飼用五環(huán)三萜提取物的致突變?cè)囼?yàn)

張 媛 肖宜容 陳怡夢(mèng) 陳 新，2 張雨梅，2

（1．揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2．江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009）

細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生是醫(yī)學(xué)界面臨的重要問(wèn)題，減少及禁止抗生素在畜禽養(yǎng)殖中的使用已經(jīng)成為必然趨勢(shì)。尋找天然動(dòng)植物、海洋生物或利用生物技術(shù)發(fā)現(xiàn)抗菌藥物替代品，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能迫在眉睫[1]。中草藥具有良好的藥用價(jià)值，可部分替代抗生素，因此受到廣泛關(guān)注[2]。研究發(fā)現(xiàn)，在植物中廣泛存在的萜類(lèi)化合物具有多樣的藥理作用[3]。三萜類(lèi)物質(zhì)具有不易揮發(fā)、性質(zhì)穩(wěn)定的特點(diǎn)，是很多中草藥的主要活性成分[4]。五環(huán)三萜類(lèi)物質(zhì)具有廣泛的生物學(xué)活性和藥理作用，如抗炎[5]、降血糖[6]、抗腫瘤[7]、抗寄生蟲(chóng)[8]等。本研究的受試物有效成分主要包括山楂酸[9]、科羅索酸[10]、樺木醇、白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸等。使用山楂酸治療腹瀉型腸易激綜合征具有較好的治療效果[11]。熊果酸可以維護(hù)腸道穩(wěn)態(tài)和機(jī)體健康[12]。小檗堿齊墩果酸鹽有助于仔豬的生長(zhǎng)發(fā)育，可有效緩解仔豬感染產(chǎn)腸毒素大腸桿菌后的體重減輕[13]。從茶籽中提取的五環(huán)三萜類(lèi)化合物可以提高畜禽生產(chǎn)性能，增強(qiáng)免疫力[14]。以三萜類(lèi)為主要活性物質(zhì)的糖萜素添加在飼料中，可有效提高肥育豬生長(zhǎng)性能，增強(qiáng)免疫力，降低谷草轉(zhuǎn)氨酶活性。目前，關(guān)于該提取物遺傳毒性研究的報(bào)道較為少見(jiàn)。本文參照GB 15193.4—2014 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)及精子畸變?cè)囼?yàn)的方法，評(píng)價(jià)五環(huán)三萜提取物是否具有的致突變性，為五環(huán)三萜提取物作為飼料添加劑的安全性評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

依據(jù)GB 15193.4—2014 中推薦組合，選取鼠TA97、TA98、TA100、TA102 和TA1535 菌株，購(gòu)自Molecular Toxicology Inc 公司。菌株儲(chǔ)存于-80 ℃或平板短期保存于4 ℃，備用。按GB 15193.4—2014 方法對(duì)菌株進(jìn)行生物學(xué)特性鑒定。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

Wistar 大鼠，雄性，5～6 周齡；ICR 小鼠，24～35 g。試驗(yàn)動(dòng)物由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心提供。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2017-0004；使用許可證號(hào)：SYXK（蘇）2017-0044。

1.1.3 試劑及儀器

五環(huán)三萜提取物成分為科羅索酸、樺木醇、山楂酸、白樺脂酸、齊墩果酸、微甲酸和熊果酸，含量≥90.0%（20191101），由湖南先偉生物有限公司提供。200 mg/mL多氯聯(lián)苯溶液、沙門(mén)氏菌細(xì)菌培養(yǎng)基，按GB 15193.4—2014 中要求配制。陽(yáng)性誘變劑：1,8-二羥基蒽醌（S52025-379，德國(guó)Sigma 公司）、疊氮鈉（200001012，沈陽(yáng)化學(xué)試劑廠）、2-氨基芴（26238B，美國(guó)Sigma-Aldrich公司）、敵克松（10112926，上海晶純?cè)噭┯邢薰荆鶠榉治黾儭?/p>

SG603A 生物安全柜（美國(guó)BAKER 公司）、SX-500高壓滅菌器（日本TOMY 公司）、BSA223S 電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）、GHP 系列隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、UXF30086V 超低溫冰箱（美國(guó)Thermo Fisher 公司）、培養(yǎng)皿（南通蘇品實(shí)驗(yàn)器材有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鼠傷寒沙門(mén)氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)

