蝴蝶豆種質資源芽期耐鹽性篩選及評價

王燕茹　袁秉琛　孫郁婷　王志勇　虞道耿

關鍵詞：蝴蝶豆；相關性分析；主成分分析；隸屬函數；聚類分析

中圖分類號：S541.9 文獻標識碼：A

世界上約20%的耕地屬于鹽堿地[1]。而土壤鹽度是降低植物生產力的主要非生物脅迫之一，因此人們生產耐鹽作物的必要性顯而易見[2]。目前篩選種植耐鹽植物是利用鹽堿地最科學高效的方式[3]。眾所周知，植物的耐鹽強弱一般隨不同物種和不同生長階段而發生變化[4]。鹽脅迫條件下，植物最敏感的階段是芽期和苗期[5]。因而，對芽期或苗期的植物進行耐鹽測試，能從大量材料中快速有效地篩選出耐鹽種質。鹽害主要是土壤可溶性鹽分過高改變植物的細胞膜透性，使植物細胞失水，并阻礙植物進行光合作用，對植物的生長不利[6-7]，嚴重時致死。

蝴蝶豆是豆科距瓣豆屬多年生纏繞性草本，具有根深、莖細、葉大、產量高不易木質化等特點，年產鮮莖葉可達30～45 t/hm2；營養豐富，適口性好，作為青飼料可為各種家畜提供高蛋白，也可曬制成干草[8]，是優良綠肥和覆蓋植物、飼料[9]，生長管理粗放能在貧瘠的磚壤土中生長；并且它極其耐旱、耐蔭，適口性好，可固氮，能抵御葉斑病和紅蜘蛛侵害，抵制雜草入侵，具有極大的種植潛力[10-15]。目前已在草地早熟禾[16]、狗牙根[17]、豇豆[18]等多種草本、豆科植物的不同生育期開展了耐鹽性鑒定與篩選。國內外對蝴蝶豆的研究主要包括其苗期耐鹽[19]、抗旱[20]、高溫脅迫[21]等一些抗逆性研究，但都未形成可靠有效的評價體系。嚴琳玲等[19]對20 份蝴蝶豆種質材料苗期進行不同鹽濃度脅迫，將其分為2 類：耐鹽型種質和不耐鹽種質。相對于蝴蝶豆而言耐鹽性研究略有欠缺，且作為優質牧草、綠肥能夠更加廣泛地應用于生產、生活中。故此，評估現有75 份蝴蝶豆屬種質資源的耐鹽性強弱，挑選出耐鹽種質，大面積種植之后，不僅提高生產量也實現了高效利用鹽堿地的目標。

本研究以75 份蝴蝶豆屬種質為材料，鹽脅迫針對芽期做處理，記錄相關的形態，并利用隸屬函數、主成分分析、聚類分析等評價方法對蝴蝶豆屬種質萌芽期耐鹽性進行評價，得出鑒定蝴蝶豆耐鹽性的最適濃度和篩選耐鹽性的指標，并對不同評價方法所得結果進行聚類分析，最終挑選出耐鹽性較強的材料。為開發耐鹽優異的蝴蝶豆資源和培育耐鹽性強的新品種提供材料和理論支持，為前人研究進行補充。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用75 份蝴蝶豆種質由國家熱帶牧草種質資源中期（備份）庫提供。包括CIAT 國外引進的資源和國內野外收集的資源，共1 屬3 種75 份（表1）。

1.2 方法

1.2.1 鹽脅迫濃度確定 從所有距瓣豆屬種質資源材料中隨機選取7 份，挑選均勻、飽滿、健康的種子。采用培養濾紙法。鹽（NaCl）濃度為：0、50、100、150、200、250 mmol/L，以50 mmol/L為梯度設置。每濃度處理3 個重復，每重復種子30 粒。種子用75%酒精浸泡15 min，再用10%的過氧化氫浸泡30 s 殺菌、消毒，再用清水清洗，打破種子休眠，待用。將種子均勻地置于90 mm的培養皿中，每處理添加10 mL 對應的鹽溶液，放入培養箱中進行恒溫培養（25 ℃，16 h 光照，8 h 黑暗，光強4000 lx）。每天記錄種子發芽數，第6 天發芽停止，結束試驗，測量其發芽率、發芽勢、根長、芽長等。發芽標準：胚根長≥種子長度的1/2。

