淮山藥零余子60Co-γ輻射的誘變效應

胡泊　賓麗慧　容敏堅　黃學華　胡永杏　古彪

關鍵詞：淮山藥；零余子；60Co-γ 輻射；誘變效應；M1 代單株選擇

中圖分類號：S632.1 文獻標識碼：A

淮山藥，屬薯蕷科（Dioscoreaceae）薯蕷屬（Dioscorea L.）一年生或多年生纏繞性藤本塊莖類植物，在我國已有2500 年以上的栽培歷史。淮山藥品種資源豐富，20 世紀60—70 年代植物資源調查發現，我國有薯蕷科植物1 屬6 組約49種[1-2]。通常，南方習慣稱之為淮山，北方則稱之為山藥。有學者從植物生態學角度提出，我國淮山藥品種大體上分為北方型品種和南方型品種兩大生態類型[3]，并指出它們之間主要在植物學性狀、適應性、品質、產量、抗逆性等方面均存在較大差異。淮山藥塊莖主要含淀粉，不同淮山藥種類的塊莖大小差異很大，小的與馬鈴薯一般，大的長度可超過2.5 m，重達7.5 kg[4]。形狀各異，有球狀、圓柱狀、橢圓、扁平等，有單胞的，也有多胞的；塊莖有不分枝的，也有分枝的。目前生產上的淮山藥品種多為塊莖長條形、單胞、不分枝品種，其他類型的應用較少。淮山藥是集醫藥、養生、保健、食用、飼用于一體的高效率經濟作物[5]，甚至可以代糧，發展潛力巨大，產業前景廣闊。

輻射誘變育種是利用物理誘變因素如γ 射線等，誘發植物性狀產生遺傳變異，獲得有利用價值的突變體，從而選育出新品種或新種質資源的育種方法[6]。1969 年，聯合國糧農組織（FAO）與國際原子能機構（IABA）聯合出版發行了《突變育種手冊（Manual on Mutation Breeding）》，這被認為是植物輻射誘變育種從初期基礎研究到實際應用轉折的標志[7]。與常規育種相比，輻射誘變育種有提高基因突變率、打破性狀連鎖和促進基因重組、克服植物自交不親和性、促進遠緣雜交結實等潛在優勢，是一種較為簡單、能夠穩定變異且具有高繁殖效率等優勢的育種手段[8]，較傳統育種高效、快速，較轉基因育種更為經濟，是產生新品種的主要手段之一。進入20 世紀70年代，輻射誘變育種已經成為一種有效的育種手段并得到了迅速發展，在水稻、小麥、玉米、豆類、果樹等品種選育中取得了大量成果。相對而言，馬鈴薯、甘薯、淮山藥等薯類作物輻射育種研究較少。尤其是淮山藥育種，在有限的育種實踐中方法手段比較單一，目前主要以種質收集、自然變異單株系統選育和引種為主[9-10]。利用輻射人工創造淮山藥變異的育種方法，迄今僅見劉艷芝等[11]對北方型淮山藥品種進行誘變處理的報道。

本試驗以南方生態型淮山藥品種桂淮5 號零余子為材料，開展60Co-γ 輻射誘變效應研究，在有效劑量范圍內，分別采用40、60、80、100 Gy劑量梯度對試驗材料進行輻射處理，通過田間試驗對經輻射處理的零余子M1 代發芽率、植株生長發育、結薯形態特征等研究分析，并圍繞育種目標對變異單株進行選擇，以便探討淮山藥零余子60Co-γ 輻射誘變性狀變異的效應，測試明確桂淮5 號零余子輻射的半致死劑量、臨界劑量，獲取具有性狀表現差異的輻射M1 代單株，探討淮山藥輻射育種的可行性，并為后繼的品種、品系選育提供基礎材料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為南方生態型本地淮山藥品種桂淮5 號零余子，來自廣西桂平市淮山藥種植戶，2020年11 月采收。所用零余子經人工檢選，大小均勻、飽滿，表面色澤較一致、無傷損、無病蟲害，平均粒重為8.3 g。

