RA患者microRNA-155調節免疫細胞分化的機制研究

楊瑞賓 國學紅 周成英 吳雪梅

(興義市人民醫院,貴州 興義 562400 )

類風濕性關節炎(RA)是一種比較常見的慢性炎癥性自身免疫性疾病,對稱性的手、足小關節的慢性滑膜炎及血管炎為本病的基本特征。miRNA是一類抑制編碼基因表達的調控基因,其主要通過結合特定的靶mRNA的3’非編碼區使其降解或抑制其翻譯過程以影響目的基因的表達[1]。研究[2]表明,miR-155是與人體免疫密切相關的非編碼RNA,在單核巨噬細胞、中性粒細胞及TB細胞等各種免疫細胞表面發揮免疫調節效應。miR-155可通過調節T細胞在自身免疫性關節炎、銀屑病、動脈粥樣硬化等多種自身免疫性疾病及免疫炎癥中發揮作用。本研究旨在探討RA患者miR-155如何調節CD4+T細胞亞群Th17及Treg細胞的分化及其特異性轉錄因子和細胞因子的表達,從miRNA的角度研究RA免疫功能紊亂的調節作用及其分子機制,為RA的防治、病情監測提供新思路和理論依據。

1 對象與方法

1.1研究對象 收集2018年8月至2020年10月本院風濕免疫科RA患者62例為研究對象,其中輕度RA患者37例,重度RA患者25例。所有RA患者均符合美國風濕病協會1987年修訂的診斷標準并排除腫瘤及其它自身免疫性疾病。活動期RA患者需符合RA診斷標準+關節腫脹≥3個且同時滿足以下條件中任意2條:關節內或者周圍晨僵≥1個小時;關節腫痛≥5;ESR≥28 mm/h;CRP↑≥1.5倍正常值。對照組選擇同期在我院體檢的健康者30例,男21例,女9例,年齡2～74歲;輕度RA患者男10例,女27例,年齡5～76歲;重度RA患者男2例,女23例,年齡25～77歲。根據知情同意原則,所有研究對象均簽署知情同意書并獲得本院倫理委員會同意。RA組與健康對照組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2方法 采集所以研究對象空腹靜脈血5 mL至EDTA抗凝的紫色無菌管內,離心收集血漿。密度梯度法離心獲取外周血單個核細胞(PBMCs)用Trizol LS和Trizol試劑分別提取外周血血漿及PBMCs中的RNA,逆轉錄合成CDNA,以其為模板,RCR擴增各目的基因。RT-qPCR法檢測RA患者及健康對照組外周血中miR-155、SOCS1、JAK3、RORγt 、SATA3、SATA5、Foxp3 的mRNA的表達情況,用免疫熒光法檢測IL-2、IL-6、IL-10、IL-17等細胞因子的表達情況;用免疫印跡分析(Western boltting)檢測SOCS1、JAK3、RORγt、SATA3、SATA5、Foxp3靶基因及相關信號通路中重要蛋白的表達情況。采用電化學發光法、免疫散射比濁法及膠乳增強免疫比濁法分別檢測各組研究對象血清中A-CCP、CRP、ASO與 RF含量;所有操作嚴格按照說明書進行。

1.3統計學方法 采用SPSS 22.0、Graph prism 5.0統計軟件對數據進行統計并分析,正態分布的計量資料多組間均數比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗;非正態分布的計量資料采用秩和檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1miR-155、SOCS1、JAK3等基因的mRNA及其蛋白表達情況 RA患者外周血中miR-155mRNA、JAKmRNA3及其蛋白表達水平顯著高于健康對照組(P<0.05),且重度組RA患者miR-155mRNA、JAKmRNA3及其蛋白較輕度組RA患者更高(P<0.05);SOCS1mRNA及其蛋白表達水平在RA患者外周血中明顯低于健康人群(P<0.05),且重度組RA患者SOCS1mRNA與其蛋白表達水平較輕度組RA患者更低(P<0.05)。見圖1。

