南藥巴戟天脫毒苗的培育與快繁體系的優化

陳子恩　馮 沖　羅振華　劉夢云 丁平

關鍵詞：巴戟天；脫毒；快繁；直接器官發生；病毒檢測

中圖分類號：R285 文獻標識碼：A

巴戟天（Morinda officinalis How）為茜草科巴戟天屬植物，多年生藤本，其干燥根入藥，是我國的“四大南藥”之一，具有補肝腎、強筋骨的作用[1]。其主產于廣東、福建等地，在我國主要通過扦插繁殖，病毒通過植物的無性繁殖在植物體內傳遞及積累，最終造成植物生長受到抑制、產量及品質下降[2-3]，因此，加強對巴戟天組織培養技術的研究具有十分重要的意義。本課題組在前期研究中對花葉病巴戟天進行病原鑒定，確定該病原為黃瓜花葉病毒-巴戟天株（Cucumbermosaic virus isolate Morinda officinalis How，CMVMO）[4]。目前，對于防治病毒病害沒有特別有效的防治藥物，脫除病毒是提高植物產量和品質最有效的方法，張曉麗等[5]發現脫毒苗在生長過程中各方面指標如形態指標、生理特性均優于非脫毒苗，且產量也會顯著提高。常見的脫病毒方法包括低溫脫毒、溫熱脫毒、利用組織培養技術脫毒、化學脫毒等[6]。其中，利用組織培養技術脫除植物病毒簡便、易行，目前使用該技術進行植物脫毒的有半夏（Pinellia ternata）、大蒜（Allium sativum）、姜（Zingiber officinale Rosc.）等[7-9]。因此，加強對巴戟天組織培養技術的研究具有十分重要的意義。

通過器官發生途徑進行組織培養是藥用植物組織培養的主要方式，指一定條件下通過誘導外植體產生不定芽等器官，經過擴繁、誘導生根、煉苗移栽等步驟發育成為完整植株。器官發生途徑有2 種，根據組織培養過程中是否需要誘導愈傷組織，又分為直接器官發生途徑和間接器官發生途徑[10]。目前巴戟天的組織培養技術主要通過間接器官發生途徑，即利用巴戟天外植體誘導出愈傷組織，通過愈傷組織誘導不定芽從而獲得巴戟天的組培苗，這種組織培養方法存在許多問題，例如培養時間比較長，培養基配方繁多，繁殖系數低，増殖困難，繼代生長周期長，缺少建立經濟效率高、成本低的標準化生產體系等。與其相比，直接器官發生途徑不需經過愈傷組織階段，周期更短，且期間發生的變異少，能很好地保留植株的遺傳特異性，特別適用于需要維持遺傳穩定性的道地藥材種苗的培育[11-13]。利用直接器官發生途徑建立巴戟天組織培養技術體系的研究迄今鮮有報道。故本研究選用組織培養技術以獲得巴戟天的脫毒苗，通過直接器官發生途徑，以巴戟天莖段材料直接誘導生芽，建立巴戟天的組織培養技術體系的快速繁殖方法，為巴戟天種苗的工廠化生產提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

巴戟天小葉黑蕊型植株與大葉型植株均收集自廣東省德慶縣，移栽至華南植物園種質資源圃。經廣州中醫藥大學丁平研究員鑒定為茜草科植物巴戟天的植株。

1.2 方法

1.2.1 外植體的消毒接種 取兩年生的巴戟天樣品，將其莖分為3 部分，距離頂端20 cm 以內為幼嫩莖段，距離頂端20～40 cm 處為半木質化莖段，距離頂端超過40 cm 的部位為完全木質化莖段。切除葉片后置于超凈工作臺中，用75%酒精棉片，擦拭其表面，將巴戟天莖段切成帶有節位的長度約為2～3 cm 的小段，為了篩選出巴戟天的最佳消毒部位和消毒方法，將其使用0.1%氯化汞將巴戟天幼嫩、半木質化及木質化莖段分別消毒5.5 ～8.0 min，無菌水漂洗3 次。處理后，于無菌條件下接種至1/2 MS 培養基上，于接種后第2 天開始記錄污染數。20 d 后統計污染率和成活率（污染率=污染苗數/接種苗數100%，成活率=成活苗數/接種苗數100%）。

1.2.2 腋芽的誘導分化 將消毒處理后的巴戟天莖段分為幼嫩部位、半木質部位、全木質化部位，分別接種于含不同濃度及組合植物生長調節劑的培養基中。培養30 d 后觀察結果，記錄腋芽誘導率以及腋芽誘導狀況，篩選出誘導腋芽的最適部位與最適培養基（腋芽誘導率=產生腋芽的外植體數/接入外植體總數100%）。

