牛大力中總甾醇的提取條件優化、含量測定及抗氧化性研究

石敏　謝青夢?黃思榮

摘要：【目的】對牛大力中總甾醇的提取工藝進行優化，建立其含量測定方法，并對其抗氧化性進行初步探究，為進一步開發牛大力價值提供參考。【方法】采用超聲提取-分光光度計法，通過正交試驗獲得牛大力中總甾醇的最佳提取工藝參數和含量測定條件；通過自由基清除試驗初步探究其抗氧化性。【結果】結果顯示，料液比1∶80、乙醇濃度80%、超聲溫度50℃、超聲功率450 W、超聲時間90 min、超聲次數2次，測定波長546 nm、5%香草醛-冰醋酸溶液用量0.4 mL、高氯酸用量0.8 mL、水浴溫度80℃、水浴時間30 min時，牛大力中總甾醇的提取效果最佳，測定方法的方法學考察結果良好，對DPPH·和ABTS·清除率均達到95%以上。【結論】構建的牛大力總甾醇提取、測定方法簡便快捷、提取率高、穩定準確、靈敏度高，可為牛大力價值挖掘、質量控制和天然抗氧化劑開發提供借鑒。

關鍵詞：牛大力；總甾醇；提取；含量測定；抗氧化

中圖分類號：S667.9文獻標識號：A文章編號：1003-4374（2023）02-00-10

Study on Extraction， Detection and Antioxidant Activity of Total Sterol from

Millettia speciosa Champ.

Shi Min， Xie Qing-meng， Huang Si-rong

（Guangxi Vocational University of Agriculture ， Nanning， Guangxi 530007， China）

Abstract： 【Objective】In order to exploiting the value of Millettia speciosa Champ.， the extraction condition of total sterol from Millettia speciosa Champ. was optimized， and the determination method was established， the antioxidant activity was evaluated at the same time. 【Method】The optimum extraction process parameters and content determination conditions of total sterols in Millettia speciosa Champ. were obtained by ultrasonic extraction-spectrophotometer method and orthogonal test. Its antioxidant activity was preliminarily explored by free radical scavenging test.【Result】The result showed that the extraction and determination effect were best when material-to-liquid ratio was 1∶80， ethanol concentration was 80 %， ultrasonic temperature was 50℃， ultrasonic power was 450 W， ultrasonic time was 90 min， extraction times was 2， the detection wavelength was 546 nm， the volume of 5%vanillin-glacial acetic acid was 0.4 mL， the volume of perchloric acid was 0.8 mL， the water bath temperature was 80℃， and the water bath time was 30 min. Tests showed that the scavenging rate on DPPH· and ABTS· were above 95%. 【Conclusion】This extraction and analysis method of total sterol from Millettia speciosa Champ. was simple， efficient， accurate and sensitive， which will become reference to exploit the value， control the quality of Millettia speciosa Champ. and develop the natural antioxidants.

Key words： Millettia speciosa Champ.， total sterol， extraction， detection， antioxidant activity

牛大力為豆科植物美麗崖豆藤（Millettia speciosa Champ.）的干燥根，分布于長江流域以南各地。牛大力含有多糖、黃酮、甾醇、酚酸和生物堿等多種活性成分［1-4］，可用于治療腰肌勞損、風濕性關節炎、肺熱、肺結核、腎虛、慢性支氣管炎、慢性肝炎、白帶異常、遺精等。［5，6］南方地區，尤其是廣東和廣西，常將牛大力泡酒、熬湯或煮粥，藥食兩用，口感甘甜，芳香獨特。近幾年，牛大力開始以深加工產品的形式出現在市場上。［7-9］

植物甾醇是一種生物活性物質，主要包括谷甾醇和豆甾醇等。現代研究表明，植物甾醇對人體有增強抵抗力的作用，有利于減少細菌感染的風險；植物甾醇可加速膽固醇代謝，抑制膽固醇的吸收，對心腦血管疾病有一定的療效；同時植物甾醇可促進血液循環，起到活血化瘀的功效。［10-12］植物甾醇還具有一定的抗氧化活性，低濃度的甾醇就能有效抑制自由基的氧化。［13-16］甾醇含量測定方法有：分光光度計法、氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-質譜法、高效液相色譜-質譜法、薄層色譜法和酶法等。［17-22］其中，氣相色譜法樣品前處理繁瑣，氣相色譜-質譜法和高效液相色譜-質譜法對樣品制備要求高、分析時間長、耗費高，薄層色譜法準確度低、重復性差，酶法技術要求高。分光光度計法相對簡便快捷、準確可靠。目前，尚未有關于牛大力中總甾醇提取工藝及抗氧化性研究的相關報道。本試驗采用超聲提取-分光光度計法，通過L9（34）正交試驗，對牛大力中總甾醇的提取工藝進行優化。通過單因素試驗，對總甾醇的測定條件進行優化，同時對該方法的精密度、重復性和穩定性等進行評價。通過清除DPPH·和ABTS·試驗，初步探究牛大力中總甾醇的抗氧化性。本試驗探索簡便快捷、提取率高、穩定準確、靈敏度高的牛大力中總甾醇提取、檢測方法，為牛大力深加工提供工藝參數，為牛大力定質分級提供依據，從而有效推動中草藥產業的發展。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

