哺乳動物雷帕霉素靶蛋白與結直腸癌關系的生物信息學分析

韓麗紅，陳婧茹，林麗蓉，閆斌

1.莆田學院基礎醫學院，福建莆田 351100；2.莆田學院腫瘤轉化醫學福建省高校重點實驗室，福建莆田 351100

結直腸癌的發生與飲食、遺傳、腸道炎癥、生活方式及生活環境等因素有關，但其發生機制尚未完全清楚[1]。岳芙蓉等[2]、衛星等[3]指出哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）信號通路激活后，可操控人類體內癌細胞增長與消失，由于癌細胞病變時，mTOR 信號通路常處于過度激活狀態，對癌細胞吸收養分、分裂增長、生存等一系列正常活動造成影響。顧超等[4]指出磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase, PI3K）、絲氨酸∕蘇氨酸蛋白激酶（proteinserinethreonine kinase, AKT）與mTOR 蛋白分子在腫瘤病發過程中可通過調節細胞增長、繁殖、存活等方式抑制或增強腫瘤生長速度。這與腫瘤細胞的主要生物學特性，即生長增殖失控相符。本文分析2013年5 月—2021年5 月TCGA 公共數據庫的COAD &READ 患者數據698 份，研究mTOR 在結直腸癌發病進程中的影響和發揮的作用，為該病的診療工作提供幫助。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 TCGA 數據采集

結直腸癌的原始mRNA 表達數據從癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas, TCGA）數據庫（https:∕∕portal.gdc.cancer.gov∕）下載。共收集標本698份，其中正常組51 份，腫瘤組647 份。下載基因型-組織表達（genotype-tissue expression, GTEX）數據庫，比較正常組（n=51）、GTEX（n=308）和GSE73360的結直腸癌數據表達差異。

1.2 共表達分析

為研究mTOR 基因的共表達并分析受mTOR 調控的信號通路，本研究分析了TCGA 結直腸癌患者的表達譜。以r=0.4，P=0.05 為條件篩選mTOR 表達最顯著的基因后，使用“Corrplot”和“Circlize”軟件包繪制mTOR 相關性分析的圓圖，并可視化mTOR 相關性的調控機制。

1.3 基因組變異分析

本研究從分子標記數據庫（7.0 版）下載了基因組，并使用基因組變異分析（gene set variation analysis, GSVA）算法對每個基因組進行綜合評分，以評估不同樣本中潛在的生物功能變化。

1.4 基因組富集分析

本研究使用基因組富集（gene set enrichment analysis, GSEA）分析比較高表達組和低表達組之間信號傳導途徑的差異。篩選出腫瘤患者，按照其中位值（8.040 58）將腫瘤患者分為高表達組和低表達組，高表達組409 份，低表達組289 份，以探索兩組之間結果差異的可能分子機制，排列數量設定為1 000，排列類型設定為表型[5-6]。

1.5 統計方法

采用R 語言包4.0.3 軟件對數據進行統計分析，計數資料采用例數（n）表示，計量資料經檢驗符合正態分布，采用（±s）表示。采用秩和檢驗分析數據集中的正常組織與腫瘤組織樣本mTOR 表達量之間的差異。采用ggcorrplot 和ggstatsplot 進行Spearman 相關性分析及可視化。基于Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用Log-Rank 檢驗進行顯著性分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 mTOR 在結直腸癌的mRNA 表達及KM-plot生存分析

mTOR 在結直腸癌中的具體機制未明。本研究從TCGA 數據庫下載已處理的結直腸癌原始mRNA表達數據共698 份，正常組51 份，腫瘤組647 份。結果表明，mTOR 在正常組織中表達（6.202 742±1.369 486 872），mTOR 在腫瘤組織中表達（5.401 705±2.087 202 686），mTOR 在腫瘤組織和正常組織中表達，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1A。此外，基于GSE73360 數據集分析mTOR 在組織中的表達差異，結果顯示，mTOR 在正常組織中表達（7.008 4±0.429 089 872），mTOR 在腫瘤組織中表達（8.040 58±0.784 400 233），mTOR 在腫瘤組織中表達升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1B。本研究基于mTOR 基因的表達量進行KM-plot 生存分析（納入患者生存時間需＞30 d），通過遍歷mTOR 基因的所有截點選取具有最優生存意義的截點值，結果表明，當mTOR 截點值為3.633 6 時，高風險組患者預后顯著較低風險組預后較好，見圖2。