1.2.1.1 代謝活化系統(tǒng)（S9）

Wistar大鼠，雄性，5～6周齡。多氯聯(lián)苯玉米油溶液（200 g/L）按體重（500 mg/kg）腹腔注射。5 d 后處死大鼠，取肝臟，按GB 15193.4—2014 細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)中大鼠肝S9的制備方法進(jìn)行。

1.2.1.2 增菌培養(yǎng)

各試驗(yàn)菌接種于5 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)條件：37 ℃、100 次/min，10 h。按照要求每毫升菌株培養(yǎng)物中應(yīng)等于或大于1×109～2×109活菌數(shù)。

1.2.1.3 預(yù)試驗(yàn)（點(diǎn)試驗(yàn)法）

受試物劑量設(shè)置為50.00、10.00、2.00、0.40、0.08 g/L 溶液，另外設(shè)置的陰性對(duì)照（滅菌水、DMSO）和陽(yáng)性對(duì)照組。每個(gè)劑量均設(shè)置有代謝活化系統(tǒng)（+S9）和無(wú)代謝活化系統(tǒng)（-S9）兩個(gè)系列，每個(gè)劑量組2個(gè)平行，每皿受試品溶液點(diǎn)樣10 μL。

1.2.1.4 正式試驗(yàn)（平板摻入法）

受試物設(shè)置5 個(gè)劑量組，分別為0.008、0.040、0.200、1.000、5.000 mg/皿；另設(shè)DMSO對(duì)照組、滅菌水陰性對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照組。每個(gè)劑量組都包括+S9和-S9兩個(gè)系列，每個(gè)劑量組3 個(gè)重復(fù)。制備底層培養(yǎng)基平板（10 mL/皿），取2 mL頂層培養(yǎng)基倒入5 mL無(wú)菌EP管中，加入100 μL 配置好的菌液，試驗(yàn)組加10 μL 受試物，未處理對(duì)照組加10 μL 生理鹽水，DMSO 對(duì)照組加入10 μL DMSO，陽(yáng)性對(duì)照組加入相應(yīng)的誘變劑，-S9 組加入500 μL 生理鹽水，+S9 組加入500 μL S9 混合液。混勻頂層培養(yǎng)基，倒入鋪好底層培養(yǎng)基的平板上使其均勻分布，平放凝固后倒置培養(yǎng)，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)菌落數(shù)。

1.2.2 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

50只ICR小鼠，25～35 g，雌、雄各半。受試物設(shè)置1.25 、2.50、5.00 g/kg BW 3 個(gè)劑量組，設(shè)環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組及滅菌水陰性對(duì)照組。給藥2次，間隔24 h。環(huán)磷酰胺對(duì)照組腹腔注射給藥一次。第二次給藥6 h后解剖小鼠，取股骨，用注射器吸取小牛血清沖出骨髓細(xì)胞進(jìn)行推片，待涂片風(fēng)干后使用甲醇固定，姬姆薩染色后鏡檢。每只小鼠計(jì)數(shù)1 000 個(gè)嗜多染紅細(xì)胞（PCE），計(jì)算其中含微核的細(xì)胞數(shù)目，并計(jì)數(shù)200 個(gè)紅細(xì)胞，計(jì)算嗜多染紅細(xì)胞（PCE）與正常紅細(xì)胞（NCE）的比值。

1.2.3 小鼠精子畸變?cè)囼?yàn)

30～35 gICR雄鼠50只，設(shè)置1.25、2.50、5.00 g/kg BW 3個(gè)劑量組，并設(shè)環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組及滅菌水陰性對(duì)照組。灌胃染毒，共給藥5次，每次給藥間隔24 h。陽(yáng)性對(duì)照組按40 mg/kg BW進(jìn)行環(huán)磷酰胺腹腔注射。于第一次給藥后35 d解剖小鼠，取兩側(cè)附睪，在生理鹽水中剪碎并吹打混勻，吸取過(guò)濾后的懸浮液制片，使用甲醇固定，2%伊紅染液染色。在油鏡下觀察精子形態(tài)，每只小鼠檢查精子800條，統(tǒng)計(jì)精子畸變率和畸變種類(lèi)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。兩獨(dú)立樣本之間比較采用t檢驗(yàn)，多組別采用單因素方差分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ames 試驗(yàn)結(jié)果

