氧化鋅納米顆粒在體內和體外對角膜的毒性評估

侯曉璐,崔冬梅, 牛靈芝,孫曉彤,于 濤, 趙宇航,宋愛萍,李 瑋

0 引言

氧化鋅納米顆粒(zinc oxide nanoparticles, ZnO NPs)屬金屬氧化物產品,是一種多功能性的新型無機材料,顆粒大小約1～100nm。由于晶粒的細微化,氧化鋅納米顆粒表面電子結構和晶體結構發(fā)生變化,因此,具有普通氧化鋅無法比較的特殊性質,在眼科領域得到廣泛的應用。作為新興的藥物載體,氧化鋅納米顆粒有使藥物作用時間延長、到達眼后部等優(yōu)點,改變了傳統(tǒng)的眼部用藥方式[1]。黃嘯等[2]將氧化鋅納米顆粒表面修飾成藥物載體,把具有抗氧化作用的鋅和褪黑素運送到視網(wǎng)膜,實現(xiàn)對視網(wǎng)膜色素上皮層的聯(lián)合抗氧化作用。Agban等[3]將氧化鋅納米顆粒作為藥物載體,將毛果蕓香堿在眼內持續(xù)作用時間延長至14d,提高了青光眼患者的依從性和臨床治療效果。

隨著納米材料在眼科疾病診治等領域的廣泛應用,納米材料的眼健康問題成為近年來的研究熱點[4]。氧化鋅納米顆粒對紫外線UV-A和UV-B均具有良好的防護效果[5],因而被廣泛應用于防曬霜和化妝品中。防曬霜和化妝品常應用于靠近眼睛的地方,從而增加了氧化鋅納米顆粒眼部暴露的可能性。氧化鋅納米顆粒可以有效地減少和抑制革蘭氏陽性和革蘭氏陰性微生物的生長,因此,氧化鋅納米顆粒已用于隱形眼鏡的護理液中[6]。角膜直接與外界環(huán)境接觸,最容易受到破壞,并發(fā)炎癥引起眼部損傷[7]。眼睛尤其是角膜,與皮膚和氣道一樣暴露于空氣中。由于角膜的免疫赦免狀態(tài)和對透明度的特殊要求,角膜對暴露可能做出不同于其他組織和器官的獨特方式反應。目前大多數(shù)文獻的內容都集中在納米材料眼科治療應用方面的研究,有關角膜毒性及機制的研究較少。因此納米材料與眼睛的生物相容性和對人類的健康影響亟待系統(tǒng)的科學研究進行評估。本研究選擇與眼科密切相關的新型納米材料——氧化鋅納米顆粒,通過構建體內和體外染毒模型,觀察氧化鋅納米顆粒對角膜的毒性影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料氧化鋅納米顆粒分散液及粉體(50～100nm)購于杭州萬景新材料有限公司。原代人角膜上皮細胞(human corneal epithelial cells,HCEpiC)購于上海弘順生物科技有限公司。DMEM高糖培養(yǎng)液(Gibco,C11995500BT),胎牛血清(Gibco,10270106),胰酶消化液(蘭杰柯科技有限公司,BL512A),青霉素-鏈霉素溶液(蘭杰柯科技有限公司,BL505A),磷酸鹽緩沖溶液(PBS)(Servicebio,G4202-500ML),MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(Gibco,C0009S)、5%水合氯醛溶液(麥克林,C804539),熒光素鈉(麥克林,F809553)、蘇木精染液(Servicebio,G1004-100ML),伊紅染液(Servicebio,G1001-100ML),TNF-α一抗(Servicebio,GB11188),IL-6一抗(Servicebio,GB11117),HRP標記山羊抗兔二抗(Servicebio,GB23303)。超聲波細胞破碎儀(寧波新芝,JY88-IIN)、超聲波清洗器(昆山,KQ-500VDE)。石蠟切片機(德國徠卡,RM2235)、顯微鏡(OLYMPUS,BX51T)。

試驗采用的輸電塔原型為100kV雙回路角鋼塔，塔高89.6m，呼高66m，基底寬度為17.315m，塔身頂部寬度為2.5m，在塔頂段23.6m范圍內設置有三層橫擔，如圖3所示。輸電塔氣彈模型縮尺比為1∶50，模型材料為鋁材。為了盡量減小輸電塔模型各桿件節(jié)點處膠接導致的阻尼問題，采用線切割方式沿高度方向分段整體雕刻輸電塔的主桿及斜直桿，而后沿各桿件軸線彎折為∟型模擬角鋼橫斷面，最后采用高強粘結劑連接模型各段，輸電塔模型的橫擔和塔腿也采用類似的制作方式。

