耐熱性α-半乳糖苷酶突變體的篩選及酶學性質研究

馬 煥 張秀江 胡 虹 馮 菲 解復紅 向凌云 武艷芳 刁文濤

（1．河南省科學院生物研究所有限責任公司，河南 鄭州 450008；2．河南省工業酶工程技術研究中心，河南 鄭州 450008；3．棕櫚生態城鎮發展股份有限公司，河南 鄭州 450000）

α - 半乳糖苷酶（α -galactosidase， α -gal， EC 3.2.1.22）能夠特異性地水解蜜二糖、水蘇糖、人B 型紅細胞抗原和pNPG等底物，使底物中的非還原性末端α-1,6-半乳糖苷鍵斷裂，釋放位于底物末端的半乳糖殘基。單胃動物腸道內沒有α-半乳糖苷酶，不能吸收利用玉米-豆粕型飼糧中含有的α-半乳糖苷類物質等抗營養因子。將α-半乳糖苷酶作為飼用酶制劑可消除飼料中抗營養因子帶來的不良反應，提高飼料的利用率和單胃動物的進食量[1]。但目前的α-半乳糖苷酶的傳統生產方式主要是從動物、植物中提取和利用微生物發酵進行生產，這些傳統方法普遍存在酶的活性以及生產的效率不高、酶的熱穩定性不好、提取的工藝復雜等問題。在實際工業化飼料生產中，α-半乳糖苷酶受到了耐溫性等方面的約束和限制。

為獲得耐溫性較高的α-半乳糖苷酶，本試驗將改造株鏈球菌（Streptococcus）來源的α-半乳糖苷酶基因Gal27A，重組質粒電轉至畢赤酵母進行高效表達，對耐溫性提高的重組酶進行了酶學性質的初步探討，以期獲得耐高溫的α-半乳糖苷酶，為α-半乳糖苷酶在飼料添加劑中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種來源

大腸桿菌（Escherichiacoli）Top10 感受態細胞由江蘇康為世紀生物科技有限公司提供；畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115細胞、畢赤酵母表達載體pGAPZαA均由武漢淼靈生物科技有限公司提供；α-半乳糖苷酶基因GalA為根據Genebank 中登錄的氨基酸序列（XM_001390670.1），委托華大基因股份有限公司進行密碼子改造后合成。

1.1.2 培養基及相關試劑

YPD 酵母培養基：酵母提取物1%、蛋白胨2%、瓊脂2%，pH值自然。

YPDS培養基：酵母提取物1%、蛋白胨2%、山梨醇18.22%、瓊脂2%，pH值自然。

低鹽LB：酵母提取物0.5%、蛋白胨1%、NaCl 0.5%、瓊脂2%，pH值自然。

MRS肉湯培養基：山梨醇。

處理液：100 mmol/L 醋酸鋰（LiAc）、10 mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT）、0.6 mol/L 山梨醇、10 mmol/L Tris-HCl，pH值7.5。

限制性內切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、Not Ⅰ由美國賽默飛世爾科技公司提供；T4 連接酶、FastPfu DNA 聚合酶、引物GAP-mF、GAP-mF、3'AOX1、博來霉素（zeocin）均由鄭州森美生物技術有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 α-半乳糖苷酶突變質粒的構建

根據Genebank 中登錄的GalA 氨基酸序列（XM_001390670.1）合成α-半乳糖苷酶基因Gal27A[2-3]，并在兩端設計酶位點EcoRⅠ和NotⅠ。對基因和質粒進行雙酶切，利用T4 連接酶進行連接，轉化Top10 感受態細胞[4-5]，涂布于低鹽LB抗性平板（zeocin 30 mg/L），提取重組質粒pGAPZαA-Gal27A。

1.2.2 畢赤酵母GS115感受態的制備

使用滅菌后的牙簽挑取轉化至畢赤酵母的單菌落，接種到YPD（3 mL/管）液體培養基中，30 ℃、180 r/min振蕩培養培養24 h。取3 mL 培養物轉接至YPD 培養基中，30 ℃、180 r/min 充分振蕩5～6 h，OD600nm1.0～1.3 時收集細胞。4 ℃離心收集菌體，沉淀用預冷的無菌水沖洗2 次，離心，25 mL 處理液30 min（室溫），再次4 ℃離心收集菌體，1 mol/L 山梨醇重懸細胞（2 次），8 000 r/min離心10 min。細胞重懸在2 mL的1 mol/L山梨醇溶液中制成感受態細胞，分裝于80 μL/管，-70 ℃保存。