圖1 mTOR 在結直腸癌的mRNA 表達

圖2 KM-plot 生存分析

2.2 mTOR 的共表達網絡

本研究進一步通過相關性分析探討mTOR 的共表達網絡，過濾條件為r=0.4，P＜0.05。共篩選出541個與mTOR 表達顯著相關的基因，見圖3。

圖3 與mTOR 表達顯著相關的基因

2.3 mTOR 與信號通路

GSVA 結果表明，高低表達兩組患者的差異通路主要富集到了MITOTIC_SPINDLE、G2M_CHECKPOINT 以及OXIDATIVE_PHOSPHORYLATI ON 信號通路，見圖4。

圖4 mTOR 基因涉及的信號通路

2.4 mTOR 與微衛星不穩定性、腫瘤突變負荷的關系

本研究發現，高表達mTOR 組微衛星不穩定性（microsatellite instability, MSI）為（0.346 5±0.228 324 831），低表達mTOR 組為（0.340 8±0.200 818 483）。高表達mTOR 組腫瘤突變負荷（tumor mutation burden,TMB）為（3.881 578 948±47.556 343 52），低表達mTOR 組為（3.5789 473 68±23.947 834 78）。核心基因高低表達在MSI 和TMB 方面比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 mTOR 基因高低表達間與MSI 和TMB 的關系

3 討論

mTOR 信號傳導通路與惡性腫瘤的關系越來越多地受到人們的關注。未見有相關報道關于mTOR與結直腸癌生物信息學分析研究。TCGA 數據庫下載已處理的結直腸癌的原始mRNA 表達數據共698份，mTOR 在正常組織中表達（6.202 742±1.369 486 872），mTOR 在腫瘤組織中表達（5.401 705±2.087 202 686），mTOR 在腫瘤組織和正常組織中表達，差異無統計學意義（P＞0.05）。基于GSE73360 數據集分析mTOR 在組織中的表達差異，mTOR 在正常組織中（7.008 4±0.429 089 872），mTOR 在腫瘤組織中表達（8.040 58±0.784 400 233），mTOR 在腫瘤組織中表達升高（P＜0.05）。共篩選出541 個與mTOR 表達顯著相關的基因。GSVA 結果高低表達兩組患者的差異通路主要富集到了MITOTIC_SPINDLE、G2M_CHECKPOINT 以及OXIDATIVE_PHOSPHORYLATION 信號通路。高表達mTOR 組MSI 為（0.346 5±0.228 324 831），低表達mTOR 組為（0.340 8±0.200 818 483）。高表達mTOR 組TMB 為（3.881 578 948±47.556 343 52），低表達mTOR 組為（3.578 947 368±23.947 834 78）。核心基因高低表達在MSI 和TMB 方面比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

關于mTOR 與結直腸癌發生發展的研究比較多。Wang XW 等[7]研究顯示結直腸癌細胞主要通過細胞內分裂增殖基因進行細胞復制，通過mTOR信號通路對細胞增殖基因過度刺激獲得mRNA，而后mRNA 進行大量轉錄，合成病變細胞分裂所需的蛋白質，進而提高細胞增殖速度。CyclinDI 是一種原癌基因，再加之其分裂行為不受控制，造成病變細胞內激酶活化并與受體結合進行繁殖，從而導致病變細胞激增。mTOR 信息通道合并激活后，與酸化后兩個蛋白因子進行反應，達到促進細胞增殖的作用[7-18]。周釗等[8]指出哺乳動物mTOR 是一種可直接吸收營養的激酶，并且受成長基因與外在環境影響，存在于機體內各種細胞的分裂、生長、死亡循環調節，是一種極強的黏結性因子。鐘南英等[9]指出腫瘤的并發與mTOR 激活有著密不可分的聯系，并且該通道激活與病變細胞分裂、生長、血管生成、轉移等相關。同時，PI3K 既有蛋白激酶活性，同時又有磷脂激酶活性，為病變細胞大量增殖形成腫瘤打下了基礎。AKT 為mTOR 的上游信號分子，在結直腸癌形成過程中，參與調節VEGF 介導的血管生成過程中的多個階段。胡樹堅[10]在其研究中表示由于mTORC1 主要負責細胞的增殖等活動，使得腫瘤惡化或瘤轉移與mTORC1 的異常運作密切相關，由于mTORC1 具有促進新陳代謝功能，并且兼備脂質代謝、抑制細胞吞噬等作用，為病發細胞提供了“立足”基礎；而mTORC2 則是通過提高激酶數量進行化學反應，以調控肌動蛋白細胞。

綜上所述，本研究僅針對mTOR 在結直腸癌中的生物信息分析，局限于mTOR 信息通路，也可圍繞mTOR 信息通路對結直腸癌細胞影響與擴散進行研究。mTOR 信號通路與結直腸癌的發生發展密切相關。了解mTOR 在癌細胞形成過程中的作用，可對我國后續抗癌醫療發展添磚加瓦。