1.2 方法

1.2.1 輻射劑量范圍的測試 劉艷芝等[11]關于淮山藥零余子有效輻射劑量，以及史瑋[12]關于馬鈴薯、張建斌等[13]關于香蕉60Co-γ 輻射誘變的相關研究資料，所采用的輻射劑量相互之間懸殊較大。為了測試找到適合桂淮5 號淮山藥零余子的有效劑量范圍，減少盲目性，提高工作效率，本研究在正式試驗前做了一個較大劑量梯級、較寬劑量范圍的預備試驗。預備試驗具體做法：采用輻射劑量分別為30、60、90、120、150、180 Gy，劑量率為1.0 Gy/min，對試驗材料零余子進行60Co-γ 射線輻射處理，以未經輻射的為對照，共7個處理。每個處理零余子100 顆，不設重復。輻照處理后當天，將各處理的零余子單層排放到墊有多層濕紙巾的托盤上，表面覆蓋單層濕紙巾，置于溫度28 ℃、濕度80%的培養箱進行催芽。每天觀察記錄一次萌芽（露白）情況，連續5 d 不再增加萌芽視為萌芽終止，統計各處理發芽數、發芽率，結果如表1。

預備試驗結果只做定性判斷不做差異顯著性分析。結果表明，輻射劑量≥120 Gy 的各處理催芽期內均沒有萌芽，可視為達到或超過致死劑量；而輻射劑量30 Gy 時，發芽率不降反升，高于對照8 個百分點，其原因可能與適當劑量輻射對零余子萌發的生理生化過程具有正面效應有關，需要進一步研究，但至少說明該劑量及低于該劑量沒有對受試零余子產生明顯脅迫損傷和誘變效應。因此，可以判斷≤30 Gy、≥120 Gy 對誘變而言無實際意義，在正式試驗時可以將其排除。

1.2.2 零余子輻射處理 根據預備試驗測試結果，本試驗采用40 ～100 Gy 作為適用劑量范圍，設置了4 個輻射劑量梯度處理，以未經輻射的為對照，共5 個處理。60Co-γ 射線輻照處理于2021年4 月21 日由廣西南翔環保有限公司輻照中心（廣西深圳輻照公司）施行，輻射劑量分別為40、60、80、100 Gy，劑量率為1.0 Gy/min。每個處理零余子數為300 顆。

1.2.3 輻射處理零余子的田間種植 經輻射處理后的零余子，于2021 年4 月22 日播種于廣西農業科學院蔬菜研究所試驗基地設施種植大棚。大棚四面通透，棚頂透光不透雨；棚長30 m，寬10 m；地塊土壤條件良好，土層深度約25 cm，裝備水肥一體化滴灌設施。深耕耙碎后起壟，壟高約30 cm，壟間距1.6 m。每處理設3 個重復，每個重復種植零余子100 顆。株、行距為20 cm20 cm，雙行種植。

1.2.4 田間調查 從種植后第5 天起，每隔5 d觀察一次發芽出苗情況，以發芽露出地面1～3 cm肉眼明顯可見為準，記錄各處理的出苗數，并對已計數的苗作標記。連續5 d 不再出現苗數增加，視為出苗終止，統計各處理出苗總數、發芽勢、發芽率、相對發芽率。發芽勢＝最高峰時的發芽數/播種數100%；發芽率=發芽數/播種數100%；相對發芽率＝處理發芽率/對照發芽率100%。收獲時，計數株數、結薯數；觀測薯形、單株胞數、塊莖分枝；測量薯長、圓徑，平均單薯重，測定各處理總產薯重量；將入選單株單獨標記收藏，以便M2 代種成株行觀察目標性狀的遺傳性和進行株系選育；單株選擇余下的其他材料，以處理為單位混合收藏，M2 代以處理為單位種成混合小區繼續觀察選擇。