1.2.3 易錯PCR

使用普通的Taq 酶作為聚合酶，將10 mmol/L 的dGTP 和5 mmol/L MnCl2加入反應體系中（50 μL），使MnCl2在PCR反應體系中的終濃度達到0.3～1.0 mmol/L。

將構建的表達質粒pGAPZαA-Gal27A 為模板，進行易錯PCR，反應程序參考文獻[5]。

1.2.4 PCR產物純化

PCR產物切膠回收和沉淀DNA[6-7]：加入1/10倍體積的飽和醋酸鈉（pH值5.3）和3倍體積乙醇，12 000 r/min離心10 min，棄掉上清液；加入200 μL 70%乙醇進行清洗，12 000 r/min 離心10 min，棄掉上清液，在室溫環境中自然晾干，直到乙醇完全揮發，加入10 μL無菌去離子水溶解PCR反應所得到的產物，測定DNA水平[8]。

1.2.5 畢赤酵母轉化

取80 μL GS115 酵母感受態細胞和10 μg 的線性化質粒[8]，兩者混合后轉移至2 mm 電轉杯（4 ℃預冷）中，冰上靜置5 min；電擊至GS115 酵母感受態細胞中[9-10]，設置電壓為1.5 kV，脈沖6 ms（1.5 kV，200 Ω，25 μF）；電擊后加入200 μL 提前4 ℃預冷的1 mol/L 山梨醇溶液中，重懸細胞，從電轉杯中轉移重懸液到1.5 mL 離心管中，30 ℃金屬浴培養1 h；將培養物涂布于YPDS抗性平板上，培養箱30 ℃避光培養3 d。

1.2.6 α-半乳糖苷酶耐熱性突變體的篩選

牙簽挑取平板上長出的單克隆162個，接于5 mL/管YPD 液體培養基中，30 ℃、180 r/min 搖床培養3 d；12 000 r/min離心2 min收集上清液，用上清測定酶活。

1.2.7 α-半乳糖苷酶酶活測定

取1.5 mL離心管，加入稀釋的酶液90 μL和pH值4.5的緩沖液10 μL 及10 mmol/L pNPG 溶液100 μL，水浴65 ℃反應10 min，水中冷卻，加入800 μL 的Na2CO3（0.5 mol/L）溶液終止反應，OD405nm處測定吸光值[11-14]。

α-半乳糖苷酶酶活定義：在一定條件下，每分鐘分解底物（pNPG）生成1 μmoL對硝基苯酚（pNPG）所需的酶量為1個酶活力單位（U）。

1.2.8 酵母基因組DNA的提取

在轉化好的平板上挑取單克隆菌落于1.5 mL 離心管中，加入100 μL裂解液（0.2 mol/L乙酸鋰，1%十二烷基磺酸鈉）后重懸細胞，75 ℃加熱10 min，加入無水乙醇300 μL，用70%乙醇漂洗DNA，離心，放置室溫至無味，加入無菌水50 μL 溶解沉淀，離心5 min，以上清液為模板進行PCR 反應。挑選耐熱突變體保溫前后的酶活比高于野生型的單克隆，在實驗室進行PCR 檢測，檢測成功的PCR產物送至華大基因進行測序。

1.3 酶學性質研究

1.3.1 最適溫度及溫度穩定性的測定

在最適pH 值6.5 條件下，按1.2.7 方法測定不同溫度（30～80 ℃）下的α-半乳糖苷酶，以酶活最高者為100%，計算相對酶活力。

酶液分別置于不同水?。?0～80 ℃），保溫10 min，冷卻，測定α-半乳糖苷酶的殘余酶活力，根據酶活力計算相對酶活力，以未經溫度處理的酶活為100%，計算相對酶活力。