2.2調控Th17細胞分化相關STAT3/RORγ通路分子的mRNA及其蛋白表達情況 RA患者外周血中STAT3mRNA、RORγtmRNA及其蛋白表達水平較健康對照組明顯升高(P<0.05);且重度組RA患者STAT3mRNA表達水平及蛋白P-STAT3/STAT3、RORγt/β-actin表達水平較輕度組升高更明顯(P<0.05)。見圖2。

2.3調控Treg細胞分化相關STAT5/Foxp3通路分子的mRNA及其蛋白表達情況 RA患者外周血中STAT5mRNA及其蛋白、p-STAT5蛋白相對表達水平明顯低于健康對照組(P<0.05),且重度組RA患者STAT5mRNA及其蛋白、p-STAT5蛋白表達水平較輕度組患者表達更低(P<0.05);Foxp3mRNA及其蛋白在重度RA患者外周血中表達明顯低于健康對照組(P<0.05),在輕度RA患者中Foxp3mRNA降低不明顯(P>0.05)。見圖3。

注:Treg細胞分化相關STAT5/Foxp3通路分子在類風濕性關節炎患者外周血中的表達變化圖3 與對照組相比較,*P<0.05;與輕度組相比較,#P<0.05。

2.4外周血中miR155、SOCS1、SATA3、SATA5、ROPγt、FOXP3、JAK3mRAN含量 RA患者外周血中miR-155 mRNA、JAK3 mRNA、SATA3 mRNA、RORγt mRNA及其蛋白表達水平明顯高于健康對照組(P<0.05),且與疾病嚴重程度相關;而SOCS1 mRNA、SATA5 mRNA、Foxp3 mRNA及其蛋白表達水平明顯低于健康對照組,且與疾病嚴重程度相關(P<0.05)。見表1。

表1 RA組與對照組外周血中miR155、SOCS1、SATA3、SATA5、ROPγt、FOXP3、JAK3mRAN含量比較

2.5外周血中IL-2、IL-6、IL-10、IL-17等細胞因子的表達情況 RA患者外周血中細胞因子IL-2、IL-10、IL-17表達水平顯著高于健康對照組(P<0.05),且重度組RA患者較輕度組RA患者升高不明顯(P>0.05);細胞因子IL-6表達水平顯著高于健康對照組(P<0.05),且重度組患者IL-6表達水平明顯高于輕度組(P<0.05)。見表2。

表2 免疫熒光法比較RA各組與對照組血清中IL-2、IL-6、IL-10、IL-17含量

2.6血清中A-CCP、ASO、RF、CRP等炎性因子的表達情況 RA患者血清中炎性因子A-CCP、RF含量均顯著高于健康對照組(P<0.05),且重度組A-CCP含量較輕度組升高更顯著(P<0.05);重度組CRP含量顯著高于健康對照組及輕度組(P<0.05)。見表3。

表3 RA各組與對照組血清中A-CCP、ASO、RF、CRP含量比較

3 討 論

miRNA是具有免疫調控功能的非編碼小分子RNA,miR-155為其家族成員且生物學活性廣泛,其可通過多種途徑調控T細胞的分化與功能,在維護免疫系統穩態過程中起到了重要作用。本研究通過檢測miR-155、JAK-STAT信號通路分子、SOCS1等基因的mRNA及蛋白在RA外周血的表達情況,以探討其在RA中的致病機制。