1.3 數據處理

應用SPSS 25.0 和Excel 軟件對數據進行方差及回歸分析。

2 結果與分析

2.1 不同輻射劑量處理對淮山藥零余子發芽率的影響

田間調查結果顯示：對照的淮山藥零余子發芽率為86.0%；Gy40 處理的發芽率為92.7%，比對照高，相對發芽率為107.8%；此外，60～100 Gy各處理的發芽率均比對照低，且在此劑量范圍內，輻射劑量越高，發芽率越低。60 Gy 處理的發芽率為59.7%，相對發芽率為69.4%；80 Gy 處理的發芽率為28.7%，相對發芽率為33.4%；100 Gy處理的發芽率為4%，相對發芽率為4.7%。差異性統計分析顯示，除40 Gy 處理的發芽率高于對照且達顯著水平外，60～100 Gy 各處理與對照之間及其相互間的發芽率，均隨劑量的提高而下降，且達到極顯著水平（表2）。在一定劑量范圍內，60Co-γ 射線對淮山藥品種桂淮5 號零余子發芽具有明顯的抑制、損害作用，劑量越高抑制、損害作用越大，零余子發芽率越低。

但是，40 Gy 處理的發芽率與本試驗另外3個劑量處理的結果完全不同，比對照處理不降反升，且差異顯著，說明適當較低劑量的60Co-γ 照射可能對淮山藥零余子的萌發有促進作用，有待進一步研究。

2.2 半致死劑量和臨界劑量的確定

使用Excel 軟件，以輻射劑量0（CK）、40、60、80、100 Gy 及其對應發芽率為基礎，擬合一元線性回歸方程y=bx+a，并利用“回歸－線性”參數求算決定系數（R2），以檢驗方程的擬合優度。其中，y 為零余子發芽率，x 為輻射劑量；y=50%時的x 值即為半致死劑量（LD50）；y＝40%時的x值為臨界劑量（LD40）。據此，一元線性回歸方程為y=?0.8776x+103.37；決定系數達到0.8008，差異極顯著。當y=50 時，可得出x=60.8；當y=40時，可得出x=72.2。即在本研究條件下，淮山藥品種桂淮5 號零余子誘變的適宜輻照劑量范圍為60.8～72.2 Gy，輻射的半致死劑量為60.8 Gy、臨界劑量為72.2 Gy（圖1）。

2.3 各輻射劑量處理對淮山藥零余子發芽勢的影響

經輻射處理的淮山藥零余子發芽明顯滯后，而且這種趨勢隨著輻射劑量的增加而遞增，其中60 Gy 和80 Gy 處理比對照出苗初始期推遲滯后10 d，100 Gy 的滯后15 d。從發芽勢也可看出，隨著劑量的遞增，發芽勢急劇下降（表3）。

由表3 可以看出，盡管40 Gy 輻射處理在15 d時發芽數比10 d 時增加103 個，達到高峰值，即發芽勢為42.7%，低于CK 的64%，但其后5 d發芽數仍達到102 個，形成一個非常接近第一個高峰期的次高峰期，發芽率增至76.7%。因此，40 Gy 輻射處理對淮山藥零余子發芽勢的脅迫、損傷效應，不同于另外3 個劑量的處理，未表現為負效應。

2.4 不同輻射劑量處理對淮山藥零余子既有芽生長發育成熟的影響

為了更直觀地分清輻照處理對萌芽階段及其后續苗期生長發育成熟階段的影響，本研究引入了既有芽成活率的概念，即某處理收獲時的實得株數/該處理的既有芽數100%=既有芽成活率。由表4 可以看出，40、60、80、100 Gy 處理的既有芽成活率分別為89.6%、77.1%、82%和75%，均明顯低于對照，說明60Co-γ 輻射對淮山藥零余子的損傷不僅作用于萌芽階段，抑制萌發，形成弱苗，而且對整個生長期造成了延續影響，植株長勢相對較差，對整個苗期生長均有明顯負向效應。田間觀察也發現黃化葉、白化葉現象以及畸形、嵌合體、叢生植株等。因此，與發芽率一樣，各輻射處理的實收總株數、塊莖數均比對照發生較大幅度減少，且隨著劑量的加大，減少的幅度明顯增大。但比較而言，輻照對既有芽成活率的不利效應要比其對發芽率的不利效應要小得多。比如，100 Gy 處理的發芽率僅為4.7%，而其既有芽的成活率為75%。因此，輻照主要是抑制了零余子發芽，對既有芽的生長也有影響，但要小得多（表4）。