1.3.2 最適pH值和pH值穩定性的測定

分別以磷酸二氫鉀-檸檬酸配制一系列的緩沖液，pH 值分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0 的緩沖液。酶液使用不同pH 值的緩沖液稀釋，在最適溫度65 ℃條件下測定α-半乳糖苷酶活力，以酶活最高者為100%，計算相對酶活力。

將酶液與不同pH值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0）的緩沖液混合，冰上處理1 h，測定α-半乳糖苷酶的殘余酶活力，以酶活力最高者是100%，計算相對酶活力。

1.3.3 金屬離子對酶活力的影響

在α-半乳糖苷酶反應體系中加入Mg2+、K+、Na+、Fe3+、Al3+、Ca2+、Cu2+、Ag2+、Mn2+、EDTA（終濃度為1 mmol/L），測定α-半乳糖苷酶的殘余酶活，以未加金屬離子的酶活力為100%，計算酶活力保留率。

2 結果與討論

2.1 α-半乳糖苷酶表達質粒的構建結果（見圖1）

圖1 質粒pGAPZαA-Gal27A酶切檢測結果

由圖1 可知，表達質粒pGAPZαA-Gal27A 構建成功。

2.2 易錯PCR體系中MnCl2濃度（見圖2）

圖2 pGAPZαA-Gal27A易錯PCR中MnCl2濃度

PCR 體系中加入dGTP（終濃度為0.5 mmol/L）和MnCl2（終濃度分別為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mmol/L）。由圖2 可知，0.3、0.4 mmol/L 試驗的PCR產物中均有明顯pGAPZαA-Gal27A條帶。

2.3 質粒pGAPZαA-Gal27A易錯PCR（見圖3）

圖3 質粒pGAPZαA-Gal27A易錯PCR

由圖3可知，易錯PCR產生了特異性的PCR條帶。

2.4 耐熱突變體工程菌的構建

將PCR 產物純化后電轉化至畢赤酵母GS115 中，在含100 mg/L zeocin 的YPDS 平板上篩選陽性克隆，并對所有克隆的發酵液的α-半乳糖苷酶耐熱性進行檢測[15]。

2.5 α-半乳糖苷酶耐熱突變體酶活測定

根據標準曲線和酶活定義[11,16-17]將篩選出的耐熱突變體29 和54 在55 ℃保溫10 min，保溫前酶活為12.086、16.861 U/mL，保溫后的酶活為2.438、3.273 U/mL，保溫前后保留酶活比分別為20.21%和19.41%，野生型菌株55 ℃保溫10 min后保留酶活比為13.12%，相比較得出加熱前后的保留酶活比增幅大于45%。

2.6 突變體轉化子的驗證

pGAPZαA-Gal27A易錯PCR結果見表1。

表1 PCR引物

pGAPZαA-Gal27A易錯PCR結果見圖4。由圖4基因組PCR 產物瓊脂糖凝膠結果可見分子量正確的特異性PCR條帶，說明Gal27A已經成功重組進酵母基因組中。

圖4 pGAPZαA-Gal27A易錯PCR結果

對PCR產物進行測序，基因突變結果見表2。

表2 基因突變結果

由表2 可知，29 號和54 號的堿基突變率分別為0.017 5%、0.292%[18-19]，收集重組菌的發酵液，研究其酶學性質。

2.7 重組酶的酶學性質分析

2.7.1 溫度對重組酶活性和穩定性的影響（見圖5）

圖5 溫度對重組酶活性和穩定性的影響

由圖5 可知，溫度為35～60 ℃，相對酶活力穩定在45%～80%，期間相對酶活隨著溫度上升而增加；65 ℃保溫10 min，相對酶活力達最高90%；65 ℃后，相對酶活力呈下降趨勢；80 ℃保溫10 min，相對酶活力保持在35%左右，表明該重組酶的最適溫度為65 ℃。

溫度從35 ℃緩慢上升至55 ℃，相對酶活力變化不大；溫度為60 ℃時，相對酶活力下降至48%，相比55 ℃時下降了40%；隨著溫度增加，相對酶活力也隨之下降；80 ℃時，相對酶活力為10%。

