生物有機肥中解磷菌和固氮菌的篩選與鑒定

黃挺 黨俊杰 陳洪滿 姚李波 鄧冬梅 李柳紅 陳龍保

摘 要：從生物有機肥中篩選出高效的解磷菌和自生固氮菌后，通過形態(tài)學觀察、生理生化特征分析和16S rRNA序列測定等方法進行菌種鑒定，并用磷鉬藍比色法和凱氏定氮法測量解磷量和固氮量，對所篩選的菌種特性進行初步研究。實驗表明，篩選出的解磷菌為芽孢桿菌（P1、P3）和根瘤菌（P2），自生固氮菌為根瘤菌（N1）和芽孢桿菌（N2）。其中測得菌株P1的解磷能力為93.53 mg/L、菌株P2的解磷能力為23.25 mg/L、菌株P3的解磷能力為126.46 mg/L，測得菌株N1固氮能力為28.33 mg/L、菌株N2固氮能力為32.39 mg/L。結果表明菌株P3和菌株N2可作為優(yōu)勢菌種進一步優(yōu)化，為微生物菌肥擴大生產提供更好的實驗依據(jù)。

關鍵詞：解磷菌；固氮菌；篩選；鑒定；磷鉬藍比色法；凱氏定氮法

中圖分類號：S144 DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2023.01.014

0 引言

長期使用化學肥料改變了土壤的理化性質，導致土壤板結，微生物群落發(fā)生改變[1]。生物有機肥是一種含有活體微生物的肥料[2]，合理的施用能夠增進土壤肥力、改良土壤結構、促進植物生長發(fā)育、改善作物品質、增強植物抗病（蟲）和抗逆性、減少化肥的使用量。近年來，我國以綠色農業(yè)為導向，使得微生物肥料具有廣闊的發(fā)展前景[3-4]。

土壤中可被植物利用的氮元素有限，并不能滿足植物自身的營養(yǎng)需求[5]。固氮菌能夠促進植物的生長，提高土壤的供氮能力，使土壤生物環(huán)境得到改善。固氮菌可分為共生固氮菌、聯(lián)合固氮菌和自生固氮菌。3種固氮菌都可以將大氣中單質氮轉換成植物能夠吸收利用的無機態(tài)氮，其中自生固氮菌能夠獨立固氮，與植物無依存關系。研究發(fā)現(xiàn)具有固氮能力的自生固氮菌已有數(shù)十種，包括球囊霉屬、伯霍爾德桿菌屬、玉米固氮螺旋菌屬[6-7]。自生固氮菌能夠廣泛應用在玉米、小麥等農作物上，為其提供氮元素，在微生物肥料的應用中有著重要的價值[8]。

磷在植物的生長發(fā)育過程中對磷脂、核酸、ATP的合成起著重要作用[9]。土壤中磷元素含磷量平均占比0.05（w/w）[10]，但土壤中的磷元素不能直接被吸收利用，造成一些地區(qū)土壤缺乏磷元素，農作物產量低下[11]。解磷菌將土壤中難溶的磷素溶解成植物能夠吸收的有效磷，進而提升土壤養(yǎng)分，促進植物生長發(fā)育[12]。目前經分離鑒定出的解磷菌可分為36個屬，89種。其中，解磷細菌最多，包括根瘤菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞桿菌屬、微球菌屬等[11]。農業(yè)生產上，高效的解磷菌劑不僅能促進農作物增產，還能改善土壤環(huán)境進而提高磷的利用率，對生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展有著重要意義。

本實驗從生物有機肥中分離篩選出高效的解磷菌和固氮菌，并對植物的促生效應進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品來自柳州花卉市場銷售的生物有機肥。

1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10 g ，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，溶于1 L蒸餾水中，pH 7.0，放入高壓滅菌鍋中，121 ℃滅菌20 min。

阿須貝培養(yǎng)基（g/L）：甘露醇10 g，KH2PO4 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.2 g，CaCO3 5 g，CaSO4·H2O 0.5 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 L，pH 7.0 ～ 7.5，放入高壓滅菌鍋中，121 ℃滅菌20 min。

