玉米ZmCDPK22基因在干旱脅迫下的表達分析

邵盤霞,趙 準,邵武奎,郝曉燕,高升旗,李建平,胡文冉,黃全生

(新疆農業科學院核技術生物技術研究所/新疆農作物生物技術重點實驗室,烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】在植物生長過程中會遇到干旱、鹽堿、低溫等非生物逆境脅迫,嚴重影響植物的生長發育和制約農業生產。干旱是制約作物生產的主要非生物脅迫之一,利用分子生物學方法和手段探索作物的耐旱機制,改善作物本身的抗旱能力,對作物抗旱品種的培育具有重要意義。【前人研究進展】應對逆境,植物在生長過程中會調節生理生化代謝途徑,激素信號轉導及調控基因表達等來抵御脅迫,提高逆境脅迫的耐受性[1, 2]。Ca2+在介導生物和非生物脅迫信號轉導中起著重要作用,細胞中的鈣信號通過鈣敏感蛋白,如鈣調蛋白,鈣調磷酸酶B蛋白(Calcinerium-B Like,CBL)和鈣依賴蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinase,CDPK)等調節相關基因的表達,從而應對環境脅迫[3, 4]。CDPK作為鈣結合蛋白之一,其家族的許多成員在植物抵抗干旱脅迫的調控反應中發揮著重要作用。前人研究報道CDPK基因具有提高作物抗旱性的作用。擬南芥CDPK相關基因通過調節氣孔參與干旱脅迫響應,過表達AtCPK4、AtCPK8、AtCPK10和AtCPK11可以顯著提高轉基因植物的抗旱性[5-7]。OsCDPK4在水稻的耐鹽性和干旱脅迫中發揮著重要作用,過表達顯著增強水稻對鹽和干旱脅迫的耐受性[8];OsCDPK9通過調節氣孔關閉和滲透調劑提高水稻干旱脅迫的耐受性[9]。ZoCDPK1在參與生姜響應干旱脅迫的信號通路中發揮正向調節作用,在煙草中過表達該基因,提高了煙草對干旱脅迫的耐受性[10]。玉米是我國重要的作物之一,是重要的飼料和工業原料,其產量和品質受干旱脅迫的制約。在玉米中,已發現了40個CDPKs基因[11]。【本研究切入點】ZmCDPK1參與玉米低溫脅迫響應,在低溫信號轉導中期負調節作用[12];ZmCPK11由機械損傷誘導表達,在酶促反應和轉錄水平受亞麻酸和茉莉酸甲酯調節[13];雖然已經克隆了ZmCDPK、ZmCDPK17、ZmCDPK22、ZmCDPK28和ZmCDPK34等基因,但是在植物中的功能尚未研究[12]。因此探索ZmCDPK22是否響應干旱、鹽堿等非生物脅迫及它們發揮的作用很有必要。【擬解決的關鍵問題】以ZmCDPK22作為研究對象,從生物信息學和干旱脅迫表達兩方面對該基因的功能進行判斷,為研究該基因的功能提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

以玉米自交系B73(實驗室保存及繁種)為材料,以葉片含水量模擬干旱脅迫條件,在玉米四葉時期測定玉米含水量,采用烘干稱重法對相應葉片測定葉片含水量。用精度為0.001 g的天平對鮮葉稱重,稱重后將葉片放入105℃恒溫箱殺青15 min,于80℃下烘干至恒重后稱其干重,計算各葉片含水量,葉片含水量=(鮮重-干重)/鮮×100%。