2.7.2 pH值對重組酶活性和穩定性的影響（見圖6）

圖6 pH值對重組酶活性和穩定性的影響

由圖6 可知，該酶的最適pH 值是6.5。pH 值3.5～7.5時，相對酶活力隨著pH值增加而增加，說明該酶具有較廣泛的pH值范圍。

2.7.3 金屬離子對重α-半乳糖苷酶活力的影響（見表3）

表3 金屬離子對重α-半乳糖苷酶活力的影響

由表3可知，金屬離子Ag2+、Hg2+對該重組酶具有較強的抑制作用，Mg2+、Ca2+、K+和EDTA對酶活力影響不大，Cu2+和Na+對該酶具有一定的促進作用，以Cu2+的促進作用較為明顯。

3 討論

自然界中產α-半乳糖苷酶的微生物很多，原菌發酵產酶的產量高低不一，部分還需要特定的誘導條件，低產量和高成本使得該方法不適用于工業化生產，工程菌相較具有較大的優勢[18]。找到高表達且活性高的α-半乳糖苷酶基因，并進行克隆表達的方法受到了國內外研究者的青睞。國內外對這一方面的研究已取得一定進展，α-半乳糖苷酶基因工程表達系統主要有大腸桿菌、酵母、枯草芽孢桿菌和昆蟲等。但由于大腸桿菌缺乏對真核蛋白質的修飾加工系統，細胞周質含有多種內毒素等缺點不利于進行真核生物源蛋白的表達。目前，利用畢赤酵母、生產α-半乳糖苷酶的研究較多，如來自Bisporasp.MEY-1、Penicilliumsp. F63、Rhizomucormiehei等的α-半乳糖苷酶基因均已在酵母中實現了有效的胞外表達，在甲醇誘導96 h 后，利用pNPG 法測定的酶活分別為105、111、240 U/mL[19]。

在飼料中添加α-半乳糖苷酶可解決豆粕型飼料中抗營養因子（多聚糖和低聚糖等）的問題，對提高豆粕蛋白能量利用率及有改善消化均具有較明顯的效果。酶在加工應用過程中先經受原料混合、加工高溫制粒后才能夠在動物胃腸道溶解發生作用，因此酶制劑的溫度和穩定性備受關注[20]。

本試驗以提高α-半乳糖苷酶的耐熱性為目的，圍繞篩選出α-半乳糖苷酶的耐熱性突變體，解決α-半乳糖苷酶在高溫下易喪失活性甚至失活這一問題。本試驗通過構建表達質粒pGAPZαA-Gal27A，控制MnCl2濃度，利用易錯PCR技術擴增使其堿基發生錯配，將易錯PCR過程完成后的表達質粒pGAPZαA-Gal27A 通過電轉化的方法導入感受態的畢赤酵母GS115 表達系統，利用畢赤酵母表達系統對其進行了重組表達。溫度在35～55 ℃之間較穩定，相對酶活力一直穩定在90%以上；溫度大于55 ℃，相對酶活力下降迅速；當溫度達到80℃時，相對酶活力僅為10%，可見該酶的溫度穩定性較差。該酶最適pH 值是6.5，pH 值在4.0～7.0 范圍內相對酶活力較高，但是該酶的pH 值應用范圍不是很廣。Heravi 等[21]克隆了一種來自TalaromycesleycettanusJCM12802 的新型α-半乳糖苷酶基因也實現了酵母表達，但是與本試驗結果相對比，本試驗篩選出的突變體不具有更高的耐溫性和pH值廣泛性。

4 結論

本試驗通過易錯PCR 對基因進行定點突變的方法，獲得了兩個株鏈球菌（Streptococcus）來源的α-半乳糖苷酶Gal27A 的耐熱突變體，分別是29 號和54 號耐熱突變體。對應這兩個突變體的氨基酸T32A、N16D、N44S、E412G 有突變時，測定α-半乳糖苷酶酶活并與野生型對比，結果顯示在耐熱性方面顯著提升。使用畢赤酵母系統對該酶進行了異源表達，該酶具有良好的酶學性質，該酶的最適反應溫度是65 ℃，65 ℃以下保溫1 h，相對酶活力保留達到75%以上，說明該酶在30～65 ℃的熱穩定性較好。最適pH 值是6.5，pH 值在4.0～7.0 時可保持35%以上的對酶活力。本研究中的耐高溫突變體文庫具有較好的酶學性能。