紅芽芋及荔浦芋葉綠體基因組測序及比較分析

賈芯碧　潘饒　肖遙　羅莎　單楠　孫靜宇　汪生林　周慶紅　黃英金　朱強龍

關鍵詞：紅芽芋；荔浦芋；葉綠體基因組；SSR；SNP；系統發育分析

中圖分類號：S632.3 文獻標識碼：A

芋[Colocasia esculenta （L.） Schoott]為天南星科芋屬多年生草本植物，是我國傳統的蔬菜兼糧食作物。芋地下球莖具有很高的營養和藥用價值，富含淀粉、蛋白質、多糖、維生素和膳食纖維[1]，球莖中含有的豐富的粘液物質具有抑制癌細胞轉移，增強人體免疫力，降血糖、抗病毒等功效，其花、葉、莖均可入藥，可治口渴便秘、消癆散結等癥狀[2]，是食藥兼優的上乘佳品。芋在我國有悠久的栽培歷史，品種類型豐富多樣，其中以多子芋和魁芋最為常見。多子芋主要分布在長江流域，多為三倍體種（2n=3x=42），以子、孫芋為主要食用部分；魁芋主要分布于嶺南地區，為二倍體種（2n=2x=28），以食用碩大的母芋為主。江西鉛山紅芽芋為典型的多子芋類型，紅芽白肉，母芋近圓形，芋皮黃褐色，有少量須毛，子芋肥大，多而群生。鉛山紅芽芋因其肉質細膩，口感松滑，營養豐富而備受大眾喜愛，成為江西省名優農產品，2013 年獲批國家地理標志農產品[3-4]。廣西荔浦芋又名魁芋，白芽白肉，母芋個頭碩大，呈橢圓形，芋皮棕色，芋肉具有美麗的紫色檳榔花紋[5]。荔浦芋肉質綿甜，酥黏可口，味道芬芳，被譽為“芋中極品”，被列為廣西壯族自治區的地理標志保護產品[6]。紅芽芋喜濕怕澇，喜涼怕熱[7]，一般選用土層深厚肥沃，pH 在5.5～7.5 之間的沙質土壤，進行旱地栽培[8]；而荔浦芋喜高溫多濕的環境[9]，更適合水田種植，栽培時選用石灰性的黏質壤土較為適宜[10]，由于它們長期生長環境和栽培條件不同，可能導致2 種芋的遺傳和性狀具有顯著的差異。

葉綠體是綠色植物細胞中參與光合作用和能量代謝最重要的細胞器之一，內含特定的遺傳物質。葉綠體基因組編碼了約110～134 個基因，這些基因與光合作用、葉綠體轉錄翻譯表達及能量代謝相關。相較于核基因組，葉綠體基因組多為母系遺傳，其進化路線獨立、進化速率適中、核苷酸替換率較低、基因結構穩定，在系統研究方面易于提供物種進化信息[11]。因此，葉綠體基因組廣泛應用于植物物種鑒定及分類、系統進化、遺傳差異和多樣性分析等研究中[12]。目前，國內外鮮有關于我國特色芋種質資源葉綠體基因組測序和比較分析的研究。此外，荔浦芋和紅芽芋雖均為芋屬芋種作物，但由于倍性不同，其生物學特性存在顯著差異，二者在葉綠體基因組方面的差異并不明確。本研究以江西鉛山紅芽芋和廣西荔浦芋為實驗材料，對其葉綠體基因組進行測序、組裝、注釋和繪制物理圖譜，分析其簡單重復序列并開發多態性SSR 引物，將紅芽芋、荔浦芋與NCBI 數據庫中已公布的13 種植物的葉綠體基因組序列信息進行序列比對，對其進行葉綠體基因組基本特征的比較分析，通過遺傳多樣性滑窗分析鑒別15 種天南星亞科植物葉綠體基因序列的遺傳差異，并構建進化樹揭示芋在系統發育中的地位及其群體進化關系，為闡明我國特色多子芋和魁芋遺傳差異，芋種質資源鑒定、開發、利用以及遺傳育種奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究為比較紅芽芋（多子芋，三倍體）和荔浦芋（魁芋，二倍體）的葉綠體基因的差異，所用紅芽芋品種為贛芋1 號，是江西上饒鉛山縣的地理標志農產品；荔浦芋采自廣西壯族自治區桂林市荔浦市。同時利用30 份從全國搜集的芋核心種質資源品種（表1）對紅芽芋和荔浦芋葉綠體基因組中開發的SSR 標記進行多態性檢驗。于2021 年7 月在田間收集新鮮的葉片，立即凍存于液氮中，然后運至實驗室保存在?80 ℃冰箱中直至使用。利用CTAB 改良法提取葉片高純度基因組DNA[13]，并用瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop-2000 核酸測定儀檢測DNA 的質量和濃度，符合要求的DNA 樣品將用于后續實驗。