1.2 方 法

1.2.1ZmCDPK1生物信息學分析

通過ExPASy的工具ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)預測蛋白理化性質;應用在線工具DeepTMHMM(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php/DeepTMHMM)預測跨膜結構;SOPMA(http://npsa-prabi.ibcp.fr/)用于預測ZmCDPK22二級結構;應用SWISS-MODEL((https://swissmodel.expasy.org/))預測其三級結構;Plant-mPLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)用于預測亞細胞定位;SignalP3.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)用于分析信號肽;通過NCBI CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)分析該基因的保守結構域;MEME(http://meme-suite.org/)預測保守基序;使用STRING(https://string-db.org/)在玉米數據庫中進行ZmCDPK22互作蛋白預測;應用MEGA-X進行多序列比對和構建進化樹;通過NCBI網站下載ZmCDPK22基因起始密碼子上游2 000 bp序列在PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)網站進行啟動子區順式作用元件分析。

1.2.2ZmCDPK22表達模式

按照植物總RNA提取試劑盒說明提取玉米葉片RNA,逆轉錄后得到的cDNA。以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR分析。根據ZmCDPK22基因的CDS(coding sequence)序列設計引物(ZmCDPK22-qF:AGGTCATATTGACTTCGCATCT;ZmCDPK22-qR:GCAACCTTCTTAAGCTTGTTCA)。以ZmUBI(ZmUBI-qF:TGGTTGTGGCTTCGTTGGTT;ZmUBI-qR:GCTGCAGAAGAGTTTTGGGTACA)作為內參基因,使用BIO-RAD CFX96 Real-Time System qPCR儀進行實時熒光擴增。應用2-ΔΔCT方法分析ZmCDPK22基因的干旱脅迫表達模式。

2 結果與分析

2.1 ZmCDPK22基因序列及蛋白理化性質分析

研究表明,ZmCDPK22基因全長為2 216 bp僅含有一個外顯子,CDS序列長1 620 bp,編碼539個氨基酸。ZmCDPK22分子式為C2675H4217N779O798S21,分子量為60 731.91,等電點為6.44;該蛋白中丙氨酸(Ala,A)、谷氨酸(Glu,E)和精氨酸(Arg,R)的含量較高,分別為45個(8.3%)、43個(8.0%)和41個(7.6%),不含吡咯賴氨酸(Pyl,O)和硒代半胱氨酸(Sec,U);親水性系數為-0.602,不穩定性指數為50.15,說明該蛋白為親水性不穩定蛋白。蛋白二級結構顯示該蛋白由ɑ-螺旋(41.93%)、無規則卷曲(39.89%)、延伸鏈(9.28%)和β-折疊(8.91%)組成(圖1A);蛋白三級結構預測顯示與該蛋白同源基因三級結構最高相似度為37.53%。亞細胞定位預測該蛋白定位于細胞核,無信號肽和跨膜結構域。圖1

圖1 ZmCDPK22蛋白質二級結構(A)與三級結構(B)

2.2 ZmCDPK22蛋白結構域和基序預測

研究表明,ZmCDPK22含STK_CAMK結構域,屬于PK_like亞家族。有18種保守基序,分別為Motif1～Motif18;ZmCDPK22、ZmCDPK15和DoCDPK3不含Motif18基序且先后順序都相同。圖2,圖3

圖2 ZmCDPK22的蛋白結構域

圖3 ZmCDPK22的保守基序

2.3 蛋白互作預測

研究表明,ZmCDPK22與10個蛋白互作,與絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶(GRMZM2G148539_P02)的互作最強,互作系數為0.618;與呼吸爆發氧化酶同源蛋白相關基因(RbohC和rboh2)互作較弱,互作系數為0.600。圖4

圖4 ZmCDPK22蛋白互作網絡模型

2.4 進化樹與啟動子區域順式作用元件

研究表明,ZmCDPK22與ZmCDPK15的蛋白序列相似度最高,為98.89%,與擬南芥AtCDP17和棉花GhCDPK34的蛋白序列相似度比較低,分別為69.25%和64.62%。利用MEAG-X的鄰接法構建玉米、擬南芥、棉花、小麥和水稻等植物相關CDPK基因的進化樹,ZmCDPK22與玉米ZmCDPK15和高粱SbCDPK1的親緣關系最近,與擬南芥AtCDPK17和棉花GhCDPK34的親緣關系較遠。圖5