1.2.3 叢生芽的增殖培養 將培養30 d，誘導出的腋芽從莖段上切下，接種于不同類型培養基中，接種20 個外植體，培養30 d 后觀察結果。記錄叢生芽誘導率以及叢生芽生長狀況（叢生芽誘導率=產生叢生芽的腋芽數/接入腋芽總數100%）。

1.2.4 組培苗的生根與移栽 （1）生根培養。將培養30 d，誘導出1.5 cm 左右高的叢生芽苗轉接到不同類型的生根培養基中，每瓶3～4 個芽苗，共轉接4 瓶。在培養室中培養30 d 后，統計其生根率和根系生長狀況（生根率=生根的單苗數/接種單苗總數100%）。（2）煉苗與移栽。當組培苗根系長度大于2 cm 后，將完成生根的組培苗連組培瓶移出培養室，保持溫度20～25 ℃、相對濕度60%左右，閉蓋置于室溫自然光條件下放置3 d，然后打開瓶口，自然光下煉苗5 d 或8 d。將煉苗結束的巴戟天組培苗從組培瓶中移出，使用清水洗凈根部殘留的培養基，將根部浸泡于稀釋的多菌靈溶液中5 min，再用流水沖洗4 min。處理后移栽至4 種不同栽培基質的育苗杯中，每1～2 d 噴施1 次水，30 d 后記錄移栽存活率（移栽存活率=成活苗數/移栽總苗數100%）。

1.2.5 組培苗與移栽苗的病毒檢測 以脫毒組培苗與移栽苗為試驗組，田間感病巴戟天為陽性對照組，取各組幼嫩葉片各0.1 g 提取總RNA 后進行反轉錄，利用設計的3 對特異引物進行RT-PCR檢測。反應體系為2×Pfu Master Mix 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，ddH2O 6 μL，cDNA模板2 μL，PCR反應程序為94 ℃ 1 min 30 s，94 ℃20 s，50～60 ℃ 20 s，72 ℃ 60 s，30 個循環，72 ℃5 min 得到最終樣品。PCR 產物用瓊脂糖凝膠電泳進行觀察。

1.3 數據處理

試驗數據采用SPSS 20.0 軟件進行單因素方差分析（ANOVA）。

2 結果與分析

2.1 不同消毒處理對莖段消毒效果的影響

不同消毒處理對巴戟天莖段的污染率及成活率均有一定的影響。隨氯化汞消毒時間的延長，幼嫩莖段的污染率及成活率成反比，而半木質和全木質莖段的污染率和成活率均逐漸下降（表1）。對于巴戟天幼嫩莖段，消毒8 min 的污染率最低，且成活率在4 組中最高，達到35.12%，因此消毒8 min 為巴戟天幼嫩莖段消毒的優選方法。對于半木質莖段，消毒5.5 min 的成活率最高，接種21個外植體成活10 個，成活率達47.62%，但是污染率偏高，達到47.62%；0.1%氯化汞消毒8 min的污染率最低，只有38.33%，但是成活率也最低，只有30.00%，綜合考慮污染率及成活率2 個指標，最終選定0.1%氯化汞溶液消毒6 min 為巴戟天半木質化莖段消毒的優選方法。對于巴戟天的全木質化莖段，消毒8 min 的污染率最低，消毒5.5 min的成活率最高，綜合考慮污染率及成活率2 個指標，最終選定0.1%氯化汞溶液消毒6 min 為巴戟天全木質化莖段消毒的優選方法。綜上，雖然消毒時間組內之間沒有顯著差異，但比較3 個部位巴戟天的消毒效果，半木質部位污染率較低，成活率較高，優選其為巴戟天組織培養的外植體部位。

2.2 不同部位莖段對腋芽誘導能力的影響

比較巴戟天不同部位莖段的平均腋芽誘導數及腋芽生長狀況，結果如表2 所示。巴戟天的半木質化莖段平均腋芽誘導數大，生長較快，平均腋芽誘導數為1.90 個，一個生長點可見多個腋芽，與幼嫩部位及全木質化部位差異顯著（P< 0.05）。幼嫩部位的平均腋芽誘導數低于半木質化部位，高于木質化部位，半木質化部位的平均腋芽誘導數最低，每個生長點僅長一個腋芽。因此最終篩選巴戟天半木質化莖段可作為巴戟天組織培養的理想材料來源。