1.2 方法

1.2.1 基因組測序、組裝與注釋 將紅芽芋和荔浦芋的DNA 送至深圳華大基因科技有限公司進行高通量測序，其余稀釋到10 ng/μL，分裝凍存待用。利用華大基因自主開發的過濾軟件SOAPnuke 對原始數據進行過濾，過濾參數為“-n0.01 -I 20 -q 0.3 -A 0.25 -f -r -1 < fq1> -2 < fq2> -C < cleanFq1> -D -o ”。刪除匹配上adapter 序列的25%或者以上、質量值低于20 的堿基占整條read 的30%或者以上、堿基N 含量占整條read 的1%或者以上的整條read，得到無雜質的高質量數據。利用Seqtk 軟件隨機抽取獲得1 Gb 的高質量測序數據，采用SPAdes 軟件[14]中的Plasmidspades.py 腳本程序將得到的clean reads 組裝到contig 序列，用BlastN 軟件[15]將其比對到國外發表的芋的葉綠體參考基因組（NC_016753.1），構建出芋葉綠體基因組骨架。使用GapCloser 軟件對框架序列上的gap 進行填補。通過CPGAVAS2[16]和GeSeq[17]對2 種芋葉綠體基因組序列進行注釋，利用IGV 和Sequin 軟件檢查和修正注釋結果，將最終注釋的紅芽芋和荔浦芋葉綠體基因組數據提交到NCBI 的GenBank 基因組數據庫， 獲得基因編號分別為MT447084 和MT447085。最后，使用在線程序OGDRAW[18]（ https：//chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html）繪制完整的環狀葉綠體基因組圖譜。

1.2.2 簡單重復序列鑒定及標記開發 利用MISA 軟件[19]對紅芽芋和荔浦芋葉綠體基因組中簡單重復序列（SSR）進行鑒定，再利用Primer3軟件進行批量化SSR 引物設計，引物挑選標準：引物序列長度為16～24 bp，預計擴增產物片段長度為100～300 bp，TM 值為50～60 ℃，最適為55 ℃，上下游引物的TM值相差不大于3 ℃，GC%為40%～60%；SSR 多態性引物的篩選的條件為：SSR 重復單元包含2～6 個堿基重復，SSR 長度不少于18 bp，富含AT 堿基，且SSR 序列在2 種芋葉綠體基因組上存在差異，它們的側翼引物將用于后續的多態性驗證實驗。然后，利用本實驗室保存的32 份芋核心種質資源的DNA 樣品（表1）對符合篩選條件的SSR 引物進行多態性驗證。PCR 擴增反應體系為10 μL，含5 μL 2TSINGKEMaster Mix（Green）；前引物0.25 μL（10 μmol/L）；后引物0.25 μL（10 μmol/L）；0.5 μL 模板DNA；4 μL ddH2O。擴增反應采用以下循環參數：94 ℃預變性2～5 min，94 ℃變性30 s，50～68 ℃退火30 s，30～35 個循環；72 ℃延伸1～2 min，72 ℃終延伸5～10 min。擴增的PCR 產物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上檢測。使用AgNO3 染色12 min后用適量蒸餾水浸洗膠面2 次，每次20～30 s，將膠片浸于NaOH 顯影液中不斷搖勻，直至顯出條帶，并拍照記錄進行分析。

