶活見表7。

本實驗選擇6.0，8.0，10.0為孵育pH，經過計算得到在不同pH下孵育的生姜蛋白酶-無機雜化納米花的酶活，得出pH 6.0，8.0，10.0制備的生姜蛋白酶-無機雜化納米花的平均酶活分別為8 949.4，6 437.9，4 162.5 U/mg。可以看出納米花的酶活隨著制備pH的升高而降低。由圖4可知，極端pH會對納米花的合成及酶活產生一些不良的影響。

2.3.2.4 不同制備溫度下的酶活

不同制備溫度下的酶活見表8。

通過對不同孵育溫度下生姜蛋白酶-無機雜化納米花酶活進行檢測，得到溫度為－20，4，20 ℃下制備的生姜蛋白酶-無機雜化納米花的平均酶活分別為2 721.7，7 634.4，5 731.8 U/mg。發現在溫度為－20 ℃時納米花酶活極小，這時通過掃描電子顯微鏡觀察并沒有發現納米花的存在，其形態上只呈現出破碎的花瓣狀，其原因可能是在－20 ℃時Cu2＋與生姜蛋白酶不能通過不斷的配位而交聯生長。

2.3.3 不同制備酶濃度下納米花的實際含酶量

納米花質量變化見表9，不同酶濃度下實際含酶量見表10。

一定的高溫條件可以去除納米花中絕大多數的生姜蛋白酶（有機成分），留下的藍綠色固體為Cu 3（PO 4） 2（無機成分），通過計算可以得出納米花中的實際含酶量。由表10可知，在酶濃度為0.5，1.0，2.0 mg/mL時納米花的實際含酶量平均為12.8%、21.2%、52.7%，在0.5～2.0? mg/mL酶濃度范圍內，納米花的酶含量隨著酶濃度的增加而增加，但酶濃度過高會導致納米花結構過于致密，造成物質傳遞受到阻礙，并不利于酶與底物相接觸，可能還會導致酶活降低，與表5的研究結果一致。

2.4 酶-無機雜化納米花pH穩定性分析

對納米花的pH穩定性進行了探究，考察了等量固定化酶和游離酶在不同pH（2.0，4.0，6.0，8.0，10.0）下處理2 h后的酶活。由圖7可知，在不同pH下，生姜蛋白酶-無機雜化納米花和游離生姜蛋白酶表現出同樣的趨勢，酶活先上升，在pH 6.0時都達到最大值，隨后pH上升，酶活隨之下降。這表明生姜蛋白游離酶的固定化并沒有改變生姜蛋白酶的最適pH。

2.5 酶-無機雜化納米花的熱穩定性

由圖8可知，生姜蛋白酶-無機雜化納米花和游離生姜蛋白酶的最適溫度皆為60 ℃，結果表明生姜蛋白游離酶的固定化并沒有改變生姜蛋白酶的最適溫度。當溫度從60 ℃繼續升高后，納米花和游離酶酶活反而下降，說明溫度過高會使蛋白酶高級結構被破壞，使酶變性失活。

2.6 酶-無機雜化納米花的重復率

最后進行可重復性能研究，結果見圖9。生姜蛋白酶-無機雜化納米花第1次的相對酶活是100%，使用6次后其活性仍能維持初始值的30%，說明生姜蛋白酶納米花材料重復使用性能良好。

3 結論

本實驗以自制生姜蛋白酶作為有機成分，以磷酸銅作為無機成分，成功組裝了生姜蛋白酶-磷酸銅雜化納米花固定化材料，并詳細研究了其制備條件、酶學性質，考察了納米花形態與納米花酶活之間的關系，發現在納米花外表圓潤、花瓣飽滿、形狀規整、粒徑相似時，生姜蛋白酶-無機雜化納米花的酶活更高。得到了生姜蛋白酶-無機雜化納米花的最佳制備條件：酶濃度為0.5 mg/mL，CuSO 4濃度為0.8 mol/L，pH為6.0，溫度為4 ℃，此時酶活力最高，可達到10 302.2 U/mg，是游離生姜蛋白酶的7 000%。發現生姜蛋白酶-無機雜化納米花的酶活和其實際含酶量不成正比，生姜蛋白酶-無機雜化納米花的重復使用性較好，其溫度和pH穩定性均有所提高。

參考文獻：

[1]周陸紅，李萌，韓太利，等.生姜加工產品應用研究現狀與前景展望[J].蔬菜，2021（1）：51-57.

[2]羅璇，陳常緣，王秀原，等.磁性復合載體固定生姜蛋白酶的酶學性質研究[J].中國調味品，2020，45（3）：57-61.

[3]柯彩霞，范艷利，蘇楓，等.酶的固定化技術最新研究進展[J].生物工程學報，2018，34（2）：188-203.

[4]CEVAHIR A， CANAN G， ONUR A， et al. Evaluation of organic-inorganic hybrid nanoflower's enzymatic activity in the presence of different metal ions and organic solvents[J].International Journal of Biological Macromolecules，2020，164：162-171.

[5]李璟，楚楚，顏繼忠.酶-無機雜化納米花的制備及在藥物研究中的應用進展[J].藥物分析雜志，2021，41（1）：21-28.

[6]羅鵬.多酶雜化納米花級聯反應體系的構建及其在催化降解淀粉和纖維素中的應用研究[D].南京：江蘇大學，2020.

[7]孟虹，趙怡，李憲臻，等.蔗糖異構酶Pal I-Cu2＋納米花固定化酶的制備及其結構、性能分析[J].中國生物制品學雜志，2021，34（3）：286-289，293.

[8]GE J， LEI J， ZARE R N. Protein-inorganic hybrid nanoflowers[J].Nature Nanotechnology，2012（7）：428-432.

[9]羅璇，王秀原，錢靜，等.磁性復合載體固定生姜蛋白酶的工藝優化研究[J].中國調味品，2019，44（11）：85-90.

[10]王翠麗，唐曉珍.生姜蛋白酶固定化研究[D].泰安：山東農業大學，2009.

[11]梁麗雯.利用組裝方法制備木瓜蛋白酶-無機雜化納米材料[D].大連：大連工業大學，2016.

[12]GL O T， OCSOY I. Preparation of magnetic horseradish peroxidase-laccase nanoflower for rapid and efficient dye degradation with dual mechanism and cyclic use[J].Materials Letters，2021，303：130501.

[13]李寧寧.酶-無機物復合納米花的制備及催化合成精細化學品的研究[D].杭州：杭州師范大學，2020.

[14]李從海.脂肪酶-無機雜化納米花的制備及其催化性能的研究[D].天津：天津科技大學，2020.