1.1.2 實驗動物昆明系(KM)雌性小鼠36只,4周齡,22～24g,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司,飼養(yǎng)于山東第一醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學研究中心。將小鼠分籠飼養(yǎng)(5只/籠),溫度23℃±1℃、相對濕度恒定50%±10%、12h光照/12h暗循環(huán)交替照明,自由攝食和水,實驗在小鼠適應新環(huán)境7d后進行。本研究的實驗動物的使用嚴格遵循《實驗動物管理條例》的規(guī)定。本研究通過山東第一醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院動物倫理委員會批準{No.SYDWLS【2022】004號}。

1.2 方法

1.2.1 體外染毒實驗方法

1.2.1.1 氧化鋅納米顆粒表征及配制使用X射線衍射儀(X-ray diffractometer,XRD)檢測氧化鋅納米顆粒的物理學特性,使用納米粒度儀檢測納米溶液分散指數(shù)。用細胞培養(yǎng)液將氧化鋅納米顆粒分散液配制成實驗所需濃度,每次細胞實驗操作前,納米分散液現(xiàn)配現(xiàn)用,使用前在超聲波清洗器水浴池里超聲震蕩10min,超聲分散結束,氧化鋅納米顆粒分散液用紫外線照射法滅菌。

1.2.1.2 細胞培養(yǎng)和形態(tài)及活性檢測原代人角膜上皮細胞在含有10%的胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素、89%高糖DMEM 培養(yǎng)液,37℃,5%CO2,濕度100%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取對數(shù)生長期的原代人角膜上皮細胞稀釋為7×104/mL,每孔100μL接種于96孔板,將培養(yǎng)板置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后,分為空白對照組(除換液外不做任何處理)、氧化鋅納米顆粒實驗組(在正常換液時加入經超聲分散后0.5、5、12.5、25、50、100、250μg/mL分散液),各組均設置6個復孔,于同樣條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化,拍照記錄。每孔加入10μL MTT溶液(5mg/mL, 0.5%MTT)繼續(xù)培養(yǎng)4h,每孔加入100mL DMSO,低速勻速搖晃20min,待結晶完全溶解,使用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測490nm處的OD值,實驗重復3次以上。細胞存活率=氧化鋅納米顆粒實驗組OD值/空白對照組細胞OD值×100%。

1.2.2 體內染毒實驗方法

1.2.2.1 小鼠眼球染毒模型建立存在于化妝品中的氧化鋅納米顆粒暴露于皮膚的濃度為60～120μg/mL,故在此范圍內設定氧化鋅納米顆粒溶液濃度。每次實驗將12只小鼠分為4組:對照組(PBS溶液點眼),25、50和100μg/mL氧化鋅納米顆粒實驗組,每組3只小鼠。實驗重復3次,共計36只小鼠。每次動物實驗操作前,納米分散液現(xiàn)配現(xiàn)用,使用前在超聲波清洗器水浴池里超聲震蕩10min,利用與細胞等滲、具有鹽平衡作用的PBS溶液,制備濃度為25、50和100μg/mL的氧化鋅納米顆粒懸液,配制好的氧化鋅納米顆粒懸液再置于渦旋混合器混勻3min,然后取10μL直接暴露于麻醉后的小鼠右眼眼表(結膜囊內),每天3次,暴露7d。

1.2.2.3 角膜組織學觀察暴露7d后進行角膜取材。5%水合氯醛溶液對小鼠腹腔注射進行麻醉,麻醉劑量:0.1mL/10mg。處死小鼠后小心取出眼球,置于40g/L多聚甲醛中于4℃固定24h,石蠟包埋,組織切片,厚度為4μm。將切好的石蠟切片于二甲苯中進行脫蠟,HE染色,中性樹膠封片,鏡檢及拍照。利用Image J軟件對各組小鼠角膜上皮層厚度、基質層厚度、每高倍鏡下基質層免疫細胞數(shù)進行測量(相同角膜位置、同等放大倍率下拍照,計算免疫細胞數(shù)目)。