1.2.3 葉綠體基因組比較分析 為了解芋種內葉綠體基因組的遺傳多樣性，本研究利用BWA[20]、SAMtools[21]、VarsScan 等軟件挖掘紅芽芋和荔浦芋2 種類型芋葉綠體基因組中的單核苷酸多態性位點（SNP），并用SNPeff 軟件分析SNP 對基因的影響，以解析紅芽芋和荔浦芋葉綠體基因組的遺傳差異。天南星亞科植物是天南星科植物中數量最多且遺傳多樣性最高的一類植物，其中多數植物具有很高的經濟價值、觀賞價值和藥用價值。目前，NCBI 數據庫中現已收錄17 種天南星亞科植物，共13 個屬，本研究分別從以上13 個屬中隨機挑選一種代表植物參與比較分析。基于本研究中注釋的紅芽芋和荔浦芋葉綠體基因組信息和數據庫中13 個屬葉綠體基因組信息，對該15 個葉綠體基因組的基因含量和基因結構信息進行統計分析，并以紅芽芋為參照，利用DNASP6 軟件進行遺傳多樣性滑窗分析，鑒別15 種天南星科植物葉綠體基因序列的遺傳差異。

1.2.4 系統進化分析 為揭示芋屬植物在天南星亞科植物中的進化地位，本研究利用MAFFT 軟件[22]對紅芽芋、荔浦芋和13 個天南星亞科代表屬植物的葉綠體基因組進行完全比對，以澤瀉屬澤瀉（ NC_044108.1 ） 和浮萍屬浮萍（ NC_010109.1）葉綠體基因組作為外群（outgroup），基于極大似然法（ML），自舉值（bootstrap）為1000，利用MEGA 軟件構建進化樹。

2 結果與分析

2.1 紅芽芋及荔浦芋葉綠體基因組基本特征

紅芽芋和荔浦芋葉綠體基因組均為典型的環狀雙鏈四分體結構，全長分別為162 478 bp 和162453 bp（圖1），2 種芋葉綠體基因組全長僅相差25 bp。紅芽芋和荔浦芋均包括1 個小的單拷貝片段（SSC），長度分別為22 072 bp 和22 187 bp，1 個大的單拷貝片段（LSC，89 808 bp 和89 718 bp）和1 對反向重復序列（IRa 和IRb，25 299 bp 和25 274 bp）（圖1）。由此可見，其中SSC 片段長度在2 種芋中差異最大，IR 片段的差異最小。

2 種芋葉綠體基因組均注釋到131 個基因（表2），包括86 個蛋白編碼基因，37 個tRNA 基因和8 個rRNA 基因。其中86 個蛋白編碼基因可分為3 個大類，第一類包含29 個與自我復制相關的基因，包括編碼RNA 聚合酶的3 個亞基（大亞基、小亞基和DNA 依賴性RNA 聚合酶）；第二類包含45 個與光合作用相關的基因（ATP 合酶亞基、光系統Ⅰ的亞基、光系統Ⅱ的亞基、NADH–脫氫酶的亞基、細胞色素b/f 復合物的亞基、二磷酸核酮糖氧合酶/羧化酶亞基）；第三類包括5 個其他編碼蛋白質的基因和6 個功能未知的基因。

紅芽芋和荔浦芋葉綠體基因組中共有23 個基因含有內含子，其中只有ycf3 和clpP 含有2個內含子（表3）。對二者葉綠體基因組中所有翻譯蛋白表達的密碼子進行統計發現，亮氨酸Leu 是其中編碼率最髙的氨基酸，分別有5056 個和5050 個（表4）；半胱氨酸Cys 是編碼率最低的氨基酸，均只含606 個；二者葉綠體基因組中的密碼子用法有所不同，使用同種密碼子數量差異范圍為0～12 個。紅芽芋和荔浦芋的第三密碼子A/T 含量分別為68.09%和68.12%。