牛大力采自廣西15個不同產區，由廣西藥用植物園長期從事藥用植物資源調查和物種保育研究工作的彭玉德高級工程師鑒定，確認樣品屬于豆科植物美麗崖豆藤的根薯部。牛大力用水沖洗干凈后自然晾干，于烘箱中干燥至恒重，打成粉狀，于干燥器中保存。［23］

β-谷甾醇對照品（純度：HPLC ≥98%）：合肥博美生物科技有限責任公司；無水乙醇（分析純）和冰醋酸（分析純）：西隴科學股份有限公司；香草醛（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；高氯酸（優級純）：上海華誼集團華原化工有限公司；1，1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH·）（純度≥98%）：上海源葉生物科技有限公司；抗壞血酸（純度≥99%）：成都市科龍化學品有限公司；2，2-二氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸自由基（ABTS·）（純度≥98%）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 實驗設備

UV-2601雙光束紫外可見分光光度計：北京北分瑞利分析儀器（集團）有限責任公司；KQ-500DE數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司； HWS-24電熱恒溫水浴鍋：上海齊欣科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準曲線的繪制

精密稱取β-谷甾醇對照品10 mg，用無水乙醇溶解并定容至100 mL，即得0.1 mg/mL的β-谷甾醇對照品貯備液，于4℃下避光保存備用。

準確移取0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8 mL上述β-谷甾醇對照品貯備液，于90℃水浴中揮干乙醇溶劑，加入一定體積的5%香草醛-冰醋酸溶液及高氯酸，水浴中保溫一段時間，速冷，加入冰醋酸至5 mL，搖勻，于最大吸收波長處測定吸光度。以β-谷甾醇的質量濃度（ρ）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，進行標準曲線的繪制。

1.3.2 樣品的提取和測定

準確稱取牛大力粉末，加入一定體積和濃度的乙醇溶液，稱定質量，浸泡后超聲提取一段時間，冷卻后稱重并補加提取溶液至原重，采用離心（4000 r/min，10 min）分離出上清液，重復提取數次，合并上清液，得到供試液。

將供試液稀釋10倍，準確移取稀釋后的供試液1 mL，按“1.3.1”項下步驟顯色并測定吸光度，根據公式1-1計算牛大力樣品中總甾醇的提取量。

X＝ρｘVｘN/m（1-1）

其中，X為牛大力總甾醇提取量（mg/g）；ρ為根據標準曲線方程計算得到的待測液中總甾醇質量濃度（mg/mL）；V為待測液體積（mL）；N為牛大力 樣品稀釋倍數；m為牛大力樣品質量（g）。

1.3.3 總甾醇提取工藝的優化

（1）單因素試驗

準確稱取牛大力樣品粉末1.0000 g，固定乙醇濃度90%、超聲溫度50℃、超聲功率350 W、超聲時間60 min、超聲次數1次，考察料液比（1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80）對總甾醇提取量的影響；固定料液比1∶70、超聲溫度50℃、超聲功率350 W、超聲時間60 min、超聲次數1次，考察乙醇濃度（60%、70%、80%、90%、100%）對總甾醇提取量的影響；固定料液比1∶70、乙醇濃度80%、

超聲功率350 W、超聲時間60 min、超聲次數1次，考察超聲溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）對總甾醇提取量的影響；固定料液比1∶70、乙醇濃度80%、超聲溫度50℃、超聲時間60 min、超聲次數1次，考察超聲功率（300 W、350 W、400 W、450 W、500 W）對總甾醇提取量的影響；固定料液比1∶70、乙醇濃度80%、超聲溫度50℃、超聲功率450 W、超聲次數1次，考察超聲時間（0 min、30 min、60 min、90 min、120 min）對總甾醇提取量的影響；固定料液比1∶70、乙醇濃度80%、超聲溫度50℃、超聲功率450 W、超聲時間60 min，考察超聲次數（1次、2次、3次）對牛大力總甾醇提取量的影響。