2.5 不同劑量處理對淮山藥M1 代結薯特性及塊莖性狀的影響

2.5.1 對塊莖形狀及重量的影響 與對照相比，不同輻射劑量處理的塊莖長度、直徑、重量均有所增加，并隨著輻照劑量的增加表現先升后降再升的趨勢。40、80、100 Gy 劑量處理的塊莖長度、直徑、重量均較CK 的增加，且均達到顯著以上水平；60 Gy 處理比CK 的增加幅度較小，但除薯長外，薯莖、薯重也達到顯著水平（表5）。40 Gy處理的薯長、薯徑、薯重均比對照有較大幅度增加，分別增加了38.9%、31.3%、73.8%；而60 Gy處理比CK 的增加幅度小，是各輻射劑量對薯長、薯徑、薯重影響效應最小的處理。60 Gy 處理的這種效應似乎間斷了隨著輻射劑量的提高薯長、薯徑、薯重相應比CK 增加的趨勢。以單薯重為例，40 Gy 處理的單薯重為0.73 kg，比對照增加了73.8%；60 Gy 處理的塊莖重為0.59 kg，比對照增加了40.5%，盡管比對照仍明顯增重，但沒有持續40 Gy 處理的增幅；80 Gy 的塊莖重為0.67kg，比對照增加了59.5%，持續了60 Gy 處理增長趨勢，比60 Gy 處理的大，但仍然比40 Gy 處理的小。說明至少在數理統計上，40 Gy 輻照處理表現出的性狀表征具有特殊性，與其他3 個處理表現不盡相同，是否在效應因果關系上有差別需要進一步研究加以厘清甄別。另外，100 Gy 處理的塊莖重為1.8 kg，比對照增加了328.6%（圖2）。該變異的原因和機理值得更深入的研究，是否遺傳需要進一步開展多世代觀察。

2.5.2 對發生雙胞薯及次生蘆頭現象的效應 雙胞率表示由一個淮山藥零余子長成的單株有2 個或多個成薯的株數占該處理總株數的百分數。本試驗的對照桂淮5 號為單胞品種，試驗結果也均為一株結一個塊莖，但經輻射的4 個處理均不同程度地出現了雙胞結薯現象。同時，在一個單株中除正常結薯的蘆頭外，還出現了2 個甚至多個沒有結成塊莖的蘆頭，本文稱之為次生蘆頭，以對應區別于正常結薯的蘆頭。次生蘆頭的出現同樣隨著劑量的增加而增加，但輻射劑量越高次生蘆頭成薯的概率越低。40 Gy 處理無次生蘆頭出現，有2 個分別出現結2 個塊莖的單株，即雙胞株，占該處理收獲株數的0.8%；60 Gy 處理16株出現次生蘆頭，其中11 株為雙胞株（含1 個3胞株），占該處理收獲株數的8%，是雙胞株率最高的處理；80 Gy 處理有13 株長有次生蘆頭，其中4 個雙胞株，占5.6%；100 Gy 處理全部9 個單株均為長有次生蘆頭的單株，其中1 個為雙胞株，占比為11.1%（表6）。

2.5.3 對塊莖分枝特性的影響 淮山藥品種桂淮5 號的塊莖為長圓柱形，無分枝。塊莖雙（多）分枝率是指由一個蘆頭長成的塊莖出現2 個（多個）分枝的塊莖數占該處理總塊莖數的百分數。在60 ～100 Gy 之間，隨著輻射劑量增加，分枝的趨勢愈明顯。40 Gy 處理僅出現2 個分枝的塊莖1個；60 Gy 處理出現3 個分枝的塊莖2 個，4 個、6 個分枝的塊莖各1 個；80 Gy 處理出現3 個分枝的塊莖3 個，4 個分枝的塊莖1 個；100 Gy 處理的單株塊莖則全部發生了分枝，其中2 個分枝的3 個，3 個以上分枝的7 個，最多的1 個塊莖分枝數達到10 個（表6、表7）。

3 討論

3.1 淮山藥品種桂淮5 號零余子60Co-γ 輻射誘變的半致死劑量和臨界劑量

本研究經相關性分析得到零余子的發芽率與60Co-γ 輻射劑量之間的相關回歸方程為： y=?0.8776x+103.37；決定系數為0.8008，達極顯著差異。這說明在一定劑量范圍內，淮山藥品種桂淮5 號零余子的發芽率、發芽勢與輻射劑量之間呈高度負相關，隨著60Co-γ 輻射劑量的增加，淮山藥零余子的發芽會被抑制和延遲。