Pikovskaya無機磷培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸粉0.5 g，葡萄糖10 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，MnSO4·H2O 0.03 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，（NH4）2SO4 0.5 g，Ca3（PO4）2 5.0 g，蒸餾水定容至1 L，pH 7.0 ～ 7.5，瓊脂粉20 g（液體培養(yǎng)基不加），放入高壓滅菌鍋中，121 ℃滅菌20 min。

1.3 分離純化菌株

從生物有機肥中分別取10 g肥料倒入90 mL生理鹽水（已滅菌）中，充分溶解后，靜置10 min。取5 mL上清液分別接種到LB液體培養(yǎng)基中，在恒溫37 ℃、轉速121 r/min的條件下培養(yǎng)48 h。然后取1 mL菌液離心，倒掉上清液，加1 mL滅菌水溶解菌沉淀，然后逐級稀釋至10-5、10-6、10-7。各取200 ?L菌液在無機磷培養(yǎng)基和阿須貝培養(yǎng)基上進行涂布操作。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 ～ 3 d。分別挑取單菌株轉接至斜面培養(yǎng)基，并保藏培養(yǎng)基。

1.4 解磷菌和自生固氮菌生長曲線的測定

菌種純化后接種到10 mL滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、121 r/min條件下培養(yǎng)24 h后，移取1 mL菌液接種至盛有150 mL LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中。然后在30 ℃、121 r/min 搖床上培養(yǎng)，每個菌做2個平行實驗。以不接菌的培養(yǎng)基為空白對照。定時取1 mL菌液，并用蒸餾水稀釋至3 mL，然后在波長為600 nm條件下，測定其OD值。

1.5 解磷能力測定

將已純化的解磷菌接種至LB培養(yǎng)基上活化24 h，然后取1 mL培養(yǎng)液分別接種到2個100 mL已滅菌的無機磷液體培養(yǎng)基上，置于30 ℃、121 r/min的搖床上培養(yǎng)，以不接菌的為空白對照。培養(yǎng)7 d，每24 h取樣一次，每次取10 mL培養(yǎng)液離心，取上清液，以磷鉬藍比色法測定可溶性磷含量。

1.6 菌肥的固氮能力

重復上述1.5的步驟，取1 mL培養(yǎng)液接種到2個100 mL已滅菌的阿須貝無氮培養(yǎng)基上，置于30 ℃、121 r/min的搖床上培養(yǎng)，以不接菌的為空白對照。培養(yǎng)7 d，每24 h取樣一次，每次取10 mL培養(yǎng)液離心，取上清液，利用凱氏定氮法[13]測定其固氮能力。

1.7 革蘭氏染色觀察

使用革蘭氏染色法對2種菌種進行染色，觀察并記錄其是否是革蘭氏陽性菌或者革蘭氏陰性菌。

1.8 菌株的鑒定

對篩選的解磷菌、固氮菌2種菌株進行16S rRNA鑒定。取0.6 ～ 2.0 mL菌液進行DNA的提取和純化，將純化得到的DNA進行PCR擴增。以提取的DNA為模板，采用一對保守引物擴增基因，引物序列為27F（5-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3）和1492R（5-GGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3）。PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s；56 ℃退火30 s；72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min[14]。將擴增完的DNA進行回收純化，純化后的DNA送往廣東濰捷基（上海）貿易有限公司進行測序。將測序所得的序列在NCBI上進行BLAST比對，找到與該序列同源性最高的菌，利用MEGA5.0軟件構建進化樹，分析該菌的種屬。

1.9 菌株的生理生化實驗

結合《伯杰細菌鑒定手冊》，對篩選得到的菌株進行營養(yǎng)利用測定，包括了甘露醇、葡萄糖、木糖、衛(wèi)矛糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、硫化氫、硝酸鹽和三犁醇實驗。取20 μL菌液，接種于生理生化反應管中，然后將其密封后，觀察各個生化反應管的顏色變化。