1.2.2 芽期耐鹽種質篩選 確定適宜篩選濃度150 mmol/L，處理組加入10 mL 該濃度鹽溶液，對照組加入等量的蒸餾水，每種質3 個重復，每個重復50 粒。種子處理方法同1.2.1，并測量相關指標：

發芽率=發芽的種子數/供試種子數×100%

發芽勢=6 d 發芽的種子數/供試種子數×100%

發芽指數=Σ 每天發芽數/供試種子數

根冠比=根長/芽長

相對值=鹽處理測定值/對照處理測定值

1.3 數據處理

采用Excel 和IBM SPSS 軟件對所測數據進行處理和分析。計算每項指標的隸屬函數值和平均隸屬函數值，參考張會麗等[22]的方法；計算權重（W_j）和綜合得分值（Z_j），參考劉丙花等[23]和李艷輝等[24]的方法，如以下公式所示。利用系統聚類法，將所有種質分類，得到種質資源聚類圖。

2 結果與分析

2.1 篩選耐鹽種質的適宜鹽濃度

為了確定蝴蝶豆萌芽期耐鹽的適宜篩選濃度，隨機挑選7 份蝴蝶豆種質在不同鹽濃度下進行處理。由表2、表3，圖1 可知，當鹽濃度為0～100 mmol/L 時，各組材料間的發芽勢和發芽率大多在50%以上，相比差異均不顯著；鹽濃度為200～250 mmol/L 時，多組材料的發芽勢均低于40%，發芽率均低于30%，且個別組的材料表現未發芽，由此可見鹽濃度越高對種子萌發影響力越大甚至導致其死亡；但鹽濃度在150 mmol/L時，各組材料的發芽勢、發芽率均值為50%的約占1/2，這說明各種質在此濃度下表現差異顯著，可有效區分各種質的耐鹽差異性。因此，本研究借助發芽勢、發芽率的顯著差異性確定了蝴蝶豆耐鹽種質的適宜篩選濃度為150 mmol/L 的鹽溶液。

2.2 鹽脅迫下蝴蝶豆種子萌發的影響

在150 mmol/L 鹽脅迫下，75 份蝴蝶豆種質發芽指標中相對根冠比變異系數最大，為67.75%（表4）。這表明所測蝴蝶豆耐鹽性相對根冠比變異比較豐富，存在較大差異，可以作為蝴蝶豆耐鹽性評價指標。各種質的發芽率和發芽勢集中在50%左右，根長和芽長小于15 mm 的種質分別占30%和50%（圖2），說明鹽脅迫對蝴蝶豆的發芽指標相對于根長、芽長來說影響較小，鹽脅迫嚴重抑制了蝴蝶豆根和芽的生長發育。

2.3 鹽脅迫下各指標的相關性分析

鹽脅迫下，對各指標進行相關性分析（表5）表明，蝴蝶豆與發芽率、發芽勢相關的任意2 個發芽指標之間均呈極顯著正相關（P<0.01），其中發芽率與發芽勢的相關系數最大，為0.992，發芽指數和相對發芽指數相關系數最小，為0.344。而芽長和根冠比以及相對值之間呈極顯著負相關（P<0.01），且相關系數表示芽長與根冠比之間關系密切，系數最大，為?0.609，說明芽長越長根冠比、相對根冠比就越小，反之則越大。鹽脅迫下蝴蝶豆萌芽期各指標間均存在著不同程度的相關性，因此可選擇主要指標來評價蝴蝶豆種質的耐鹽性。

2.4 主成分分析

在對蝴蝶豆所有發芽指標進行標準化后，再進行主成分分析，并根據每個成分的特征值和貢獻率提取主成分（表6）。其中有4 個特征值大于1 的成分，因此將這4 個成分作為主成分，其特征值分別為5.20、2.99、2.06、1.39，方差貢獻率為37.12%、21.37%、14.72%和9.95%。這4 個主成分累積方差貢獻率達83.17%，超過了80%，說明因子的提取效果很好，涵蓋了所有指標的大部分信息，整體歸納性好、綜合反應性強，可將其作為蝴蝶豆耐鹽種質評價篩選的綜合指標。

