響應面優化核桃青皮總黃酮提取工藝及其抗氧化活性研究

盧 俊

（廣西工業職業技術學院輕工化工學院，廣西 南寧 530001）

核桃（JuglansregiaL.）又名胡桃、羌桃，胡桃科胡桃屬落葉喬木植物，是一種傳統的經濟樹種[1-2]。核桃果實營養價值豐富[3-4]。核桃青皮是核桃果實采摘后的副產品，往往作為垃圾被扔掉，造成資源浪費及環境污染。研究表明，核桃青皮含有豐富的氨基酸、黃酮、多糖、揮發油、生物堿等活性成分[5-7]，具有抗氧化、降血糖血脂、抑菌活性等藥理功效[8-10]。因核桃青皮總黃酮具有多種生物學活性[11-12]，將核桃青皮作為功能型飼料，具有廣闊的應用前景。馬菁菁等[13]研究發現，在雞飼糧中添加核桃青皮黃酮粗提物可有效提升肉雞生產性能及抗氧化功能。吳瑩等[14]研究發現，在基礎日糧中添加核桃青皮黃酮類化合物可以提高動物的免疫力。本試驗以核桃青皮為研究對象，采用超聲波輔助法提取核桃青皮中總黃酮含量，考察4 個單因素對核桃青皮總黃酮得率的影響，應用Box-Behnken 響應面設計法優化其最優提取工藝條件，為核桃青皮總黃酮提取工業化生產及其資源開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃青皮由廣西農業科學院經濟作物研究所提供。蘆丁標準品購自上海同田生物技術股份有限公司，二苯基苦基肼自由基購自廣州皓安生物科技有限公司，維生素C（VC）購自北京華邁科生物技術有限責任公司，硝酸鋁（分析純）購自沈陽從科化工有限公司，氫氧化鈉（分析純）購自濟南榮正化工有限公司，乙酸鉀（分析純）購自山東旭祥化工有限公司，無水乙醇（分析純）購自西安天茂化工有限公司，水為《分析實驗室用水規格和試驗方法》（GB/T 6682—2008）規定一級水。

1.2 儀器設備

UV759CRT 紫外分光光度計購自青島聚創華業分析儀器有限公司，ESJ208-S沈陽龍騰電子分析天平購自沈陽龍騰電子有限公司，DFY-200A 汗諾搖擺式粉碎機購自上海達洛科學儀器有限公司，JM-16D-80 超聲清洗機購自廣東潔盟超聲實業有限公司，TQR5-S臺式冷凍離心機購自湖南長沙市鴻運儀器公司，60 目標準試驗篩購自上海過望化工有限公司，TWS-12 電熱恒溫水浴鍋購自上海勞達貿易有限公司，B1140 得利特超純水機購自北京得利特科技有限公司。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 核桃青皮總黃酮提取工藝流程

核桃鮮果→果皮分離得到核桃青皮→將核桃青皮晾干→粉碎→80 目篩網過篩→將核桃青皮粉末脫脂→稱取脫脂樣品進行超聲輔助提取→離心→濃縮上清液→黃酮粗提液。

1.3.2 蘆丁標準曲線的繪制

將烘干至恒重的蘆丁標準品用70%乙醇超聲輔助溶解，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法[15-16]繪制標準曲線。準確稱取蘆丁標準品0.050 g（精確至0.001 g）于1 000 mL棕色容量瓶中，使用70%的乙醇定容至刻度，搖勻，即得質量濃度為0.05 g/L 的蘆丁標準中間儲備液。使用移液槍分別吸取蘆丁標準中間液0.20、0.40、0.80、1.60、3.20、5.00 mL 置于6 支10 mL 棕色容量瓶中，依次加入6% NaNO2溶液2 mL，旋渦振蕩搖勻，靜置10 min；加入12% Al(NO)3溶液1 mL，旋渦振蕩搖勻，靜置15 min；加入4% NaOH 溶液2 mL，充分搖勻，靜置6 min；以70%乙醇溶液定容至刻度，得到質量濃度分別為0.001、0.002、0.004、0.008、0.016、0.025 g/L 的標準曲線工作液。以空白試劑作對照，在510 nm處測定溶液的吸光度，以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，線性回歸方程Y=0.8761X+0.1545，R2=0.999 8。