1.2.2.4 免疫組織化學染色觀察TNF-α和IL-6的表達暴露7d后取眼球石蠟切片,進行免疫組織化學染色。脫蠟、梯度脫水,充分水洗。滴入3%過氧化氫溶液,室溫孵育25min,PBS清洗3min;用5%BSA覆蓋眼球組織,室溫封閉1h。輕輕甩掉封閉液,滴加TNF-α和IL-6一抗(TNF-α抗體稀釋比1∶200,IL-6抗體稀釋比1∶800),濕盒內4°過夜孵育。PBS洗滌3次每次5min,加HRP標記山羊抗兔二抗2滴,常溫孵育60min。采用DAB顯色,梯度酒精脫水,二甲苯使切片透明化5min;中性樹膠封片。用Image J軟件計算各組角膜基質中表達TNF-α陽性的免疫細胞數(shù)量、IL-6陽性的免疫細胞數(shù)量、TNF-α相應區(qū)域的平均光密度值(IOD值)以及IL-6相應區(qū)域的IOD值后進行統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 納米溶液顆粒表征氧化鋅納米顆粒的XRD圖顯示氧化鋅納米顆粒2θ值中出現(xiàn)7個明顯的波峰,分別是31.7°、34.4°、36.2°、47.5°、56.6°、62.8°、68.0°,證實氧化鋅納米顆粒晶體的特質。納米溶液分散指數(shù)PDI∶0.467,見圖1。

圖1 氧化鋅納米顆粒的XRD圖。

2.2 氧化鋅納米顆粒對細胞形態(tài)的影響正常培養(yǎng)的人角膜上皮細胞形態(tài)呈不規(guī)則梭形,偽足纖長,隨著細胞的生長,偽足部分相互連接呈膜狀,同時細胞逐漸伸展,顯現(xiàn)成不規(guī)則的多邊形并聚集成蜂巢樣,細胞邊界清晰、胞漿豐富。隨著細胞密度的增加,偽足逐漸收縮,細胞間膜性連接不明顯,細胞排列越來越緊密,細胞呈不規(guī)則的多邊形,排列整齊,最后融合成清晰的磨玻璃樣外觀鋪滿培養(yǎng)瓶瓶底,見圖2A。氧化鋅納米顆粒組細胞失去正常多邊形形態(tài),細胞膜破裂,細胞呈現(xiàn)圓形,隨著處理濃度的升高,氧化鋅納米顆粒穿透細胞膜進入細胞內在細胞內沉積,致細胞死亡,見圖2B。

圖2 氧化鋅納米顆粒對人角膜上皮細胞形態(tài)的影響 A:正常角膜上皮細胞;B:人角膜上皮細胞暴露于0.5μg/mL氧化鋅納米顆粒24h的形態(tài)結構。

2.3 MTT法檢測角膜上皮細胞活性Welch檢驗結果表明各組人角膜上皮細胞活性比較差異有統(tǒng)計學意義(F=448.3,P<0.0001)。兩兩比較結果表明,各組細胞活性與空白對照組相比,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。0.5μg/mL氧化鋅納米顆粒組細胞存活率約為80%,5μg/mL氧化鋅納米顆粒組細胞存活率下降至約50%,細胞活力降低具有濃度依賴性,見圖3。

圖3 MTT法檢測不同濃度氧化鋅納米顆粒對人角膜上皮細胞活性的作用 aP<0.05, bP<0.01 vs空白對照組。

2.4 角膜熒光染色情況25μg/mL和50μg/mL氧化鋅納米顆粒組可見點狀熒光素著染,100μg/mL氧化鋅納米顆粒組角膜中央的圓形混濁區(qū)見片狀著染,見圖4。

圖4 角膜熒光素鈉染色情況 A:PBS對照組;B:25μg/mL 氧化鋅納米顆粒組;C:50μg/mL氧化鋅納米顆粒組;D:100μg/mL氧化鋅納米顆粒組,箭頭示角膜中央混濁伴熒光素染色。

2.5 角膜組織HE染色情況與PBS對照組相比,100μg/mL氧化鋅納米顆粒組角膜出現(xiàn)明顯的病理特征,表現(xiàn)為角膜上皮層明顯變薄,上皮細胞層數(shù)明顯減少、上皮細胞數(shù)目明顯減少,基底部上皮細胞排列紊亂、分布不規(guī)則,細胞間出現(xiàn)海綿狀水腫;角膜基質疏松、水腫,基質層成纖維細胞肥大、增生,纖維母細胞增殖;炎癥細胞(嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、單核/巨噬細胞、淋巴細胞)分布在角膜基質層、角膜內皮層及角膜緣,多聚集在角膜緣附近和角膜中央病變區(qū)的角膜基質層和內皮層。25μg/mL、50μg/mL氧化鋅納米顆粒組可見基質水腫、成纖維細胞肥大,未見其他明顯病理改變,見圖5。

