不同麻醉預處理對腎臟缺血再灌注損傷模型的腎臟保護作用及分子機制研究

叢建軍，付冬冬

1.吉林省通化市人民醫院麻醉科，吉林通化 134001；2.河南省新鄉市中心醫院風濕免疫科，河南新鄉 453000

臨床上出現腎臟缺血再灌注損傷的現象不斷增多，嚴重影響患者的生命和生活質量[1]。因此，在手術麻醉或者鎮靜過程中選擇對腎臟缺血再灌注損傷具有一定保護作用的藥物顯得尤為重要。丙泊酚是麻醉及ICU 常用的鎮靜藥物，已有研究報道該麻醉藥物具有減輕多種臟器的缺血再灌注損傷作用[2]。瑞芬太尼作為μ 阿片類受體激動劑，劑量可控，安全可靠，對肝腎功能無損害，成為肝腎功能不全需要進行腎移植的理想麻醉藥物[3]。七氟醚是目前臨床常用的吸入麻醉藥，具有誘導快、刺激性低的優點，且有利于術后麻醉的恢復，減輕心、腦、肝、肺等器官缺血再灌注損傷的作用已得到廣泛認可[4]。目前對于上述3 種麻醉藥物對腎臟缺血再灌注損傷的保護作用之間的比較以及作用機制鮮有報道。本研究于2019年1—6 月吉林省通化市人民醫院，以60 只SD 大鼠為研究對象，建立腎臟缺血再灌注損傷模型，分析研究丙泊酚、瑞芬太尼、七氟醚對腎臟缺血再灌注損傷的保護及其分子作用機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 研究選擇60 只雄性健康SD 大鼠，均為SPF 級，體質量（245.4±2.5）g；周齡（13.2±0.6）周；適應性飼養1 周（室溫25℃、相對濕度40%～60%）。該實驗所涉及的動物管理、使用以及相關操作均已通過動物倫理委員會（Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC）批準并嚴格遵循實驗動物使用的3R 原則給予人道主義關懷。

1.1.2 主要試劑與儀器 丙泊酚注射液（國藥準字J20080023；規格：20 mL∶0.2 g×5 支）、鹽酸瑞芬太尼注射劑（國藥準字H20143314；規格：2 mg∕支）、吸入用七氟烷（國藥準字A000030209；規格：10 mL 溶液劑 支）、ELISA 試劑盒（貨號:M1000B）、免疫組化試劑盒（貨號:98-9943）、TUNEL 試劑盒（貨號:ab66110）、兔抗大鼠多克隆p-ULK1 及兔抗大鼠單克隆p-AMPK、p-mTOR、Caspase-3（貨號: sc-56053）。

1.2 方法

1.2.1 分組處理及模型建立 采用隨機數字表方法將60 只SPF 級大鼠分為6 組:正常組（NC 組），假手術組（Sham 組）、缺血∕再灌注組（I∕R 組）、丙泊酚組（Pro 組）、瑞芬太尼組（Rem 組）和七氟醚組（Sev組），10 只∕組。I∕R 組、Pro 組、Rem 組及Sev 組根據相關文獻建立腎臟缺血再灌注損傷模型。分組處理:術前所有大鼠需要禁食12 h，自由飲水。NC組、Sham 組及I∕R 組在模型建立前均給予生理鹽水。Pro 組、Rem 組及Sev 組在手術前給予相應藥物麻醉處理，其中Pro 組采用微量泵給予尾靜脈輸注丙泊酚[按照1.0 mg∕（kg·min）]，時間30 min；Rem 組以微量泵給予尾靜脈輸注瑞芬太尼[按照2.0 μg∕（kg·min）]，時間30 min。Pro 組、Rem 組模型制備前30 min 至再灌注后30 min 持續泵注給藥。Sev 組在模型制備前30 min 吸入2.8%七氟醚和氧氣的混合氣體至再灌注30 min，氣體監測儀測定大鼠呼出的七氟醚濃度。