2.2 SSR 鑒定及其分子標記開發

鑒定到紅芽芋和荔浦芋葉綠體基因組中SSR數量分別為130 和124（表5）。紅芽芋SSR 序列絕大部分是單核苷酸重復序列（p1），占65.38%，二核苷酸重復序列（p2）共35 個（26.92%），三核苷酸重復序列（p3）共8 個（6.15%），四核苷酸重復序列（p4）僅2 個（1.54%）；位于編碼區僅14.62%，而大部分（85.38%）位于非編碼區（圖2）。荔浦芋SSR 序列中p1 占62.9%，p2 共35 個（28.23%），p3 共10 個（8.06%），p4 僅1 個（0.81%），其中19.35%位于編碼區，80.65%位于非編碼區（圖2）。紅芽芋葉綠體基因組中63.08%的SSR 由A/T堿基組成，而荔浦芋重復堿基中A/T 堿基占61.29%（表6）。

根據紅芽芋和荔浦芋葉綠體基因組中SSR 序列差異信息，鑒別到38 個SSR 序列在2 個材料的基因組序列之間具有多態性，在多態性SSR 序列兩端共設計出191 對SSR 引物，其中31 對符合多態性引物的篩選條件，以32 種芋試驗材料的DNA 樣品為模板進行PCR 擴增，擴增產物的電泳分析結果表明，其中12 對引物能擴增出穩定、清晰的條帶，并具有多態性（表7），每個引物在一份材料中產生0～10 個條帶（圖3），12 對引物在32 份材料中共擴增出1226 個清晰條帶，其中827 條為多態性條帶，多態性比率為67.45%。

本研究所搜集的32 份試驗材料在芋種群中具有一定代表性，利用其葉綠體基因組SSR 開發標記有助于深入研究我國芋種質資源，因此，本研究基于上述12 對引物對試驗材料的遺傳分型條帶對32 份芋核心種質資源進行了遺傳多樣性分析（圖4），結果表明遺傳距離最遠的是青島芋頭和于都大野芋，最近的是白肉毛頭芋和贛州多子芋，品種間相似性系數在0～0.971 之間，平均值為0.515。在相似性系數為0.480 處可以將供試材料分成3 組。

第Ⅰ組包括18 個品種，92.3%為多子芋品種，其中贛州1 號紅芽芋（1）、紫柄芋（10）、紫芽芋（12）、狗爪芋（13）、白肉毛芋（14）、扁母芋（19）等為多子芋類型的典型品種，子芋多、芽色艷麗、芋肉粉質，除粉紅佳人（7）、粉紅芋2 號（8）和于都大野芋（9）外，其他10 個來源于江西的品種均聚集在該組。

第Ⅱ組包括13 個品種，集中了炮彈芋（17）、泉州魁芋（21）、大香芋（28）和荔浦芋（32）四種魁芋，其中炮彈芋和泉州魁芋相似性最高，相似系數為0.936，來自廣西的欽州芋（11）、紅嘴芋（16）和荔浦芋（32）3 個品種均聚集在第Ⅱ組。

第Ⅲ組只含于都大野芋（9）一個品種，大野芋[Colocasia gigantea （Blume） Hook. f.]屬天南星科、芋屬、大野芋種，根莖倒圓錐形，直立，葉叢生，葉片卵狀心形，與本研究其他31 份芋材料有較大差異，此外，12 對SSR 引物在于都大野芋（9）上擴增出的多態性條帶位點也與其他試驗材料的較為不同。

2.3 紅芽芋與荔浦芋葉綠體基因組中單核苷酸多態性分析

為了比較紅芽芋和荔浦芋葉綠體基因組的差異，進一步了解紅芽芋和荔浦芋的遺傳多樣性，本研究對二者的葉綠體基因組進行了單核苷酸多態性分析（SNP）。共鑒別到236 個SNP 位點（圖5），其中173 個位點發生在基因間區（intergenicregion），63 個位點發生在基因編碼區，致使36個基因發生同義突變（synonymous variant），25個基因發生錯位突變（missense variant）（表8），其中，ycf2 是發生錯義突變頻率最高的基因。此外，rpl16 發生終止密碼子提前（stop gained），atpF 發生剪接區突變（splice region variant）。