利用Image J軟件對各組小鼠的角膜上皮層厚度、角膜基質層厚度、每高倍鏡下基質層免疫細胞數(shù)目進行測量(由于角膜前彈力層、后彈力層及角膜內皮層太薄,故在此未統(tǒng)計其厚度)。各組角膜上皮層厚度比較差異有統(tǒng)計學意義(H=10.9,P<0.05)。100μg/mL氧化鋅納米顆粒組角膜上皮層厚度與PBS對照組相比明顯變薄,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各組角膜基質層厚度比較差異有統(tǒng)計學意義(H=12.8,P<0.01),100μg/mL氧化鋅納米顆粒組角膜基質層與PBS對照組相比明顯增厚,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。各組角膜基質層免疫細胞數(shù)目比較差異有統(tǒng)計學意義(H=10.7,P<0.05),100μg/mL氧化鋅納米顆粒組基質層免疫細胞數(shù)顯著增多,與PBS對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖6。

2.6 各組免疫組織化學染色情況陽性細胞主要在細胞膜和胞漿內著色,呈棕褐色顆粒。各氧化鋅納米顆粒處理組產生TNF-α、IL-6的角膜基質免疫細胞數(shù)及角膜基質TNF-α、IL-6的IOD值比較差異均有統(tǒng)計學意義(均為H=8.2,P<0.05)。100μg/mL氧化鋅納米顆粒組產生TNF-α、IL-6的角膜基質免疫細胞數(shù)及角膜基質TNF-α、IL-6的IOD值均明顯高于PBS對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),25μg/mL和50μg/mL氧化鋅納米顆粒組免疫細胞數(shù)和IOD值與PBS對照組相比均無明顯增高,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖7、8。

圖7 各組角膜免疫組織化學染色情況 A:角膜基質內表達TNF-α免疫組織化學染色圖;B:角膜基質內表達IL-6免疫組織化學染色圖。

圖8 角膜基質內表達TNF-α和IL-6陽性的免疫細胞數(shù)量和平均光密度值 A:表達TNF-α陽性的免疫細胞數(shù)量;B:表達IL-6陽性的免疫細胞數(shù)量;C:表達TNF-α陽性的平均光密度值;D:表達IL-6陽性的平均光密度值;aP<0.05 vs PBS對照組。

3 討論

角膜是兼具屈光功能和屏障功能的透明組織。眼表的解剖、生理及物理屏障使藥物不易進入眼內,生物利用度往往低于5%[8]。納米材料體積小,表面積大,能夠跨越生物屏障[9-10]。納米制劑被廣泛應用于眼科藥物運送載體[11]。納米顆粒也廣泛應用于化妝品領域,并存在于空氣污染物[12-13]中,這些都增加了眼部尤其是角膜暴露的風險。目前,納米材料對眼睛組織結構的影響仍然知之甚少。因此,本研究選擇與眼科密切相關的氧化鋅納米顆粒,從體外和體內兩方面評估納米顆粒的角膜安全性。

目前,有關氧化鋅納米顆粒眼部安全性的體外實驗局限于視網(wǎng)膜和晶狀體。Guo等[14]采用大鼠視網(wǎng)膜神經節(jié)細胞(retinal ganglion cells,RGC)與不同濃度的氧化鋅納米顆粒溶液作用。實驗表明5μg/mL氧化鋅納米顆粒作用24h顯著降低RGC-5細胞活力,2.5μg/mL氧化鋅納米顆粒作用48h顯著降低RGC-5細胞活力,呈現(xiàn)濃度和時間依賴性特征。小鼠光感受器細胞(661W細胞系)暴露于不同濃度氧化鋅納米顆粒,結果發(fā)現(xiàn)31.25μmol/L作用24h降低細胞活力[15]。Wang等[16]采用人晶狀體上皮細胞,與不同濃度氧化鋅納米顆粒溶液相作用,實驗顯示5μg/mL氧化鋅納米顆粒作用24h顯著降低細胞活力。角膜上皮是抵御病原微生物侵襲角膜的第一道屏障[17],角膜上皮的正常結構和功能對維持角膜的透明性和發(fā)揮屏障功能至關重要。因此,本研究選擇體外培養(yǎng)人角膜上皮細胞作為研究對象,觀察體外狀態(tài)下氧化鋅納米顆粒的安全性。通過本研究中發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)人角膜上皮細胞暴露于0.5μg/mL的氧化鋅納米顆粒24h,與空白對照組相比,細胞活力明顯下降。本研究證實了短期暴露于較低濃度氧化鋅納米顆粒,可對人角膜上皮細胞產生毒性作用,并具有濃度依賴性的特征。通過體外實驗,證明了氧化鋅納米顆粒對角膜上皮細胞的高度毒性作用,并為體內實驗提供依據(jù)。