桂淮5 號零余子60Co-γ 輻射的半致死劑量為60.8 Gy，臨界劑量為72.2 Gy。因此，對淮山藥品種桂淮5 號零余子進行誘變處理的適宜輻照劑量范圍為60.8～72.2 Gy。不同植物、不同品種、相同品種的不同器官、相同器官的不同部位、不同生長時期，由于結構和生理生化特性等的差異，對60Co-γ 輻射的敏感性和耐受程度不同，需要通過試驗才能確定合適的處理劑量。

本研究得到的淮山藥桂淮5 號零余子的輻射半致死劑量與劉艷芝等[11]報道的結果差別較大。在該研究中， 嘉祥細毛長山藥零余子LD₅₀=18 964.8 Rad ， 濟寧米山藥零余子LD₅₀=23 588.0 Rad ， 牛腿山藥零余子LD₅₀=23 369.2 Rad，鐵棍山藥零余子LD₅₀=20 153.8 Rad（Gy 與Rad 的換算關系是1 Gy=100 Rad）[8]。據此，這些淮山藥品種的LD50 為189.6～235.9 Gy，遠大于桂淮5 號的60.8 Gy。這可能與所采用的輻射劑量率、淮山藥品種及其生態類型等不同有關。

3.2 40 Gy 輻射處理對淮山藥零余子M1 群體萌芽及生長發育可能具有促進作用

在有效輻射劑量的下限附近，即本試驗中的40 Gy 處理，與對照相比，其淮山藥零余子相對發芽率顯著上升，而且對M1 代塊莖的長、徑、重的增加效應也表現出較明顯的生長促進效應，薯長、粗、重均有較大幅度增加，表明此輻射強度對淮山藥零余子萌芽及生長發育有促進作用。這種正面效應具有實際應用價值，零余子可以作為繁殖材料，提高繁殖系數，在淮山藥品種提純復壯乃至大田生產中提供更高效的技術路徑，值得進一步研究。

3.3 輻照處理誘導零余子M1 代雙胞結薯、次生蘆頭、塊莖叢生分枝的變異

本研究中，在有效輻射劑量范圍內，輻射使淮山藥M1 代產生不同程度的雙胞結薯、次生蘆頭和塊莖分枝現象。這些均應同屬于植物學意義上的莖芽分生。尤其是在60 Gy 處理中獲得了8.0%的雙胞結薯率，這是一個特別值得關注的誘變效應。雙胞結薯符合小型薯早熟密植豐產輕簡化栽培的育種目標要求，能有效解決當前淮山藥主推品種塊莖過長、種收勞動力成本過高的難題。而且，覃維治等[14]研究表明，結薯數是影響淮山藥產量的因素之一，對產量提高有一定的作用，在淮山藥育種中，應選擇結薯數適中的品種。

另外，在可耐受輻射劑量的上限附近，即本研究中的100 Gy 處理，零余子發芽率僅為4％，可被視為致死極限輻射劑量，卻誘發了該處理全部塊莖出現多個分枝甚至分枝叢生現象，薯形由長柱形變異為不規則塊狀，且其平均單薯重達到了1.80 kg。叢生芽變異在其他作物的誘變育種中也較常見，多被視為不良性狀，沒有選擇意義。但對以塊莖為經濟產量的淮山藥等作物來說，地下塊莖分枝、叢生，長成塊狀塊莖，在某種程度上，比如對提高產量而言，一旦這種變異是可遺傳的，就可能成為具有應用價值的優良性狀。張明玉等[15]就曾提出，淮山藥生產應該走“應用塊狀品種，起壟輕簡栽培”的發展方向。

3.4 從零余子輻射處理的M1 代可以選擇獲得具有明顯變異的單株

本研究從零余子輻射處理的M1 代共篩選獲得了18 個雙胞結薯、11 個大型薯和1 個開雌花等表現差異明顯的單株，這些變異單株形成的生理基礎、誘變機理值得深入研究，其遺傳性有待在M2 代等后繼世代繼續研究觀察。