2.3 不同類型培養基對腋芽誘導能力的影響

比較半木質化巴戟天莖段在3 種不同類型培養基中的腋芽誘導率及其生長狀況，結果顯示組間并沒有明顯差異（表3，圖1）。以巴戟天半木質化莖段為外植體，接種于含有6-BA 0.2 mg/L的1/2 MS 培養基中，莖段的節點處長出腋芽，腋芽生長狀況良好（圖1A），巴戟天半木質化莖段誘導腋芽在MS 培養基中生長狀況不佳，芽苗瘦弱（圖1B），在含有6-BA 0.2 mg/L 的MS 培養基中誘導腋芽出現透明玻璃化現象（圖1C）。

2.4 不同類型培養基對叢生芽誘導能力的影響

以1/2 MS 培養基為基礎培養基，利用不同濃度配比的6-BA 與NAA 篩選出適合誘導巴戟天莖段叢生芽的培養基。對巴戟天莖段叢生芽在不同類型培養基中生長狀況進行統計，結果如表4 和圖2 所示。6-BA 0.2 mg/L 的1/2 MS 培養基叢生芽誘導率達到83.33%，叢生芽生長狀況良好，葉片呈現深綠色；當6-BA 的濃度升高到0.5 mg/L 時，叢生芽的誘導率反而下降到46.67%，與另外2 組有顯著差異性，叢生芽生長緩慢，葉片蜷縮并且出現玻璃化現象；在0.5 mg/L 6-BA 的基礎上再添加0.2 mg/L 的NAA，叢生芽的誘導率有所上升，可達73.33%，叢生芽的生長狀況有所改善，但是部分叢生芽葉片玻璃化的現象仍然存在。

2.5 不同生根培養基對巴戟天生根的影響

分別以1/2 N6、N6、1/2 MS 為基礎培養基，添加不同濃度配比的IBA，篩選出適合巴戟天芽苗生根的培養條件。統計巴戟天芽苗移入不同類型培養基的誘導生根率及生根情況，結果見表5 和圖3。巴戟天芽苗在添加0.5 mg/L IBA 的1/2 N6及添加1.0 mg/L IBA 的N6 培養基中，未出現生根現象，且巴戟天芽苗在N6 培養基中生長狀況較差，出現葉子掉落，萎黃的情況，說明N6 培養基并不適合巴戟天芽苗生根；而在添加不同濃度IBA 的1/2 MS 培養基中均可生根，但在IBA濃度超過1.0 mg/L 的1/2 MS 培養基中出現氣生根現象。

2.6 不同類型基質對組培苗煉苗移栽的影響

待巴戟天芽苗在瓶中長至4～5 cm 后，從組培室移至室外煉苗5 d 或8 d 后移栽至含有不同類型基質的育苗杯，統計移栽苗的存活率（表6）。就煉苗時間而言，經過8 d 煉苗時間的移栽苗存活率明顯高于5 d 組。幾種基質中，當煉苗5 d 時，草炭土與珍珠巖比例1∶1 的組培苗成活率最高，達到88.90%；當煉苗時間為8 d 時，草炭土比珍珠巖1∶1 和草炭土比蛭石1∶1 這2 種基質的成活率最高，均為93.33%。因此最佳基質為草炭土比珍珠巖1∶1 和草炭土比蛭石1∶1。

2.7 巴戟天組培苗與移栽苗脫毒效果評價

利用RT-PCR 方法檢測巴戟天脫毒苗與田間感病巴戟天的病毒情況，結果如圖4A 所示，根據黃瓜花葉病毒-巴戟天株（Cucumber mosaic virusisolate M. officinalis How， CMVMO）設計的3 對引物均可對黃瓜花葉病毒-巴戟天株進行檢測，第二對引物CMVMO2 的特異性最佳。與陽性對照相比，巴戟天組培苗與移栽苗均未檢測出特異性高亮度條帶，說明該組織培養體系所誘導的巴戟天脫毒苗可成功脫除CMVMO 病毒（圖4B）。

3 討論

近年來關于巴戟天組織培養技術的報道有很多，且選擇的培養方式不盡相同。其中陳煌等[14]以巴戟天莖尖或莖節段為試驗材料，成功建立了一套巴戟天優質種苗快速繁育應用的組培技術體系。林美珍等[15]以巴戟天幼胚為外植體誘導愈傷組織，再由愈傷組織分化成完整植株，并誘導出多倍體巴戟天。巴戟天是廣東的道地藥材，必須要保持巴戟天的品種特性，因此本研究選用直接器官發生途徑建立巴戟天組織培養體系，本方法不經過愈傷組織階段，具有極強的遺傳穩定性。