預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，受試物各劑量組對(duì)5 種試驗(yàn)菌無(wú)明顯抑菌作用。

正式試驗(yàn)結(jié)果顯示，受試物各劑量組中5 種試驗(yàn)菌的菌株表現(xiàn)正常，陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)及各菌株驗(yàn)證試驗(yàn)反應(yīng)符合要求。受試物Ames 試驗(yàn)兩次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1 和表2。由表1 及表2 可知，受試物在每皿0.008～5.000 mg/皿劑量范圍內(nèi)，有或無(wú)S9 時(shí)，5 種試驗(yàn)菌的平均回變菌落數(shù)均在陰性對(duì)照的兩倍以?xún)?nèi)，無(wú)劑量-反應(yīng)關(guān)系，并且兩次重復(fù)結(jié)果一致。

表1 五環(huán)三萜提取物對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)結(jié)果的影響（第一次）

表2 五環(huán)三萜提取物對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)結(jié)果的影響（第二次）

2.2 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

五環(huán)三萜提取物的小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，各試驗(yàn)組嗜多染紅細(xì)胞與正常紅細(xì)胞的比值（PCE/NCE）在0.6～1.2范圍內(nèi)，且陽(yáng)性對(duì)照組微核率顯著高于陰性對(duì)照組，表明本試驗(yàn)方法結(jié)果可靠。五環(huán)三萜提取物各劑量組與陰性對(duì)照組的嗜多染紅細(xì)胞微核率均小于5%，且無(wú)顯著差異性（P＞0.05），表明受試物小鼠骨髓細(xì)胞微試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

表3 五環(huán)三萜提取物對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果

2.3 小鼠精子畸變?cè)囼?yàn)

五環(huán)三萜提取物的小鼠精子畸變率結(jié)果見(jiàn)表4，畸變精子類(lèi)別統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表5。由表4可知，陽(yáng)性對(duì)照組精子畸變率顯著高于陰性對(duì)照組（P＜0.05），表明本試驗(yàn)方法可靠。五環(huán)三萜提取物各劑量組的精子畸變率與陰性對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表4 五環(huán)三萜提取物對(duì)小鼠精子畸變率的影響

表5 五環(huán)三萜提取物對(duì)小鼠精子畸變?cè)囼?yàn)各類(lèi)精子畸變百分率 單位：%

由表5可知，各組間畸變類(lèi)別無(wú)顯著差異（P＞0.05），表明受試物的小鼠精子畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果為陰性。

3 討論

在飼料中添加萜類(lèi)提取物可以增強(qiáng)動(dòng)物的免疫應(yīng)答及抗病能力，在畜禽養(yǎng)殖中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[15]。急性毒性和亞慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，在飼料中添加五環(huán)三萜提取物是相對(duì)安全的[16]。本文采用Ames試驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)及小鼠精子畸變?cè)囼?yàn)，從體外基因突變、體細(xì)胞和生殖細(xì)胞危害3 個(gè)方面對(duì)五環(huán)三萜提取物的致突變作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，進(jìn)一步為五環(huán)三萜提取物作為飼料添加劑的安全性提供依據(jù)。

3.1 五環(huán)三萜提取物對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)結(jié)果的影響