（2）正交試驗

根據總甾醇提取條件單因素試驗結果，選用L9（34）正交試驗對牛大力總甾醇 提取條件進行優化，其中選取的四因素和三水平見表1。

（3）驗證試驗

按正交試驗最優提取組合進行3次平行試驗，分別計算牛大力中總甾醇提取量和3次平行試驗的RSD，并與正交試驗的結果進行對比，評價提取工藝的可靠性。

1.3.4 檢測波長的選擇

分別精密移取適量β-谷甾醇對照品貯備液和牛大力供試液，按“1.3.1”項下步驟進行顯色， 于波長300～900 nm范圍內進行掃描，選擇測定的波長。

1.3.5 含量測定條件的優化

準確移取β-谷甾醇對照品貯備液0.5 mL，固定高氯酸0.8 mL、水浴溫度70℃、水浴時間30 min、顯色時間10 min，考察5%香草醛-冰醋酸溶液的用量（0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL）對吸光度的影響；固定5%香草醛-冰醋酸溶液0.4 mL、高氯酸0.8 mL、水浴時間30 min、顯色時間10 min，考察水浴溫度（50℃、60℃、70℃、80℃、90℃）對吸光度的影響；固定5%香草醛-冰醋酸溶液0.4 mL、高氯酸0.8 mL、水浴溫度80℃、顯色時間10 min，考察水浴時間（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min）對吸光度的影響；固定5%香草醛-冰醋酸溶液0.4 mL、高氯酸0.8 mL、水浴溫度80℃、水浴時間30 min，考察顯色時間（0 min、5 min、10 min、15 min、20 min）對吸光度的影響。

1.3.6 精密度試驗

選取1份牛大力樣品，按“1.3.1”項下步驟進行提取和顯色后，連續測定吸光度6次，計算牛大力中總甾醇提取量和RSD，評價該方法的精密度。

1.3.7 重復性試驗

選取同一批牛大力樣品6份，分別按“1.3.1”項下步驟進行提取和測定，計算牛大力中總甾醇提取量和RSD，評價該方法的重復性。

1.3.8 穩定性試驗

選取1份牛大力樣品，按“1.3.1”項下步驟進行提取和顯色，分別于顯色結束60 min內，每間隔10 min測定一次吸光度，計算牛大力中總甾醇提取量和RSD，評價該方法的顯色穩定性。

選取1份牛大力樣品，按“1.3.1”項下步驟進行提取，將得到的牛大力供試液分別于室溫下放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h，再按“1.3.1”項下步驟進行顯色測定，評價該方法的樣品穩定性。

1.3.9 抗氧化試驗

（1）DPPH·清除能力試驗

分別準確移取0.010 mg/mL、0.020 mg/ mL、0.030 mg/ mL、0.040 mg/mL、0.050 mg/mL、0.060 mg/ mL、0.080 mg/ mL、0.100 mg/mL、0.125 mg/mL的供試液各5 mL，與1 mL的0.1 mmol/L DPPH溶液充分混合均勻 ，避光處放置反應 30 min，于517 nm處測定得到 A_樣品；移取無水乙醇5 mL，與1 mL的上述DPPH溶液混合，避光處放置反應 30 min，于517 nm處測定得到 A_空白；分別移取上述不同濃度的供試液5 mL，與1 mL的無水乙醇混合，避光處放置反應 30 min，于517 nm處測定得到 A_對照。其中，參比為無水乙醇，陽性對照為維生素C。計算公式：

清除率（％）＝A_空白-A_樣品+A_對照/A_空白x100％（1-2）

（2）ABTS·清除能力試驗

等體積混合2.5 mmol/L過硫酸鉀溶液與7 mmol/ L ABTS溶液，于避光處放置約12 h，即得ABTS貯備液。稀釋ABTS貯備液，使其于734 nm處的吸光度值為0.7 ± 0.02，即得ABTS工作液。［24］分別移取0.010 mg/mL、0.020 mg/mL、0.030 mg/ mL、0.040 mg/ mL、0.050 mg/mL、0.060 mg/mL、0.080 mg/ mL、0.100 mg/mL、0.125 mg/mL的供試液1 mL，與2 mLABTS工作液充分混合均勻 ，于734 nm處測定得到A樣品；移取無水乙醇1 mL，與2 mL ABTS工作液充分混合均勻 ，于734 nm處測定得到 A空白。其中，參比為無水乙醇，陽性對照為維生素C。計算公式：