圖5 ZmCDPK22系統進化樹

ZmCDPK22基因啟動子區含有31種順式作用元件,除含有TATA-box和CAAT-box等核心啟動元件之外,還含有激素相關響應元件、光響應元件、厭氧誘導元件、低溫響應元件及分生組織表達等相關元件。在激素響應相關元件中,茉莉酸甲酯響應元件共有6個,脫落酸響應元件有2個。表1

表1 ZmCDPK22啟動子順式作用元件

2.5 ZmCDPK22對干旱脅迫的響應

研究表明,葉片含水量為87%時ZmCDPK22的表達量記為1,在不同含水量情況下,ZmCDPK22的表達量不同。與葉片含水量87%相比,ZmCDPK22的相對表達量隨著葉片含水量的降低而逐漸降低,在葉片含水量為78%時相對表達量最高,在含水量為33%時相對表達量最低。圖6

圖6 ZmCDPK22在葉片不同含水量的相對表達量

3 討 論

研究對ZmCDPK22的啟動子區順式作用元件分析表明,該基因包含2個關鍵的啟動子元件,將轉錄起始位點與RNA聚合酶連接的TATA-box和調節基因轉錄效率的CAAT-box,ZmCDPK22可以正常轉錄。在對擬南芥和蒺藜苜蓿相關CDPKs基因的啟動子區順式作用元件的研究中發現一些AtCPKs和MtCDPKs參與植物激素和非生物脅迫信號的調節[14-17]。ZmCDPK22啟動子區還含有多種激素及逆境響應元件,推測該基因可能在多種逆境脅迫響應中發揮著重要作用。

ZmCDPK22可能參與對生物和非生物脅迫的反應,尤其是對病原體的防御和干旱脅迫,研究中通過蛋白互作網絡預測分析,發現ZmCDPK22與RBOH有關。RBOHs是植物體內活性氧生成的主要途徑,在植物生長發育和逆境響應中發揮重要的作用[18]。在葡萄中,鹽和干旱脅迫處理顯著增強了VvRBOHA、VvRBOHB和VvRBOHC1的表達,外源ABA處理顯著上調VvRBOHB的表達[19]。油菜RbohA、RbohD基因在響應低溫、鹽、PEG-6000模擬干旱脅迫過程中發揮作用[20]。研究中ZmCDPK22與多個Rboh蛋白互作,猜測其可能與Rboh基因有相似或相同的功能。

研究發現CDPK參與植物非生物脅迫反應,干旱[21]、鹽[22]、光[23]等多種環境因子以及生長素[24]等都能引起CDPK基因的特異性表達。ZmCDPK9是CDPKs基因家族中一個新的成員并對干旱脅迫具有一定的應答反應[25]。ZmCDPK38基因響應干旱脅迫與鹽脅迫,可能在干旱應答與鹽脅迫應答反應中發揮一定的功能[26]。葉片含水量能直接反映作物生長發育的實際狀況,是機理研究中反映作物水分盈虧程度的最佳指標,是作物耐旱能力綜合作用的體現和監測作物受脅迫的重要參考[27, 28]。研究測定了ZmCDPK22基因在不同含水量葉片中的相對表達量,在含水量為78%時相對表達量最高,在含水量為33%時相對表達量最低,ZmCDPK22對干旱脅迫有一定響應。

4 結 論

從玉米中克隆得到ZmCDPK22基因,該基因編碼539個氨基酸,相對分子量為60 731.91,等電點為6.44,無跨膜結構以及信號肽,該蛋白定位于細胞核;ZmCDPK22與10個蛋白存在互作,屬于PK_like亞家族。其啟動區含有大量的光響應和多種激素響應等元件。在不同含水量情況下,ZmCDPK22的表達量不同。與葉片含水量87%相比,ZmCDPK22的相對表達量隨著葉片含水量的降低而逐漸降低,該基因對干旱脅迫具有一定響應。