2.4 芋與天南星亞科植物葉綠體基因組的分析比較

比較紅芽芋、荔浦芋及其他13 種天南星科植物葉綠體基因組發現，其葉綠體基因的結構大小及基因種類差異不大（表9）。犁頭尖的葉綠體基因組最大，為169 977 bp，普陀南星葉綠體基因組最小，為160 792 bp。紅芽芋GC 含量最高，為38.15%，獨角蓮GC 含量最低，為35.59%。一共注釋到128～132 個基因，其中最多的為獨角蓮（132 個），最少的為掌葉半夏（128 個）。編碼蛋白基因數在83～86 之間，掌葉半夏只注釋到83個編碼基因。13 種天南星亞科植物rRNA 數均為8 個。tRNA 個數在36～38 之間，大多數植物有37 個tRNA，最多的為獨角蓮（38 個）。

2.5 遺傳多樣性滑窗分析

為了明確紅芽芋、荔浦芋及其他13 種天南星科植物序列的差異程度，本研究利用DnaSP 6.0軟件計算了表9 中15 個植物葉綠體基因組的核苷酸序列遺傳多樣性Pi 值。結果表明在SSC 區基因變異程度最大，LSC 區次之，IRa 和IRb 區的基因變異程度最低（圖6），并發現trnS-trnG 和ndhF-rpl32（π>0.5）分別為SSC 區和LSC 區中最高的變異位點，這2 個區域均位于基因間區。

2.6 系統進化分析

葉綠體基因組是研究物種起源、進化演變及不同物種之間的親緣關系等方面的重要分子依據之一。本研究利用MAFFT 軟件比對分析表9 中紅芽芋和荔浦芋，以及其他13 個天南星亞科代表屬植物的葉綠體基因組，以天南星科浮萍（Lemnaminor）和澤瀉科澤瀉（Alisma plantago-aquatica）植物葉綠體基因組作為外群，利用MEGA 軟件構建進化樹，探究芋與其他天南星科植物間的系統進化關系。由圖7 可知，系統進化樹分支上的bootstrap 值均大于95，表明該樹結構對于揭示植物親緣關系的置信程度較高。從水平方向分支可知，紅芽芋、荔浦芋與皂七屬橫向距離相加最短，表明與其他13 個屬相比，芋屬與皂七屬進化分歧時間最短，親緣關系相近。其次，紅芽芋（多子芋，三倍體）和荔浦芋（魁芋，二倍體）各自分支均有一定長度，表明二者在進化過程中遺傳變量的變化程度有差異。

3 討論

高等植物葉綠體基因組通常為典型的四分結構，序列長度在120～160 kb 范圍內[23]。紅芽芋和荔浦芋葉綠體基因組結構與之相似，全長分別為162 478 bp 和162 453 bp，呈典型的環狀雙鏈四分體結構，均由1 個SSC 區，1 個LSC 區和1 對反向重復序列（IRa 和IRb）組成。在二者葉綠體基因組所有翻譯蛋白表達的密碼子中，亮氨酸Leu是編碼率最髙的氨基酸，表明芋可能富含亮氨酸重復序列結構的蛋白質，從而提高芋的天然免疫防御能力[24-25]。二者葉綠體基因組蛋白編碼基因第三密碼子均具有明顯的A/T 偏好性，進一步證明了A/T 密碼子偏好性普遍存在于高等植物的葉綠體基因組中[26]。

