文冠果根腐病主要生物學特性及室內藥劑篩選

張國新,宋單波,劉保軍,王 權,白劍宇,郭慶元

(1.新疆農業大學農學院,烏魯木齊 830052;2.新疆林科院經濟林研究所/新疆林果樹種選育與栽培重點實驗室,烏魯木齊 830063)

0 引 言

【研究意義】文冠果是我國北方獨有的木本油料植物[1],其種子含油率約30%,種仁含油率約60%[2-4]。文冠果具有耐旱、耐瘠薄、耐鹽堿、抗風固沙、抗低溫等優良生態學特點,是水土保障、防風固沙和防治土地荒漠化的優良樹種[5-8],兼具極高觀賞性[9]。文冠果作為木本油料樹種和園林綠化觀賞樹種在我國北方多地種植,其中內蒙古、山西、陜西、河北、山東、新疆等省(自治區)均有較大的種植面積[10-11]。2019年6月文冠果根腐病在新疆阿克蘇地區沙雅縣、昌吉州木壘縣發生,造成近20%文冠果苗木枯萎。文冠果根腐病是一種多病原菌復合侵染發生的一種土傳病害,其中瓜果腐霉菌(Pythiumaphanidermatum)的分離頻率最高,達73%的分離率,瓜果腐霉菌的侵染是造成文冠果根腐病發生的主導因素。文冠果(Xanthocerassorbifoiium),屬無患子目(Sapindales),無患子科(Sapindaceae),別名文官果、木瓜、崖木瓜等[12]。文冠果的根系為肉質根,在常規移栽中常常造成大量的根系損傷,增加了病原菌自傷口侵染的機會,加之灌水后苗木下沉,改變了根莖原有的環境條件,在高濕高溫不透氣的環境條件下,皮層很快引起水腫樣腐爛,導致地上部分和根系通道被切斷使營養無法運輸到根系,造成死亡。研究該病原菌的主要生物學特性,分析該病原菌的主要生物學特性,篩選抑菌效果明顯的防控藥劑,對后續田間藥劑防控提供備選農藥有實際意義。【前人研究進展】根腐病通常是由多種病原復合侵染引起的一種作物根部病害,其常見的病原菌包括腐霉菌、鐮刀菌、絲核菌等多種病原菌[13]。其中腐霉菌和鐮刀菌不同種是引起作物根腐病的主要病原菌,在這些病原菌的鑒定中已逐步建立了成熟的鑒定技術,包括病原菌的形態學鑒定、致病性實驗驗證和通過分子生物學鑒定技術,確保了病原菌鑒定的準確度。【本研究切入點】根腐病是危害文冠果根部的一種主要病害,目前國內外對文冠果根腐病的防治尚缺乏高效的防控藥劑和防控技術。需通過不同碳源、溫度和pH值條件,明確病原菌主要生物學特性,以及室內藥劑毒力測定,篩選高效抑菌藥劑。【擬解決的關鍵問題】研究瓜果腐霉菌病原菌生物學特性且進行室內藥劑測定毒力,研究文冠果根腐病主要病原菌(瓜果腐霉菌)的生物學特性,篩選出抑菌效果明顯的殺菌劑,為田間藥劑篩選提供備選藥劑。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株

供試材料分別于阿克蘇地區沙雅縣、昌吉州木壘縣和新疆林科院院內文冠果種植園采集文冠果根腐病病根和根際土壤樣本。供試菌株XJ-PA由新疆文冠果根部、土壤分離純化獲得,并經實驗室準確鑒定和保存的致病菌株。

1.1.2 供試培養基配制

供試培養基:培養基種類包括PDA、PSA、OA、PCA、MA、胡蘿卜培養基和玉米粉培養基(CMA)和WA等8種不同碳源培養基,依據相關文獻配方配制不同碳源培養基[14]。

PDA培養基:新鮮馬鈴薯200 g切丁,加水煮沸致馬鈴薯丁松軟,4層紗布過濾、瓊脂粉20 g、葡萄糖20 g,加入蒸餾水補足至1 000 mL;121℃下滅菌20 min后保存備用。

PSA培養基:配制方法同PDA一致,將等量葡萄糖置換為蔗糖即可。

OA培養基:燕麥片20 g,4層紗布過濾、瓊脂17 g,加水補足至1 000 mL;