體內實驗濃度選擇是基于體外最小損傷濃度的100倍,原因是淚膜作為眼表的第一個功能屏障,當外源性物質進入眼內,會在30s內通過反射性流淚、眨眼和淚道引流的方式被稀釋[18]。商用防曬霜產品含有高達25%w/w(通常為10%～20%w/w)的氧化鋅納米顆粒。單次應用于人體皮膚后相當于暴露于60～120μg/mL的氧化鋅納米顆粒[19]。因此,本研究中體內實驗的濃度與氧化鋅納米顆粒在眼表的潛在生理暴露量一致。100μg/mL氧化鋅納米顆粒點眼5d,角膜見點片狀熒光素著染;25μg/mL和50μg/mL氧化鋅納米顆粒點眼7d,角膜可見熒光素的點狀著染。研究結果說明氧化鋅納米顆粒會造成角膜屏障功能破壞,引起小鼠角膜上皮損傷,呈時間依賴性和濃度依賴性。HE染色結果顯示,與PBS對照組相比,25μg/mL和50μg/mL氧化鋅納米顆粒組的角膜上皮層厚度、基質層厚度、基質層免疫細胞數(shù)目無明顯改變(P>0.05),而100μg/mL氧化鋅納米顆粒組角膜上皮層變薄、角膜基質層變厚、基質層免疫細胞明顯增多(均P<0.05),100μg/mL氧化鋅納米顆粒組角膜基質層顯著增厚、水腫,基質纖維增生,并出現(xiàn)大量免疫細胞。Kim等[20]將不同濃度的氧化鋅納米顆粒暴露于兔眼的結膜囊,結果發(fā)現(xiàn)淚膜無明顯改變,但未對角膜進行綜合評估。氧化鋅納米顆粒可通過角膜上皮細胞的跨細胞轉運途徑進入角膜深層[21]。與角膜上皮相比,角膜基質對納米顆粒的屏障作用更為強大。角膜基質由緊密堆疊的網(wǎng)狀結構組成,類似于分子篩的功能,篩孔的直徑只有20～40nm[22],本研究中氧化鋅納米顆粒直徑50～100nm,超過了角膜基質多重網(wǎng)狀結構的篩孔直徑,可能是毒性影響局限在角膜的主要原因。

已有研究表明,氧化鋅納米顆粒可在身體其他系統(tǒng)中誘發(fā)炎癥[23]。誘導炎癥反應是納米顆粒在化妝品和防曬霜中的潛在毒性問題[20]。本次實驗表明,100μg/mL氧化鋅納米顆粒組角膜基質層含有TNF-α、IL-6的免疫細胞顯著增多且TNF-α和IL-6的IOD明顯高于對照組(均P<0.05),25μg/mL和50μg/mL的氧化鋅納米顆粒的TNF-α、IL-6表達未見明顯增高(均P>0.05),證明一定濃度的氧化鋅納米顆粒會引起小鼠眼球發(fā)生炎癥反應且具有炎癥反應程度具有濃度依賴性。Senapati等[24]認為JNK、ERK1/2和p38為構成MAPK級聯(lián)反應,在氧化鋅NPs的炎癥反應中起關鍵作用。他們的實驗表明,氧化鋅納米顆粒通過內吞作用或吞噬作用進入人單核細胞,誘導該細胞產生氧化應激,激活NF-κB信號通路,增加IL-1β和TNF-α等炎癥細胞因子產生,這些炎癥細胞因子進一步激活JNK、ERK1/2和p38在內的MAPK信號通路,誘導炎癥基因的轉錄增強,引發(fā)促炎反應和基因毒性。

本研究仍存在局限性。納米顆粒的性質、大小、表面修飾等因素都有可能影響眼毒性作用,未來將進一步細化納米顆粒。納米顆粒對細胞損傷相關的機制如炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡、DNA損傷、細胞自噬、離子通道改變和物理損傷等,這些機制是否參與了氧化鋅納米顆粒的眼毒性,下一步將繼續(xù)研究。

綜上所述,通過體外和體內的研究,證實了氧化鋅納米顆粒對角膜具有毒性損傷作用。該研究豐富了氧化鋅納米顆粒眼毒性的數(shù)據(jù),提醒在納米材料廣泛應用的同時應警惕毒性作用,為氧化鋅納米顆粒眼部安全性評價提供了一定的理論依據(jù)。