模型建立:Sham 組經2.0%戊巴比妥鈉（按照40 mg∕kg 給藥）麻醉后開腹，游離出左右腎蒂，45 min關腹。I∕R 組、Pro 組、Rem 組及Sev 組經2.0%戊巴比妥鈉（按照40 mg∕kg 給藥）麻醉后，將兩側腎蒂游離，無創夾閉45 min 使得腎臟血流被阻斷，模型復制成功標準:腎臟自暗紫色變為紅色。

1.2.2 生化指標檢測 大鼠處死前腹主動脈穿刺采血，冰上靜置1.5 h 后，1 500 rpm×10 min 分離獲取血清并置于-40℃冰箱中保存備用。大鼠腎功能指標包括尿素氮（BUN）、肌酐（Cr），應用TC6030全自動生化分析儀檢測；炎癥因子指標包括白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-8（IL-8），應用酶聯免疫吸附法檢測。采用亞硝酸法測定超氧化物氣化酶（SOD）含量、硫代巴比妥酸法測定丙二醛（MDA）水平。

1.2.3 腎組織病理學及相關指標檢測 再灌注24 h，采用2.0%戊巴比妥鈉（按照40 mg∕kg 給藥）麻醉后處死大鼠，分離取得腎實質，分別行免疫組化（SP法）檢測自噬標志性蛋白（Beclin-1、LC3-Ⅱ），采用Quantity One 圖像處理系統分析細胞凋亡情況，透射電鏡檢測自噬小體，蛋白免疫印跡法（Western blotting）檢測腎組織自噬標志物。

1.3 觀察指標

觀察比較各組尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，Cr）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素-8（Interleukin-8，IL-8）、超氧化物氣化酶（superoxide gasification，SOD），丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平、細胞凋亡情況，腎組織自噬相關蛋白的表達。

1.4 統計方法

采用SPSS 22.0 統計學軟件處理數據，符合正態分布的計量資料以（±s）表示，組間差異比較以t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同組別生化指標檢測結果對比

研究顯示，I∕R 組BUN、Cr、IL-1β、IL-8、SOD、MDA 與NC 組、Sham 組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。Pro 組、Rem 組及Sev 組BUN、Cr、IL-1β、SOD與I∕R 組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。Sev 組BUN、Cr、MDA，與Pro 組、Rem 組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 不同組別生化指標檢測結果比較(±s)

表1 不同組別生化指標檢測結果比較(±s)

注：與NC 組比較，*P＜0.05；與Sham 組比較，#P＜0.05；與I∕R 組比較，▲P＜0.05；與Pro 組比較，△P＜0.05；與Rem 組比較，★P＜0.05

組別NC 組（n=10）Sham 組（n=10）I∕R 組（n=10）Pro 組（n=10）Rem 組（n=10）Sev 組（n=10）BUN（mmol∕L）6.23±0.69 6.85±0.81（24.18±2.91）*#（12.63±1.42）▲（16.25±1.85）▲△（8.60±1.54）▲△★Cr（μmol∕L）45.89±5.44 46.21±6.02（97.55±9.80）*#（78.93±7.89）▲（82.26±7.15）▲（68.22±7.08）▲△★IL-1β（mmol∕L）12.57±2.08 12.91±1.97（26.14±2.84）*#（17.76±2.33）▲（17.28±2.41）▲（16.92±2.28）▲IL-8（mmol∕L）8.65±1.43 8.76±1.50（10.59±1.83）*#9.97±1.96 10.11±1.82 9.88±1.79 SOD（U∕mg）14.26±2.05 13.21±1.88（6.24±1.64）*#（10.63±1.73）▲（10.22±1.80）▲（11.06±1.92）▲MDA（μmol∕g）1.39±0.45 1.42±0.50（4.73±0.79）*#4.16±0.72（3.70±0.64）▲（2.61±0.63）▲△★