SSR 是以PCR 技術為核心的DNA 分子標記技術，SSR 標記能在遺傳水平上直接識別特定的基因型，在芋種質資源鑒定與分類、遺傳多樣性分析和新品種開發中具有重要作用。近年來，隨著芋的食藥同源價值被大眾認可和芋產業經濟的發展，芋特異性SSR 分子標記開發逐漸受到重視。YOU 等[27]根據芋頭轉錄組序列，開發了2858 對SSR 引物，隨機合成100 對，其中72 對可以擴增出條帶，62 對在芋頭的品種中存在多態性；CHAR等[28]使用11 對SSR 標記成功地將來自19 個國家的芋頭品種進行分類。本研究利用MISA 和Primer3 軟件對紅芽芋和荔浦芋葉綠體基因組進行SSR 鑒定及引物開發，鑒定到紅芽芋和荔浦芋葉綠體基因組分別有130 和124 個SSR，以多聚A 和多聚T 單核苷酸重復序列為主，分別為65.38%和62.9%，二者的SSR 序列主要分布在非編碼區。通過對紅芽芋和荔浦芋葉綠體基因組SSR 位點的比較分析，開發出15 對能擴增出條帶清晰、多態性豐富的SSR 引物，將為深入研究芋種質資源鑒別、遺傳多樣性分析及分子標記輔助選擇育種等提供理論依據。

葉綠體基因組是植物細胞中重要的遺傳物質之一，紅芽芋、荔浦芋的表型性狀，生長習性等方面有較大差別。為了明確2 種芋葉綠體基因組之間遺傳差異，通過對紅芽芋、荔浦芋葉綠體基因組的比較分析，發現盡管二者基因組結構相近，總基因數、編碼蛋白基因數、rRNA 數和tRNA 數均一致，但它們在系統發育進化樹上遺傳距離約為0.001 486，表明存在遺傳差異。對紅芽芋和荔浦芋葉綠體基因組中SNP 位點進行分析，共鑒別到SNP 位點236 個，63 個位點發生在基因編碼區，致使accD、matK、ndhA、ndhD、ndhF、rbcL、rpoC1、rpoC2 等25 個基因發生錯義突變。accD 基因編碼乙酰輔酶A 羧化酶的β-羧基轉移酶亞基[29]，是參與脂肪酸合成的重要調節酶之一，研究發現accD也是調節葉片生長發育的重要基因[30-31]，荔浦芋的葉片一般比紅芽芋的葉片大，accD 的變異可能促進了它們之間的葉片產生形態差異。matK 基因編碼內含子成熟酶K，主要參與RNA 轉錄內含子的剪接[32]。rpoC1 和rpoC2 基因編碼β-RNA 聚合酶，在植物授粉和性別分化的調控中發揮重要作用[33]。ndhA、ndhD、ndhF 和rbcL 是光系統中重要的調控基因，對2 種芋的光合作用具有重要作用。這些葉綠體功能基因對芋適應生態環境與生長發育過程發揮重要作用，它們的變異可能促使2 種芋的農藝性狀與生長習性存在較大差異。

通過2 種芋與13 個天南星亞科代表屬植物葉綠體基因組的比較分析， 發現trnS-trnG 和ndhF-rpl32 分別是SSC 區和LSC 區的最高變異位點，這2 個區域已經作為DNA 條形碼（DNAbarcode）被廣泛地用于禾本科[34]、葫蘆科[35]、豆科[36]植物系統進化研究中，表明這2 個高變異區域可開發為DNA barcode 用于芋植物及其近緣物種的種質資源鑒定評價、遺傳多樣性分析及群體進化關系等研究。在本研究的系統進化分析中，與其他天南星亞科代表屬相比，芋屬與皂七屬（Steudnera）親緣關系最近，該結果與CABRERA等[37]、CUSIMANO 等[38]、NAUHEIMER 等[39]對天南星科植物系統進化關系的研究結果相似，表明本研究準確分析了芋屬的系統分類位置。芋屬中紅芽芋、荔浦芋與新西蘭芋（NC016753.1）聚在同一分支上，但3 種芋之間存在一定的遺傳距離，表明我國紅芽芋、荔浦芋與新西蘭芋存在遺傳差異，體現出我國特色芋種質資源在芋屬中的獨特性與重要性，為深入研究我國芋特色種質資源群體遺傳提供了參考。