2 結果

2.1 形態(tài)特征結果分析

使用Pikovskaya無機磷培養(yǎng)基，從生物有機肥中篩選出3株解磷菌株P1、P2、P3，使用阿須貝培養(yǎng)基篩選出2株自生固氮菌N1、N2。

菌株P1、P2、P3為解磷菌。菌株P1培養(yǎng)1 d后，菌落直徑為9 ～ 13 mm，圓形凸起，表面濕潤光滑，周邊整齊，菌體為淡黃色，為革蘭氏陽性菌，桿狀；菌株P2培養(yǎng)1 d后，菌落直徑為5 ～ 12 mm，圓形、白色、表面凸起光滑、不透明，為革蘭氏陰性菌，桿狀；菌株P3培養(yǎng)1 d后，菌落直徑為6 ～ 14 mm，圓形、白色、表面凸起粗糙、不透明，為革蘭氏陽性菌，桿狀。

菌株N1、N2為自生固氮菌，均為革蘭氏陰性菌。其中菌株N1培養(yǎng)2 d后，菌落直徑為5 ～ 10 mm，圓形、白色、表面凸起光滑、透明，桿狀；菌株N2培養(yǎng)2 d后，菌落直徑為6 ～ 13 mm，圓形、灰色、表面凸起粗糙、透明，桿狀。

解磷菌P1、P2、P3的菌落形態(tài)與固氮菌N1、N2的菌落形態(tài)如圖1所示。

2.2 生理生化實驗結果

通過對不同營養(yǎng)要素的使用，以確定菌株對各營養(yǎng)要素的可利用性。菌株的生理生化結果如表1所示，所有菌株均能利用葡萄糖作為碳源，但多數(shù)菌株不能利用衛(wèi)茅糖、乳糖和三梨醇作為碳源，這可能與其自身的代謝途徑不同有關，其中菌株N2能夠利用乳糖，可能是其分泌了β-半乳糖苷酶催化了乳糖水解。

2.3 分子鑒定結果分析

根據(jù)圖2和圖3的NCBI同源性、碳源利用性質（表1）、鏡檢結果和《伯杰細菌鑒定手冊》進行互相比對，初步確定菌株P1、P3、N2同為芽孢桿菌屬（Bacillus），菌株P2、N1同為根瘤菌屬（Rhizobium）。

2.4 生長曲線分析

圖4為各菌株的生長曲線圖。如圖4（a）所示，菌株P1、P2和P3在37 ℃、pH 7.0、121 r/min的環(huán)境下培養(yǎng)7 d，其生長曲線的趨勢大體一致。0 ～ 16 h內，菌株生長處在延緩期，此時菌數(shù)量比較少，繁殖速度比較慢，所以OD值上升幅度不大；16 ～ 48 h內菌株P1處于對數(shù)生長期，培養(yǎng)基體系營養(yǎng)物質豐富，菌齡普遍較小，這時候菌的繁殖能力最強，菌株的OD值上升速率加快；48 ～ 110 h內，菌株處于穩(wěn)定期，菌的OD值上下波動幅度不大，相對比較穩(wěn)定。110 ～ 127 h這段時間OD值下降比較緩慢，此時培養(yǎng)基內營養(yǎng)物質所剩無幾，菌密度較大，繁殖能力相對較弱。127 h后OD值下降幅度加快，原因是菌齡太大，有害物質增多，導致整個體系中的菌大量死亡，且在生長后期，菌體會發(fā)生自溶現(xiàn)象。

菌株N1、N2 2種自生固氮菌的生長特征相似（圖4（b）），在12 ～ 48 h生長快速，進入對數(shù)期，48 h后進入穩(wěn)定期，96 h達到生長的最大值，隨后開始下降。2種固氮菌在12 ～ 48 h的生長曲線陡峭，細菌繁殖快，菌體濃度變化快。在48 h之后進入穩(wěn)定期，48 ～ 96 h曲線平坦，細菌繁殖弱，菌液濃度幾乎沒有變化。