2.2 免疫組化檢測Beclin-1、LC3-Ⅱ表達對比

I∕R 組Beclin-1、LC3-Ⅱ水平，高于NC 組、Sham組，差異有統計學意義（P＜0.05）；Pro 組Beclin-1、LC3-Ⅱ水平，與I∕R 組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；Rem 組、Sev 組Beclin-1 水平，高于I∕R 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。Sev 組Beclin-1、LC3-Ⅱ水平，高于Pro 組、Rem 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 不同組別Beclin-1、LC3-Ⅱ表達水平結果比較(±s)

表2 不同組別Beclin-1、LC3-Ⅱ表達水平結果比較(±s)

注：與NC 組比較，*P＜0.05；與Sham 組比較，#P＜0.05；與I∕R 組比較，▲P＜0.05；與Pro 組比較，△P＜0.05；與Rem 組比較，★P＜0.05

蛋白名稱Beclin-1 LC3-ⅡNC 組（n=10）0.198±0.067 0.232±0.072 Sham 組（n=10）0.214±0.058 0.258±0.061 I∕R 組（n=10）（0.392±0.078）*#（0.417±0.086）*#Pro 組（n=10）0.401±0.084 0.433±0.092 Rem 組（n=10）（0.609±0.102）▲0.442±0.101 Sev 組（n=10）（0.779±0.093）▲△★（0.859±0.090）▲△★

2.3 TUNEL 腎小管上皮細胞凋亡檢測結果對比

TUNEL 檢測試劑盒分析結果顯示，I∕R 組AI（0.714±0.063），高于NC 組（0.209±0.072）、Sham 組（0.226±0.065），差異有統計學意義（P＜0.05）。Sev組AI（0.311±0.078）、Pro 組AI（0.496±0.081）、Rem 組AI（0.445±0.072），低于I∕R 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。Sev 組AI 水平，低于Pro 組、Rem 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 自噬小體檢測結果對比

顯微投射電鏡觀察顯示，I∕R 組自噬小體數量（12.40±2.07），高于NC組（6.00±1.41）、Sham 組（6.20±1.30），差異有統計學意義（P＜0.05）。Sev 組自噬小體數量（24.60±5.73）高于I∕R 組，差異有統計學意義（P＜0.05），而Pro 組自噬小體數量（15.00±3.39）、Rem 組自噬小體數量（14.60±4.16），與I∕R 組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。Sev 組自噬小體數量，高于Pro組、Rem組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.5 pULK1、pAMPK、pmTOR 及Caspase-3 蛋白表達情況對比

研究顯示，I∕R 組pAMPK、pULK1、pmTOR 及Caspase-3 均高于NC 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。Pro 組、Rem 組及Sev 組pmTOR 及Caspase-3低于I∕R 組，而pULK1 高于I∕R 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。Sev 組pAMPK、pULK1 高于Pro 組、Rem 組，而pmTOR 低于Pro 組、Rem 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 不同組別pULK1、pAMPK、pmTOR 及Caspase-3 蛋白表達結果比較(±s)

表3 不同組別pULK1、pAMPK、pmTOR 及Caspase-3 蛋白表達結果比較(±s)

注：與NC 組比較，*P＜0.05；與Sham 組比較，#P＜0.05；與I∕R 組比較，▲P＜0.05；與Pro 組比較，△P＜0.05；與Rem 組比較，★P＜0.05

蛋白名稱pAMPK pULK1 pmTOR Caspase-3 NC 組（n=10）0.132±0.041 0.254±0.062 0.292±0.059 0.304±0.048 Sham 組（n=10）0.146±0.049 0.369±0.070 0.301±0.067 0.325±0.052 I∕R 組（n=10）（0.294±0.062）*#（0.375±0.076）*（0.781±0.094）*#（0.849±0.086）*#Pro 組（n=10）0.301±0.064（0.632±0.089）▲（0.594±0.083）▲（0.421±0.040）▲Rem 組（n=10）0.311±0.060（0.802±0.090）▲△（0.476±0.070）▲△（0.300±0.047）▲△Sev 組（n=10）（0.621±0.098）▲△★（1.042±0.116）▲△★（0.351±0.049）▲△★（0.285±0.031）▲△