1.3.3 核桃青皮總黃酮的提取及含量的測定

將自然晾干的核桃青皮粉碎，過80目篩，取適量樣品粉末，使用石油醚回流脫脂處理；準確稱取已脫脂處理的核桃青皮粉末樣品1.000 g（精確至0.001 g）于50 mL 具塞離心管中，在超聲輔助提取儀中按照液料比20 mL/g 加入70%乙醇溶液作為提取溶劑，60 ℃提取40 min，提取完畢后于8 000 r/min 離心20 min，將上清液移至250 mL棕色容量瓶中。殘渣以相同條件提取2次，合并提取液，使用70%乙醇溶液定容至刻度，即得核桃青皮總黃酮粗提液。

準確吸取1 mL核桃青皮總黃酮粗提液于10 mL棕色容量瓶中，按照標準曲線工作液的條件顯色，在相同波長下測定吸光度，將吸光度值代入蘆丁標準曲線計算黃酮含量。

式中：X為核桃青皮總黃酮含量（%）；c為標準曲線計算得到待測試樣液總黃酮的數值（g/L）；V為提取液體積（mL）；D為稀釋倍數；m為試樣的質量（g）。

1.3.4 單因素試驗

分別考察乙醇濃度、液料比、浸提溫度、浸提時間等4 個單因素對核桃青皮總黃酮提取得率的影響。核桃青皮總黃酮提取的單因素水平設計見表1。

表1 核桃青皮總黃酮提取的因素水平設計

1.3.5 響應面試驗設計

根據單因素試驗結果，設置4 個因素為自變量，核桃青皮總黃酮提取得率為因變量，為優化核桃青皮總黃酮提取工藝參數，采用Box-Behnken軟件設計4因素3水平響應面試驗，響應面試驗因素水平設計見表2。

表2 響應面試驗因素水平設計

1.3.6 核桃青皮總黃酮體外抗氧化活性試驗

1.3.6.1 DPPH自由基清除率

參考文獻[17]至文獻[18]，準確稱取二苯基苦基肼（DPPH）10 mg 于100 mL 棕色容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，超聲輔助溶解，配成100 mg/L DPPH 儲備液于2～4 ℃環境中儲存。用無水乙醇將核桃青皮總黃酮提取液分別稀釋為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的樣品溶液。精確吸取2.0 mL 樣品溶液于6 支10 mL 棕色容量瓶中，分別加入2 mL的100 mg/L DPPH 儲備液，定容搖勻，置于黑暗處靜置30 min 于510 nm 處測定吸光度A1；取相同體積核桃青皮總黃酮提取液，以無水乙醇代替DPPH 儲備液，按照上述方法處理后在510 nm 處測定吸光度A2；以2.0 mL 無水乙醇代替核桃青皮總黃酮提取液，加入2 mL 100 mg/L DPPH 儲備液，按照上述方法處理后在510 nm 處測定其吸光度A0；以VC 為陽性對照，精密稱取一定量的VC標準品配制成相應濃度，操作方法同樣品組。計算核桃青皮總黃酮提取液對DPPH 自由基清除率。

1.3.6.2 羥自由基清除率

參考文獻[19]至文獻[20]，取6支10 mL棕色容量瓶，分別加入0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L核桃青皮總黃酮提取液各2.0 mL。依次加入6 mmol/L FeSO4溶液2.0 mL、8 mmol/L 水楊酸溶液2.0 mL、8.8 mmol/L H2O2溶液2.0 mL，充分搖勻，置于37 ℃水浴鍋中反應30 min，以蒸餾水調零，將樣品反應液于510 nm處測定吸光度A1；取相同體積核桃青皮總黃酮提取液，以蒸餾水代替H2O2，按照上述方法處理后在510 nm處測定吸光度A2；以蒸餾水代替核桃青皮總黃酮提取液，其他條件不變，在510 nm處測定其吸光度A0；以VC為陽性對照，精密稱取一定量的VC標準品配制成相應質量濃度，操作方法同樣品組。計算核桃青皮總黃酮提取液對羥自由基清除率。

1.4 數據統計與分析

采用Design-Expert 10.0 進行響應面設計和分析，每組試驗重復3次，以平均值表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇濃度對核桃青皮總黃酮提取得率的影響（見圖1）