2.5 解磷固氮能力分析

圖5為各菌株的解磷固氮能力變化曲線圖。如圖5（a）所示，試驗初期發(fā)酵液中的可溶磷質量濃度比較低，隨著培養(yǎng)時間的延長，可溶磷質量濃度變化趨勢為先上升后下降。菌株P1在120 h達到了最大值，最大質量濃度為93.53 mg/L，144 ?h后可溶磷質量濃度開始下降；菌株P2在整個培養(yǎng)區(qū)間內的溶磷量最小，維持在3.46 ～ 23.25 mg/L，隨著培養(yǎng)時間的延長，其曲線變化不明顯，解磷能力表現(xiàn)出先增長后下降，最后趨于穩(wěn)定的趨勢，并于第120 h達到最大值23.25 mg/L。菌株P3在168 h內的溶磷量較大（28.26 ～ 126.46 mg/L），隨著培養(yǎng)時間的延長，菌株P3的解磷能力表現(xiàn)出先增長后下降、最后趨于穩(wěn)定的趨勢，并于第96 h達到最大值126.46 mg/L，表明該菌株在培養(yǎng)的前96 h內解磷能力越來越強，而后期可能由于碳源等營養(yǎng)物質的耗竭，以及菌體生長繁殖受到抑制等，使解磷能力有所下降。對比菌株P1、P2和P3的解磷能力可以發(fā)現(xiàn)，菌株P3的解磷能力最強，且P1、P2和P3達到最大解磷量的時間也有所不同。

如圖5（b）所示，菌株N1和N2在168 h內氮的增加量大，N1和N2的固氮能力變化曲線趨勢大體一致，固氮能力維持在11.53 ～ 28.33 mg/L和15.49 ～ 32.39 mg/L，均表現(xiàn)出較強的固氮能力。隨著培養(yǎng)時間的延長，2種自生固氮菌的氮增加量表現(xiàn)出先增長后下降，而后趨于穩(wěn)定的趨勢，第96 h達到最大值28.33 mg/L和32.39 mg/L。在培養(yǎng)的前96 h內固氮能力逐漸增強，由于碳源等營養(yǎng)物質的耗竭、菌體生長繁殖受到抑制等使固氮能力有所降低。對比菌株N1和N2的固氮能力可以發(fā)現(xiàn)，菌株N2的固氮能力更強。

3 討論

本實驗選擇市場上的生物有機肥，篩選得到的解磷菌有芽孢桿菌、根瘤菌。運用磷鉬藍比色法測量溶磷量，以磷酸鈣作為磷源。已有研究表明芽孢桿菌屬經過分離鑒定具有較高的溶磷量，包括枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌等菌種。這些實驗研究成果可應用于促進植物的生長發(fā)育[15-18]。本研究中，菌株P1最高解磷量為93.53 mg/L，菌株P3最高解磷量為126.46 mg/L，兩者均為芽孢桿菌屬。吳海燕等[19]從貧磷黑土中篩選的巨大芽孢桿菌，培養(yǎng)到第4 d時，其解磷量可達到420 mg/L。方春玉等[20]從活性污泥中篩選的巨大芽孢桿菌，溶磷量可達到33.72 mg/L。程園園[18]研究發(fā)現(xiàn)CYY-9蠟樣芽孢桿菌在研究的8株菌株中，溶磷效果最強，溶磷量達470 μg/mL。王倩如等[21]研究了17株能分解無機磷的菌株，其中ZNRS的蠟樣芽孢桿菌溶磷效果最好，溶磷量為94.79 μg/mL。菌株P2為根瘤菌，最高解磷量為23.25 mg/L。杜雷等[22]從蔬菜大棚農作物根際中篩選出溶磷量為443.11 mg/L的根瘤菌。說明了同種微生物的溶磷效果不能歸因于微生物本身，可能與微生物所處的環(huán)境不同，同時也可能因為解磷機制不一樣。本研究對菌株P1、P2、P3的生存環(huán)境和解磷機制還需要進一步深入研究。