由各主成分載荷矩陣（表7）可知，唯一對第一主成分產生負向影響的是根冠比且影響不大，其數值為?0.026，其余指標均對第一主成分產生正向影響。其中，影響最大的是發芽指數、發芽率、發芽勢、相對發芽勢，數值分別為0.872、0.865、0.855、0.789，說明發芽指數、發芽率、相對發芽指數及相對發芽勢對第一主成分起主要正向影響作用。

對第二主成分產生正向影響的指標有發芽指數、發芽率、發芽勢、鮮重、相對芽長、芽長、相對鮮重、根冠比，其余指標對第二主成分產生負向影響。其中，相對芽長、芽長起主要正向影響較大，數值分別為0.786、0.709；根長、相對根冠比、相對根長起主要負向影響，數值分別為?0.464、?0.835、?0.552；發芽指數、發芽率、發芽勢、相對發芽指數對第二主成分影響不大。

第三主成分負向指標：相對發芽勢、相對發芽指數、相對發芽率、芽長，其載荷值分別為?0.528、?0.613、?0.639、?0.018，其余均為第三主成分正向指標。其中，根長、相對根冠比、相對根長、根冠比對第三主成分起主要正向影響，數值為0.479、0.342、0.521、0.339；而相對發芽勢、相對發芽指數、相對發芽率起主要負向影響；芽長對第三主成分影響可忽略不計。

第四主成分影響因素中鮮重、相對鮮重可忽略不計，負向影響因素有發芽指數、發芽率、發芽勢、芽長，其余均為正向指標。其中，相對發芽勢、相對發芽率、相對芽長、根冠比對第三主成分起主要正向影響，數值為0.300、0.333、0.444、0.662；而發芽指數、發芽率、發芽勢、根長起主要負向影響。

2.5 蝴蝶豆耐鹽性綜合評價

對75 份蝴蝶豆種質耐鹽性進行綜合評價，將綜合得分值和平均隸屬函數值（ASF）作為評價耐鹽性強弱的標準，綜合得分值和ASF 值越大，表明其耐鹽性就越強，反之則越弱。首先將蝴蝶豆發芽指標原始數據標準化后，借助公式（5）計算綜合得分（Z=0.37Z1+0.21Z2+0.14Z3+0.09Z4）進行排序（表8）。綜合得分值為?0.745～2.003，跨度范圍大也表明各種質間耐鹽性差異較大。排名前十的耐鹽種質為：69＞2＞4＞12＞49＞1＞21＞6＞20＞18，排名后十的敏鹽種質為：57＜55＜63＜45＜52＜54＜65＜30＜70＜73。這2 種評價方法都表達了蝴蝶豆的耐鹽差異性較大。

然后對平均隸屬函數值進行排序（表8），平均隸屬函數值（不超過1）范圍在0.14～0.61 之間，其值跨度范圍大表明各種質間耐鹽性差異較大。綜合排名前十的種質為：59>67>12>20>2>4>1>69>75>49，綜合排名后十的種質為：45＜63＜65＜30＜48＜31＜15＜57＜51＜55。用這2 種綜合評價方法來評價蝴蝶豆的耐鹽性，表明不同評價方法對75 份蝴蝶豆種質耐鹽強弱的排名稍有不同，但大體差異不大，耐鹽材料和敏鹽材料的篩選結果基本一致。

2.6 聚類分析

綜合得分值（Z）其包括信息全面，因此對蝴蝶豆耐鹽綜合得分值進行最遠距離系統聚類分析，在歐式距離為4 處可將75 份蝴蝶豆種質分為四大類（圖3）。第1 類為極耐鹽種質，編號69單獨分為一類；第2 類為耐鹽種質，包括編號2、4、12、49、1、21、6、20、18、13、5、23、28、7、39、46、34 共17 份；第3 類為低耐鹽種質，編號52、65、54、63、45、57、55 共7 份種質；第4 類編號29、10、59 等50 份材料為敏鹽種質。