3 討論

自噬與多種疾病的發生發展密切相關[5-9]。研究顯示，自噬參與多種疾病的發生發展，如腫瘤、腦缺血等，目前也有研究發現自噬可能對腎臟缺血再灌注損傷存在保護作用[10]。本研究顯示，I∕R組BUN、Cr、IL-1β、IL-8、SOD、MDA 與NC 組、Sham組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。Pro 組、Rem組及Sev 組BUN、Cr、IL-1β、SOD 與I∕R 組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。Sev 組BUN、Cr、MDA，與Pro 組、Rem 組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），說明七氟醚降低腎功能指標（BUN、Cr）優于丙泊酚組、瑞芬太尼組，此外通過HE 染色結果顯示，七氟醚組腎臟組織細胞排列較為整齊，空泡化少見，腎小管形態較完整，提示七氟醚對腎功能保護作用優于丙泊酚、瑞芬太尼。鄒海波等[6]研究發現，與缺血組及再灌注組比較，異丙酚組的BUN（7.35±1.18）、Cr（45.15±3.35）、MDA（4.14±0.66）水平明顯降低，SOD（479.12±81.35）水平明顯增高（P＜0.05）。異丙酚可對大鼠腎臟缺血再灌注損傷產生保護作用。瑞芬太尼具有減輕氧自由基損傷，抑制細胞凋亡的作用，其作用機制與抑制Fas 表達以及降低Caspase-3 水平有關；金小雪等[7]發現瑞芬太尼通過對腎臟IR 后Fas 凋亡信號相關通路信號分子的抑制，阻斷該通路的激活。七氟醚也具有減輕氧自由基水平，抑制細胞凋亡等作用，其可能機制與促進血紅素（HO-1）基因表達有關[8]。以上提示，丙泊酚、瑞芬太尼以及七氟醚對于麻醉后大鼠具有一定的抗氧化應激作用，具體作用機制有待進一步深入研究。

本研究顯示，I∕R 組細胞凋亡明顯，Rem 組凋亡指數（AI）（0.445±0.072）低于I∕R 組（0.714±0.063）（P＜0.05）。Sev 組AI 水平（0.311±0.078）低于Pro 組（0.496±0.081）、Rem 組（0.445±0.072）（P＜0.05）。I∕R組及Sev 組自噬小體數量[（12.40±2.07），（24.60±5.73）]升高。I∕R 組pAMPK、pmTOR 及Caspase-3 分別為（0.294±0.062），（0.781±0.094），（0.849±0.086），均高于NC 組、Sham 組、Pro 組、Rem 組、Sev 組（P＜0.05）。以上提示，七氟醚對腎臟缺血再灌注損傷自噬作用優于丙泊酚、瑞芬太尼[9-11]。其中內源性途徑的重要蛋白是半胱氨酸蛋白酶家族，如Capase-3 及Caspase-9 等[12]。研究顯示，腎臟缺血再灌注時導致腎小管上皮細胞壞死性凋亡，導致Bax蛋白升高及Bcl-2 的下降，Capase-3 與凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2 存在相關性[13]。七氟醚、瑞芬太尼、丙泊酚等均具有降低Caspase-3 表達的作用。劉風藏等[14]的數據表明，腸道I∕R 誘導了明顯的氧化應激和內質網應激相關細胞凋亡，表現為腸黏膜丙二醛增加，腸黏膜SOD 減少，細胞凋亡指數和mRNA增加。

綜上所述，丙泊酚、瑞芬太尼及七氟醚均具有減輕腎臟缺血再灌注損傷的作用,其作用機制與抗氧化應激、抑制細胞凋亡有關。