本試驗(yàn)中，在試驗(yàn)劑量下五環(huán)三萜提取物的Ames試驗(yàn)中受試物各劑量組中5 種試驗(yàn)菌的菌株生長(zhǎng)正常，陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)及各菌株驗(yàn)證試驗(yàn)反應(yīng)合格。受試物在各劑量范圍內(nèi)，有或無(wú)S9 時(shí)，5 種試驗(yàn)菌的平均回變菌落數(shù)均在陰性對(duì)照的兩倍以?xún)?nèi)，未見(jiàn)劑量-反應(yīng)關(guān)系，表明五環(huán)三萜提取物不具有致微生物（細(xì)菌）的基因突變作用。Ames 試驗(yàn)是一種在體外進(jìn)行的致突變實(shí)驗(yàn)法，可以快速、便捷地檢測(cè)受試物引起的點(diǎn)突變。菌株（突變型）與受試物接觸，如果菌株（突變型）重新成為野生型菌株，表示其發(fā)生了回復(fù)突變從而體現(xiàn)出受試物具有致突變性。Ames試驗(yàn)結(jié)果的判定是在一種及多種試驗(yàn)菌株得到陽(yáng)性結(jié)果，則認(rèn)為受試物是致突變物；當(dāng)所有試驗(yàn)菌株均得到陰性結(jié)果，認(rèn)為受試物是非致突變物。若在無(wú)活化系統(tǒng)（-S9）時(shí)得到陽(yáng)性結(jié)果，說(shuō)明受試物是直接致突變物。若在有活化系統(tǒng)（+S9）時(shí)為陽(yáng)性結(jié)果，表明受試物是間接致突變物。目前，有研究表明，某些五環(huán)三萜類(lèi)也不具有致突變性，如沙棘葉科羅索酸[17]濃縮物的Ames試驗(yàn)結(jié)果也表明其不具有致突變性[18]。

3.2 五環(huán)三萜提取物對(duì)小鼠骨髓微核細(xì)胞率的影響

本試驗(yàn)中，在試驗(yàn)劑量條件下五環(huán)三萜提取物未增加小鼠骨髓細(xì)胞微核率，表明在該試驗(yàn)條件下五環(huán)三萜提取物不具有對(duì)小鼠體細(xì)胞的遺傳毒性。小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)是用于反映受試物是否會(huì)引起染色體或有絲分裂損傷是否具有體細(xì)胞致突變作用，是從細(xì)胞水平上檢測(cè)受試物是否具有體細(xì)胞遺傳毒性的一種方法。在細(xì)胞的有絲分裂過(guò)程中，無(wú)著絲粒的染色體片段或者因紡錘體受損而丟失的整個(gè)染色體，會(huì)在細(xì)胞分裂后期仍留在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)形成微核。在小鼠骨髓中PCE 數(shù)量較充足，微核易辨別且微核自發(fā)率低因此可作為理想的試驗(yàn)動(dòng)物。有研究發(fā)現(xiàn)，楤木葉中分離出的多種五環(huán)三萜類(lèi)皂苷，在小鼠骨髓微核試驗(yàn)中也表現(xiàn)為無(wú)致突變性，并且能明顯抑制由環(huán)磷酰胺誘發(fā)的小鼠骨髓細(xì)胞的遺傳毒性，表明五環(huán)三萜類(lèi)皂苷可保護(hù)由化學(xué)誘變劑引起的染色體斷裂，具有抗突變作用[19]。

3.3 五環(huán)三萜提取物對(duì)小鼠精子畸變率的影響

在本試驗(yàn)中，在試驗(yàn)劑量下小鼠精子畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果為陰性，表明五環(huán)三萜提取物不具有對(duì)小鼠生殖細(xì)胞的遺傳毒性。小鼠精子畸變?cè)囼?yàn)中精子形態(tài)的改變提示著相關(guān)基因發(fā)生改變，將受試物給予雄性動(dòng)物后，如果受試物具有遺傳毒性會(huì)使精子形態(tài)出現(xiàn)折尾、香蕉頭、無(wú)鉤、胖頭和無(wú)定形頭等變化，從形態(tài)學(xué)角度直接觀察受試物對(duì)精子產(chǎn)生的影響，來(lái)檢測(cè)受試物對(duì)雄性生精細(xì)胞的致突變作用，從而判斷其對(duì)生殖細(xì)胞是否具有潛在的致突變性。人參皂苷屬于三萜類(lèi)皂苷，是人參、刺玫果、黃芪等中藥材中的主要活性成分之一，在對(duì)其進(jìn)行小鼠精子畸變?cè)囼?yàn)發(fā)現(xiàn)其未誘發(fā)小鼠精子畸形率增高不具有致畸作用，活性氧引起的小鼠精原細(xì)胞氧化損傷可以被人參皂苷所緩解[20]。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)中，五環(huán)三萜提取物對(duì)Ames試驗(yàn)、骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)及精子畸變?cè)囼?yàn)的試驗(yàn)結(jié)果表明其不具有致基因突變作用。