麥芽糖瓊脂培養基(MA):麥芽糖20 g、葡萄糖10 g、瓊脂粉20 g,加入蒸餾水補足至1 000 mL;滅菌備用。

玉米粉CMA培養基:玉米粉20 g、瓊脂粉20 g,加水補足至1 000 mL;

胡蘿卜培養基:100 g去皮胡蘿切丁,加水煮沸致胡蘿卜丁松軟、瓊脂20 g,加入蒸餾水補足至1 000 mL;滅菌備用。

PCA培養基:去皮馬鈴薯20 g、去皮胡蘿卜20 g,加水煮沸致馬鈴薯與胡蘿卜松軟、瓊脂13 g,加蒸餾水補足至1 000 mL;滅菌備用。

WA水瓊脂培養基:瓊脂粉18 g,加入蒸餾水補足至1 000 mL;滅菌備用。

1.1.3 供試藥劑

參考相關文獻[15-17]等,篩選出12種供試藥劑,藥劑名稱、劑型及生產廠家等。供試藥劑名稱、劑型及生產廠家為藥劑2×109CFU/g 枯草芽孢桿菌(粉劑,山東萬事達農化有限公司);50% 腐霉·福美雙(福美雙:40%;腐霉利:10%)(可濕性粉劑,成都科利隆有限公司);30% 噁霉靈(水劑,山東恒利達生物科技有限公司);80% 代森錳鋅(可濕性粉劑,河北雙吉化工有限公司);722 g/L 霜霉威鹽酸鹽(水劑,拜耳作物科學(中國)有限公司);30% 甲霜·噁霉靈(噁霉靈:24%;甲霜靈:6%)(水劑,中農立華(天津)農用化學品有限公司);500 g/L甲基硫菌靈(懸浮劑,江蘇豐山集團股份有限公司);37% 苯醚甲環唑(水分散立劑,成都西部愛地作物科學有限公司);21% 過氧乙酸(水劑,河北海虹生化有限公司)50%氯溴異氰尿酸(粉劑,河北上瑞化有限公司);47%春雷·王銅(可濕性粉劑,江西禾益化工股份有限公司);45%戊唑·咪鮮胺(水乳劑,江蘇景宏生物科技有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 生物學測定

將培養1 d菌齡的供試菌株,用5 mm滅菌打孔器打取菌落邊緣附近大小均勻的菌餅,接種于各處理的供試培養基中,在25℃下恒溫培養(除溫度試驗外)24 h后,用十字交叉法測量各處理的菌落直徑,每個處理重復4次。

1.2.1.1 不同培養基對病原菌生長的影響

將供試菌株在PDA培養基上25℃培養3 d后,用滅菌后的內徑為5 mm打孔器在菌落邊緣打取的菌餅,并將5 mm菌餅菌絲面分別接種于PDA、PSA、OA、PCA、WA、MA、胡蘿卜培養基和玉米粉培養基(CMA)。

1.2.1.2 不同溫度對病原菌生長的影響

將供試菌株接種在PDA平板中央,分別置于5、10、15、20、22、25、28、30、35和40℃恒溫培養。

1.2.1.3 不同pH對菌絲生長的影響

用HCl(1 mol/L)和NaOH(1 mol/L)溶液調整PDA培養基的pH值,使培養基的配制值分別為pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0。

1.2.1.4 殺菌劑對病原菌菌絲生長的影響

將菌株在PDA培養基上培養24 h,用內徑為5 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅備用。將各供試藥劑分別以推薦使用濃度為參考,稀釋從高到低設置8個藥劑濃度梯度。將各不同濃度藥劑與熔化并冷卻至40℃的PDA培養基按1∶9比例(總體積10 mL)配制成含藥培養基,以放入與藥劑溶液等體積無菌水作為對照[18]。倒入直徑9 cm的培養皿中,待培養基平板凝固后,將菌餅菌絲面朝下放置培養基中央。每個處理重復3次。25℃條件下恒溫培養24 h、5 d后,采用十字交叉法[19]測量菌落直徑,并計算其抑菌率。設置8個濃度中,按照抑制率保留適合的5個濃度梯度;以藥劑濃度(mg/L)的對數值為自變量,抑制率的機率值為因變量,運用SPSS21.0建立毒力回歸方程及相關系數R值,計算各藥劑的抑菌中濃度(EC50),比較抑菌效果。

抑菌率(%)=(對照菌落凈生長量-藥劑處理菌落凈生長量)/對照菌落凈生長量×100。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對菌絲生長的影響