本研究結果顯示,RA患者外周血miR-155mRNA表達顯著高于健康對照組(P<0.05),且重度RA患者其miR-55 mRNA表達較輕度RA患者更高(P<0.05),說明miR-155參與RA調節免疫應答反應,且與病情嚴重程度相關;結果還顯示RA患者外周血中SOCS1mRNA及其蛋白水平顯著低于健康對照組(P<0.05),JAK3mRNA及其蛋白表達水平顯著高于健康對照組(P<0.05),RA患者外周血STAT3mRNA、P-STAT3mRNA、RORγtmRNA及其蛋白表達水平也顯著高于健康對照組(P<0.05),此結果提示活化的STAT3蛋白參與RA的發生發展過程。STAT3蛋白的活化對轉錄因子RORγt的表達與調控起關鍵作用,上調STAT3可促進其RORγt表達致使活化的CD4+T細胞向Thl7細胞分化。本研究結果還顯示,RA患者外周血STAT5mRNA、P-STAT5mRNA、Foxp3mRNA及其蛋白表達水平均顯著低于健康對照組(P<0.05),且與疾病嚴重程度呈負相關(P<0.05)。研究[3]表明,STAT5是JAK/STAT信號傳導通路中對Treg細胞分化起關鍵的作用的信號轉導與轉錄激活因子,STAT5蛋白的活化對轉錄因子Foxp3的表達與調控起關鍵作用。上調STAT5可促進核轉錄因子Foxp3表達致使活化的CD4+T細胞向Treg細胞的分化,反之則抑制Treg細胞的分化。Th17細胞是引起自身免疫性疾病和宿主炎癥反應中造成組織損傷的關鍵因子,且參與了RA免疫炎癥反應、滑膜增殖、骨侵蝕多個病理環節。其分泌的主要致炎因子IL-17以激活補體、活化中性粒細胞釋放炎癥性因子方式介導組織的炎癥反應。IL-17、IL-1、IL-6、TNF-α等致炎因子聯合作用可加快血管翳形成與關節軟骨破壞,致使關節炎癥進一步加重[4-7]。本研究提示RA患者外周血中Th17細胞數量較健康對照組明顯升高,且重度RA患者外周血中Th17細胞數量較輕度RA患者升高更明顯,RA患者外周血中IL-17、IL-6表達水平也顯著高于健康對照組,且與疾病嚴重程度成正相關。Treg細胞是一類具有免疫調節作用的CD4+T細胞亞群,其可以通過降低炎性細胞因子產生、減少抗體分泌,進而維持自身免疫耐受。Treg細胞抑制自身免疫性炎癥反應主要通過分泌細胞因子TGF-β和IL-10以抵抗其它CD4+T亞型細胞的分化與炎性介質的釋放。被一系列研究[8-9]表明,RA發病機制中的關鍵環節在于Th17/Treg之間的免疫失衡狀態及相關的細胞因子微環境發生了改變。趙俊桃等[10]實驗發現RA患者外周血Th17細胞數量明顯減少,Treg細胞數量明顯降低,且二者都與病情嚴重程度相關。本研究結果顯示,RA患者外周血Treg細胞數量明顯低于健康對照組,且重度RA患者外周血Treg細胞數量更少,提示RA患者存在免疫耐受下降;結果還顯示,A-CCP、RF等炎性因子在RA患者外周血中高表達,參與RA的致炎過程,并且其特異性與敏感性較高,可用于評估類風濕關節炎的嚴重程度。然而,免疫熒光法檢測結果卻發現RA患者血清中IL-10 細胞因子水平較健康對照組卻明顯升高,Treg細胞數量與IL-10表達水平發生不一致的現象,有可能與標本類型的差異或病程與活動度有關,也可能RA患者體內多種信號轉導通路被激活有關,有待進一步研究。

綜上所述,在RA的炎癥過程中,miR-155參與調控著RA眾多的基因及信號蛋白的表達。在CD4+T細胞分化過程中,miR-155可能通過抑制細胞因子信號傳導抑制物SOCSl的表達而上調JAK/STAT信號通路中核轉錄因子STAT3及其細胞特異性轉錄因子RORrt的表達,進而促進Th17細胞的分化及細胞因子IL-17、IL-6的表達;通過下調JAK/STAT信號通路中核轉錄因子SATA5及其細胞特異性轉錄因子Foxp3途徑以抑制Treg細胞的分化。RA患者中存在Th17/Treg細胞之間免疫失衡狀態及多種炎性因子水平異常表達,二者均參與了RA發病過程。(圖1、圖2見封三)。