清除率（％）＝A_空白-A_樣品/A_空白x100％（1-3）

2 實驗結果與分析

2.1 總甾醇提取的單因素試驗結果分析

2.1.1 料液比對總甾醇提取的影響

料液比對總甾醇提取的影響見圖1。料液比在1∶40～1∶70范圍內，與總甾醇提取量呈正相關；料液比超過1∶70后，溶出量已達到最大值的甾醇不再繼續溶出，引起總甾醇提取量不升反降。因此，初步確定最優料液比為1∶70。

2.1.2 乙醇濃度對總甾醇提取的影響

乙醇濃度對總甾醇提取的影響見圖2。乙醇濃度在60%～80%范圍內，與總甾醇提取量呈正相關；乙醇濃度超過80%后，與總甾醇提取量卻呈負相關，這是高濃度乙醇促使部分醇溶性雜質的溶出導致甾醇的溶出受到限制。因此，初步確定最優乙醇濃度為80%。

2.1.3 超聲溫度對總甾醇提取的影響

超聲溫度的高低會直接影響分子運動速率的大小，從而引起物質提取量的變化。超聲溫度對總甾醇提取的影響見圖3。超聲溫度較低時，甾醇物質的溶出速率較慢；超聲溫度高到一定程度時，除了甾醇物質，還有揮發性的成分和熱不穩定的雜質也會相繼溶出， 同時高溫會加快提取溶劑的揮發，影響提取的效率。因此，初步確定最優超聲溫度為50℃。

2.1.4 超聲功率對總甾醇提取的影響

超聲功率對總甾醇提取的影響見圖4。牛大力總甾醇提取量先隨超聲功率的增大而增加，這是由于劇烈的空化效應提高了牛大力細胞的破壞率，加速了甾醇提取 ；當超聲功率超過450 W后，大功率的超聲波會引起雜質的大量溶出。 因此，初步確定最優超聲功率為450 W。

2.1.5 超聲時間對總甾醇提取的影響

超聲時間對總甾醇提取的影響見圖5。牛大力總甾醇提取量先隨超聲時間的增加而呈增加趨勢，表明超聲波產生的綜合效應有利于物質的析出；超聲時間達到60 min時，細胞壁破壞程度較大，內容物提取較多，從而總甾醇提取量最高；超聲時間超過60 min后，除了目標物質之外，雜質也大量析出，并吸附目標物質。 因此，初步確定最優超聲時間為60 min。

2.1.6 提取次數對總甾醇提取的影響

提取次數對總甾醇提取的影響見圖6。總甾醇提取量與提取次數呈正相關，說明少次數的提取會造成提取不徹底，但多次提取又會導致成本增加。因此， 初步確定最優提取次數為2 次。

2.2 總甾醇提取的正交試驗結果分析

正交試驗設計方案與結果見表2。影響牛大力中總甾醇提取的主次因素順序 為C＞A＞B，最優提取組合方式為A3B2C3，即料液比為1∶80，乙醇濃度為80%，超聲時間為90 min。根據方差分析結果表3所示，C因素（超聲時間）有統計學意義，A因素（料液比）、B因素（乙醇濃度）均無統計學意義。

2.3 驗證試驗結果分析

驗證試驗所得牛大力中總甾醇提取量結果分別為22.80 mg/g、22.35 mg/g、22.18 mg/g，所得平均提取量為22.44 mg/g， RSD為1.43%（n=3），所得結果高于正交試驗中的任一組，說明該提取工藝穩定可靠。

2.4 含量測定條件優化結果分析

2.4.1 檢測波長選擇結果分析

β-谷甾醇對照品和牛大力提取液的紫外可見光譜掃描圖見圖7。β-谷甾醇對照品和牛大力甾醇提取液均在546 nm處有最大吸收峰。因此，選擇546 nm作為牛大力中總甾醇含量測定的檢測波長。

2.4.2 5%香草醛-冰醋酸溶液用量對吸光度的影響

在強氧化性酸的作用下，甾醇可與香草醛試劑發生顯色反應，因此5%香草醛-冰醋酸溶液用量對顯色反應是否進行的完全存在直接影響。香草醛-冰醋酸溶液用量對吸光度的影響見圖8。5%香草醛-冰醋酸溶液用量在0.2～0.4 mL范圍內，與吸光度呈正相關；超過0.4 mL后，與吸光度卻呈負相關。因此，確定5%香草醛-冰醋酸溶液用量為0.4 mL。