自生固氮菌以自身的固氮機制將空氣中的單質氮轉化成植物可以利用的氮素。篩選出來的自生固氮菌有芽孢桿菌屬、根瘤菌屬。運用凱氏定氮法測量固氮量，其中菌株N1為芽孢桿菌，最高固氮量為28.33 mg/L；菌株N2為根瘤菌，最高固氮量為32.39 mg/L。欒敏[23]培養(yǎng)出的自生固氮菌，發(fā)現(xiàn)紅色紅球菌R6和蕓苔葉桿菌MR4的固氮量，分別達到了2.7 mg/L和4.0 mg/L，實驗表明2種菌都能促進黃瓜根系生長，增加黃瓜總根長，提高黃瓜植株生物量。萇豹[3]發(fā)現(xiàn)解磷菌、解鉀菌、固氮菌制備的復合菌肥可使每千克土壤中的有效磷含量、有效鉀含量和總氮含量分別上升至113.37 mg、367.61 mg、731.46 mg，分別比使用單一解磷菌、解鉀菌、固氮菌制備的菌肥提高了14.2%、10.9%、11.1%。固氮能力強的固氮菌也能夠活化土壤中鉀鹽與磷鹽，促進農作物生長，對環(huán)境與經濟的作用具有可持續(xù)性。成艷紅等[24]篩選出來的自生固氮菌增加了花生和玉米地里氮元素的積累，其植物氮元素的含量與氮肥實驗處理的氮含量無明顯差異。可將菌株N2作為優(yōu)勢菌種進一步優(yōu)化，得到高效的自生固氮菌。根據(jù)前人研究，自生固氮菌相較于共生固氮菌的固氮能力較弱[25]，但自生固氮菌分布廣且適應能力強，即使在營養(yǎng)匱乏的土壤中也能生存并進行固氮。因此，篩選出高效的自生固氮菌對農業(yè)發(fā)展具有極大潛力。

4 結論

從市場購買的生物有機肥料中篩選和鑒定出一株解磷能力為126.46 mg/L的芽孢桿菌和一株固氮能力為32.39 mg/L的根瘤菌。所篩菌株均可利用葡萄糖作為碳源，但不能利用衛(wèi)茅糖和三梨醇作為碳源。固氮菌和解磷菌的生長曲線在48 h左右達到穩(wěn)定期，細菌數(shù)量開始趨于穩(wěn)定；在108 h左右，由于營養(yǎng)物質減少，細菌死亡速率大于繁殖速率，開始進入衰退期。

本實驗研究結果對改善土壤環(huán)境，提高植物對氮元素和磷元素的吸收和利用效率具有較大潛力，為實現(xiàn)微生物菌肥擴大生產提供更好的實驗依據(jù)。

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Screening and identification of phosphate solubilizing bacteria and

nitrogen-fixing bacteria in bioorganic fertilizers

HUANG Ting， DANG Junjie， CHEN Hongman， YAO Libo， DENG Dongmei*，

LI Liuhong， CHEN Longbao

（School of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University of Science and Technology， Liuzhou

545006， China）

Abstract： High efficient phosphorus solubilizing and free-living nitrogen fixing bacteria were screened from bio-organic fertilizers. The strains were identified by morphological observation， physiological and biochemical characterization and 16S rRNA sequence determination， and the amount of phosphorus solubilization and nitrogen fixation were measured by phosphorus-molybdenum blue colorimetric method and Kjeldahl nitrogen determination， and the properties of the screened strains were initially studied. The experiments showed that the screened phosphate solubilizing bacteria were Bacillus （P1， P3）， Rhizobium （P2） and the autochthonous nitrogen fixing bacteria were Rhizobium （N1）， Bacillus （N2）. The phosphorus solubilization capacity of P1 was 93.53 mg/L， that of P2 was 23.25 mg/L and that of P3 was 126.46 mg/L. The nitrogen fixation capacity of N1 was 28.33 mg/L and that of N2 was 32.39 mg/L. Therefore， P3 and N2 can be used as the dominant strains and can be further optimized for the expansion of microbial fertilizer production.

Key words： phosphate solubilizing bacteria; nitrogen-fixing bacteria; screening; identification; phosphorus molybdenum blue colorimetry method; Kjeldahl method

（責任編輯：于艷霞）