研究表明,該病原菌在供試的8種培養基上均可長,CMA、PCA、OA培養基生長速率均無太大差別。生長速率從大到小依次為PDA、CMA、PCA、OA、PSA、胡蘿卜培養基、WA、MA。其中在PDA上生長速率最高,菌落大而密,菌絲生長旺盛,長勢最好;在MA培養基上生長最慢,菌落最小,菌絲最稀疏,且WA菌絲生長稀疏。圖1

注：圖中不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05),下同

2.2 不同溫度對菌絲生長的影響

研究表明,病原菌菌絲在15～40℃溫度范圍內均可生長,15～35℃菌落直徑隨溫度的升高而增加,其中5～10℃菌絲無法生長,35℃為最適生長溫度,當溫度超過35℃后菌絲生長開始受到不同程度的抑制,生長速率明顯降低。病原菌的最適溫度在(35±1)℃。圖2

圖2 不同溫度條件下瓜果腐霉菌在PDA上菌落生長變化

2.3 不同pH對菌絲生長的影響

研究表明,該病原菌在pH值為3時菌絲不生長,在pH值為4～11均能生長,pH值在6～8范圍內較適合菌絲生長,最適pH值為8。當pH大于8時,菌絲的生長因pH的增加而逐漸降低。病菌在pH為8時生長最為良好。圖3

圖3 不同pH條件下瓜果腐霉菌菌落生長變化

2.4 不同殺菌劑對病原菌的抑菌效果

研究表明,12種藥劑對該病原菌的毒力大小存在較大差異,其中30%甲霜·噁霉靈毒力最大,EC50值為1.259 9 mg/L,其次為50%腐霉·福美雙,EC50值為8.156 4 mg/L;2×109CFU/g枯草芽孢桿菌毒力最小,EC50值為4 107.327 mg/L。其余9種藥劑的毒力從小到大依序為37%苯醚甲環唑、500 g/L甲基硫菌靈、21%過氧乙酸、47%春雷·王銅、50%氯溴異氰尿酸、30%噁霉靈、45%戊唑·咪鮮胺、722 g/L霜霉威鹽酸鹽、80%代森錳鋅。表1

表1 12種殺菌劑下文冠果根腐病病菌毒力變化

續表1 12種殺菌劑對文冠果根腐病病菌毒力測定結果

3 討 論

瓜果腐霉除導致果蔬采摘后腐爛外,還可引起大豆根腐病[20]、小麥腐霉根腐病[21]、玉米青枯病[22]番茄根腐病[23]等多種根腐病[24]。在瓜果腐霉的生物學特性研究中,洪小雨等[25]采用菌絲生長速率法對瓜果腐霉菌導致豇豆軟腐病進行了生物學特性研究,結果表明,瓜果腐霉,最適碳源培養基為可溶性淀粉培養基生長最快,溫度15～40℃范圍內均能生長;適宜生長溫度為30～35℃,35℃時生長最快,在pH為5.0～12.0范圍內均能生長,適宜pH范圍為7.0～9.0,pH為9時瓜果腐霉生長最快,與試驗存在一定差異。而光照對瓜果腐霉菌生長無顯著差異[25]。

研究中主要針對瓜果腐霉菌進行了生物學特性研究,并篩選出抑菌效果明顯的殺菌劑3種,包括甲霜·噁霉靈、腐霉·福美雙和80%代森錳鋅,在后續的初期的室內藥劑防控試驗中對鐮刀菌等其它病原菌也同樣具有較好的防治效果。

張旭等[26]的研究中芽孢桿菌(L-NM62),對瓜果腐霉有較強的抑菌效果,因此需針對該病原菌進行拮抗菌篩選研究。在該病害的生物學特性研究中,只針對不同碳源、不同溫度、不同pH 3個方面進行試驗,并未針對氮源和該病原菌的致死溫度進行有效試驗。研究均在室內進行,環境條件可控,而田間受溫度、濕度、雨水等因素影響,藥劑防治可能略有差別。氮源、致死溫度和合理科學篩選的有效藥劑進行田間藥劑試驗將是下一步研究工作重點。

4 結 論

4.1在不同碳源培養基中,最適生長培養基為PDA,最適生長溫度為(35±1)℃,最適pH值為8。

4.230%甲霜·噁霉靈毒力最大,其次為50%腐霉·福美雙和80%代森錳鋅,篩選出的甲霜·噁霉靈、腐霉·福美雙、80%代森錳鋅3種抑菌效果較好的藥劑可作為田間藥效防治試驗的備選農藥。