研究表明，利用巴戟天不同部位莖段作外植體，對其消毒效果也會有所不同。使用相同的消毒處理方法，半木質化莖段的污染率較低，成活率相對較高，若巴戟天莖段太幼嫩會對氯化汞不耐受，從而降低成活率，而全木質化莖段污染的主要來源為真菌污染，主要表現為培養基上生長白色的霉菌。巴戟天表面被有絨毛，容易帶有真菌及細菌且不易消除，其中以全木質化莖段表面最為粗糙，是其污染率較高的主要原因。另外，選擇不同部位莖段作為外植體，其腋芽的發生情況也不相同，莖段不同取材部位誘導腋芽能力由強到弱依次為半木質部位、幼嫩部位、全木質部位。以巴戟天莖段為材料誘導腋芽，數量多，基數大，增殖快，容易誘導成功，能為巴戟天種苗的工廠化生產提供研究基礎。該結果與黃寧珍等[16]、陳偉等[17]的結果一致。本研究以巴戟天莖段為材料誘導腋芽，并進一步增殖，其誘導最適培養基為添加6-BA 0.2 mg/L 的1/2 MS 培養基。巴戟天常規的外植體材料包括葉片及莖段等，分化能力較差，叢生芽誘導率較低。本研究以巴戟天半木質化莖段誘導出的腋芽為材料，其分化能力較強，為理想的巴戟天叢生芽誘導來源。以莖段誘導的腋芽為外植體，接種于添加6-BA 0.2 mg/L的1/2 MS 培養基上（與誘導莖段腋芽的培養基相同），叢生芽的誘導率達到86.36%。巴戟天移栽到疏松透氣、偏酸性的土壤可提高其移栽成活率，故選用偏酸性的材料作為培養基質[14]。草炭土中富含有機質，質地松軟，呈微酸性，但其缺乏保水性。珍珠巖和蛭石在農業育苗中均有改善土壤、增加土壤透氣性、保水保濕等作用。但由于二者保水效果好，過度添加反而導致基質中水分過多，使植株死亡。農業上巴戟天種植通常使用紅土[18]，但紅土黏性較大，透氣性差，土質偏重，不能和珍珠巖很好地混合，易導致根系腐爛。因此，在巴戟天組培苗移栽初期，最好選擇草炭土與珍珠巖或蛭石混合使用，既保水又有透氣性。

研究結果還表明，選用1/2 MS 培養基作為基礎培養基，其生根效果要比選用N6 培養基的好，這與肖祖飛等[19]對樟樹、張琨等[20]對黃花菜、劉丹等[21]對附子的研究結果一致，且巴戟天芽苗在N6 培養基中生長狀況較差，出現葉子掉落，萎黃的情況，推測為N6 培養基中大量元素含量較低導致。此外，本研究還通過RT-PCR 的方法檢測巴戟天脫毒苗中黃瓜花葉病毒-巴戟天株（CMVMO），結果發現巴戟天脫毒苗已徹底脫除病毒，近年來，組織培養技術已廣泛應用于對中草藥脫毒培養[22]。因此，本研究認為通過組織培養技術可以實現巴戟天的脫毒培養與快繁，為巴戟天種苗的脫毒快繁與工廠化生產提供參考。

由于本研究主要針對農家品種巴戟天大葉型巴戟天與小葉黑蕊型巴戟天，使得本研究結果不一定適用于其他品種巴戟天，有一定的局限性。但利用本研究結果，可為農家品種巴戟天的脫毒快繁技術在生產上的運用提供參考，為巴戟天的種質資源保護、脫毒擴繁、品種改良等提供理論依據。

4 結論

本研究以巴戟天莖段為材料，經75%乙醇預處理后的莖段用0.1%氯化汞溶液消毒5.5 min 為巴戟天莖段消毒的優選方法；以巴戟天半木質部位作為外植體接種的腋芽誘導能力最強；巴戟天莖段誘導腋芽的最適培養基為添加0.2 mg/L6-BA 激素的1/2 MS 培養基；巴戟天莖段誘導叢生芽的最適培養基為添加0.2 mg/L 6-BA 激素的1/2 MS 培養基；誘導巴戟天芽苗生根的最佳培養基為添加0.5 mg/L IBA 激素的1/2 MS 培養基；巴戟天組培苗的最適移栽基質為草炭土∶珍珠巖1∶1 和草炭土∶蛭石1∶1 的基質。通過組織培養技術可以實現巴戟天的脫毒培養與快繁。