3 討論

我國土壤鹽漬化形勢日益嚴峻，目前，最為經濟、有效利用鹽漬土的途徑是種植耐鹽植物對土壤進行生物改良[25]。蝴蝶豆在國內外作為優質飼料[26]和綠肥覆蓋物[10-11]，其種質資源數量龐大、質量優異，遺傳變異種類豐富多樣，為開展蝴蝶豆種質資源的研究和創新提供重要材料基礎。因此，系統性評價和利用耐鹽性強的蝴蝶豆種質資源，對蝴蝶豆品種的選育具有重要的現實意義。本研究首先對7 份蝴蝶豆種質萌芽期在6個不同鹽濃度下的研究發現，150 mmol/L 鹽溶液脅迫下，蝴蝶豆表現出較大的耐鹽性差異，因此確定該濃度為最適宜篩選濃度，與張紅梅等[18]在豇豆耐鹽性研究方面的結果一致。然后在150 mmol/L 濃度下，綜合評價75 份蝴蝶豆屬種質材料的耐鹽性，研究表明，鹽處理材料與對照相比，各種質的開始發芽時間普遍延遲了約1 d，該現象與田蕾等[27]對粳稻進行鹽脅迫過程的表現一致，說明鹽脅迫對植物芽期影響嚴重。

變異系數變化值較大的性狀指標更能反映出材料間的耐鹽性差異[28]。研究中，蝴蝶豆種質發芽指標中相對根冠比變異系數最大（67.75%），表明所測蝴蝶豆耐鹽性相對根冠比變異比較豐富，存在較大差異，因此可作為蝴蝶豆耐鹽性評價指標。通過相關性分析和主成分分析發現，發芽指數、相對根冠比、相對發芽率和根冠比這4 個指標與主成分關系最為密切，完全囊括了變異分析的信息，且包括蝴蝶豆耐鹽特性的大部分信息，因此將這4 個指標作為耐鹽評價指標。田蕾等[27]發現水稻芽期評價指標為發芽指數、相對根長和相對鹽害率；孫璐等[29]確定根長、鮮重和發芽率作為鑒定高粱耐鹽性指標。由此可以看出，發芽指數、根長、發芽率差異變化較大，可作為耐鹽評價指標。研究發現，蝴蝶豆種質的根長和芽長均在25 mm 以下，且15 mm 左右的占比最大，發芽率和發芽勢普遍在50%左右，由此可知，相對于種質發芽，胚根和胚芽的生長對NaCl 脅迫更為敏感，這與羅小燕等[30]對山螞蝗的研究、楊林[31]對豆科牧草的研究結果一致，根長、芽長受鹽脅迫影響最大。

相關性分析結果表明，蝴蝶豆在鹽脅迫下，萌芽期各類指標間有不同程度的關聯性，這與前人研究結果一致[32]，發芽率與發芽勢相關任意2個指標間呈現極顯著正相關（P<0.01），胚芽長和相對根冠比、根冠比相互之間呈極顯著負相關（P<0.01）。本研究使用的各類指標對蝴蝶豆耐鹽性綜合評價貢獻率不同，因此，要精確得出蝴蝶豆的耐鹽性，應有更多的指標進行研究，再進行綜合分析，這樣才能全面反映蝴蝶豆種質耐鹽性強弱。

本研究對綜合得分進行聚類分析，將75 份蝴蝶豆屬種質分為四大類，編號69 為第1 類極耐鹽種質；第2 類為耐鹽種質（編號2、4、12、49、1、21、6、20、18、13、5、23、28、7、39、46、34 共17 份）；第3 類為低耐鹽種質（編號52、65、54、63、45、57、55 共7 份種質）；第4 類為敏鹽種質（編號29、10、59 等50 份）。編號69 的蝴蝶豆種質通過平均隸屬函數分析，得出其數值0.542，排名第8，綜合分析得分2.003，排名第1，2 種評價體系下綜合表現優異，最耐鹽。但由于不同生長階段，植物的耐鹽性有一定的差異，所以萌芽期篩選出的耐鹽種質能在苗期有何種表現需進一步驗證。

4 結論

本研究通過不同鹽濃度梯度篩選出最適濃度為150 mmol/L，在該濃度處理下測定75 份蝴蝶豆種質萌芽期相關耐鹽指標，通過相關性分析、主成分分析、聚類分析對75 份蝴蝶豆種質耐鹽性進行綜合評價，確定蝴蝶豆耐鹽評價指標是發芽指數、相對根冠比、相對發芽率和根冠比，結果表明，050321057 蝴蝶豆（編號69）在參試種質材料中表現出極其耐鹽性。為蝴蝶豆耐鹽性研究和選育耐鹽品種提供理論支撐。