2.4.3 高氯酸用量對吸光度的影響

雖然高氯酸的用量對顯色反應也存在顯著影響，但不同用量的高氯酸會引起對照貯備液和供試液最大吸收波長的變化。［25］綜合考慮，選擇高氯酸用量為0.8 mL。

2.4.4 水浴溫度對吸光度的影響

水浴溫度對吸光度的影響見圖9。隨水浴溫度的增大，吸光度呈現先升高后降低的趨勢，水浴溫度過低不利于顯色反應的發生，水浴溫度過高則可能會造成底物和顯色試劑的分解。因此，確定水浴溫度為80℃。

2.4.5 水浴時間對吸光度的影響

水浴時間對吸光度的影響見圖10。吸光度隨水浴時間的增大呈現先升高后降低趨勢，表明底物顯色是否完全受水浴時間長短的限制；水浴時間不夠顯色反應未完成，水浴時間過長影響甾醇物質和顯色物質的穩定性。因此，確定水浴時間為30 min。

2.4.6 顯色時間對吸光度的影響

顯色時間對吸光度的影響見圖11。吸光度隨顯色時間的增加有所降低，隨后趨于穩定，表明水浴時顯色反應已完成，水浴結束后可立即進行測定，放置時間越久，顯色物質越不穩定。因此，確定顯色時間為0 min。

2.5 方法學考察結果分析

2.5.1 線性關系考察結果分析

β-谷甾醇標準曲線見圖12。得到線性方程為y=85.853x-0.0003，r=0.9999，說明濃度范圍為0.002～0.016 mg/mL的β-谷甾醇與A₅₄₆之間的線性關系良好。

2.5.2 精密度考察結果分析

精密度試驗所得結果顯示，牛大力中總甾醇平均提取量為22.23 mg/g，RSD為0.87%（n=6），表明精密度良好。

2.5.3 重復性考察結果分析

重復性試驗所得結果顯示，牛大力中總甾醇平均提取量為21.99 mg/g，RSD為2.04%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.5.4 穩定性考察結果分析

顯色穩定性試驗所得結果顯示，牛大力中總甾醇平均提取量為22.17 mg/g，RSD為1.77%（n=7），表明牛大力供試液在顯色60 min內穩定。

樣品穩定性試驗所得結果顯示，牛大力中總甾醇平均提取量為22.03 mg/g，RSD為3.21%（n=8），表明牛大力供試液在48 h內穩定。

2.6 樣品測定結果分析

不同產地牛大力中總甾醇含量測定結果見表4。可見不同產地的牛大力中總甾醇含量差異較大，含量范圍在6.90～41.56 mg/g，可為廣西牛大力產品質量標準的建立提供參考。

2.7 抗氧化性研究結果分析

2.7.1 DPPH·清除能力試驗結果分析

牛大力中總甾醇與維生素C對DPPH·清除能力見圖13。牛大力甾醇提取液在0.010～0.125 mg/mL濃度范圍內，與DPPH·清除率呈正相關；其中最高清除率達到95.4%。與維生素C的抗氧化能力相比，在0.010～0.050 mg/mL濃度范圍內，牛大力甾醇提取液對DPPH·清除能力明顯弱于維生素C；在0.060～0.125 mg/mL濃度范圍內，卻與維生素C相當。

2.7.2ABTS·清除能力試驗結果分析

牛大力中總甾醇與維生素C對ABTS·清除能力見圖14。牛大力甾醇提取液在0.010～0.125 mg/ mL濃度范圍內，與ABTS·清除率呈正相關；其中最高清除率達到98.2%。與維生素C的抗氧化能力相比，濃度為0.010～0.080 mg/mL時，牛大力甾醇提取液的ABTS·清除能力明顯弱于維生素C；濃度為0.100～0.125 mg/mL時，卻與維生素C相當。

3 小結

本研究構建了一種簡便高效、準確靈敏的牛大力中總甾醇的提取和含量測定方法，初步探究發現牛大力中的總甾醇具有一定的體外抗氧化性。經過正交試驗優化得到最佳條件：料液比為1∶80、乙醇濃度為80%、超聲溫度為50℃、超聲功率為450 W、超聲時間為90 min、超聲次數為2次，測定波長為546 nm、5%香草醛-冰醋酸溶液用量為0.4 mL、高氯酸用量為0.8 mL、水浴溫度為80℃、水浴時間為30 min。本研究對牛大力產品的定量分析，牛大力加工產品的研制，天然抗氧化產品的開發均具有較大的指導作用。

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（責任編輯：黎月娟）