圖1 乙醇濃度對核桃青皮總黃酮得率的影響

由圖1 可知，總黃酮提取得率隨著乙醇濃度的增加呈先增加后降低趨勢。當乙醇濃度為70%時，核桃青皮總黃酮提取得率達到最大值4.81%。原因可能是乙醇濃度較低時，水分含量相對較高使樣品中總黃酮未能完全溶解，從而導致總黃酮提取得率較低[21]；當乙醇濃度過高則極性降低，樣品中脂溶性和醇溶性物質溶出，使黃酮提取得率有所降低。因此選擇乙醇濃度為70%為宜。

2.1.2 液料比對核桃青皮總黃酮提取得率的影響（見圖2）

圖2 液料比對核桃青皮總黃酮得率的影響

由圖2 可知，隨著液料比逐漸增大，核桃青皮總黃酮的提取得率隨著溶劑增多而逐漸增大，當液料比達到20 mL/g，核桃青皮總黃酮的提取得率增速趨于平緩。原因是逐漸增加提取溶劑的體積有利于擴大樣品與提取溶劑的接觸面積，更有利于樣品中總黃酮溶出，故液料比低于20 mL/g時，核桃青皮總黃酮的提取得率隨著液料比的增加而急劇增加；但液料比高于20 mL/g時，樣品中總黃酮已基本完全溶出，故樣品中總黃酮提取得率增長緩慢。因此，從經濟以及節約資源角度考慮，選擇液料比為20 mL/g為宜。

2.1.3 浸提溫度對核桃青皮總黃酮提取得率的影響（見圖3）

圖3 浸提溫度對核桃青皮總黃酮得率的影響

由圖3 可知，隨著浸提溫度的逐漸增加總黃酮得率呈先增大后降低的趨勢；當浸提溫度為60 ℃時，總黃酮提取得率達到最大值4.97%；繼續增加浸提溫度黃酮提取得率反而降低。原因是在一定浸提溫度范圍內升溫會導致黃酮類化合物分子擴散速率加快，從而有利于增大其溶解度，故在一定范圍內隨著浸提溫度的升高總黃酮提取得率也呈上升趨勢[22]；但當浸提溫度達到一定時，繼續增加浸提溫度，黃酮類化合物會在高溫下被破壞，使提取得率有所降低。因此浸提溫度選擇60 ℃為宜。

2.1.4 浸提時間對核桃青皮總黃酮提取得率的影響（見圖4）

圖4 浸提時間對核桃青皮總黃酮得率的影響

由圖4 可知，隨著浸提時間的延長核桃青皮總黃酮得率呈先增加后降低趨勢。當提取時間為40 min 時總黃酮提取得率達到最大值4.79%。原因可能是延長超聲波的作用，可以使植物細胞結構破壞率增加，使更多的總黃酮從核桃青皮中溶出，故總黃酮得率增加。當浸提時間大于40 min 時，繼續延長浸提時間，總黃酮得率呈下降趨勢。原因可能是樣品長時間處于超聲波作用下，超聲輔助提取儀產生的機械作用和空化效應會對總黃酮結構造成一定程度的破壞，從而導致總黃酮得率下降[23]。因此選擇浸提時間為40 min為宜。

2.2 響應面優化及方差分析結果

2.2.1 響應面試驗結果（見表3）

表3 響應面試驗結果

利用Design-Expert 10.0 軟件對表3 數據進行方差和模型的顯著性分析，得到回歸模型方程為：Y=5.41+0.011A+0.063 0B+0.19C+0.21D-0.002 5AB-0.025 0AC+0.037AD-0.11BC+0.053BD+0.082CD-0.31A2-0.14B2-0.26C2-0.28D2。

回歸模型的方差分析結果見表4。由表4的回歸分析結果可知，模型的F值為44.14（P＜0.000 1），失擬項為3.30（P＞0.05），表明模型擬合度較好[24-26]。模型的校正決定系數RAdj2=0.971 2，表明該模型可以解釋黃酮得率的變化有97.12%來自乙醇濃度、液料比、浸提溫度和浸提時間。因此用該模型能較好地預測和分析核桃青皮總黃酮的提取工藝。由F值可知，4個單因素對黃酮得率影響排序為浸提時間（D）＞浸提溫度（C）＞液料比（B）＞乙醇濃度（A）。響應面分析可知，CD具有顯著影響（P＜0.05），B、C、D、BC、A2、B2、C2、D2具有極顯著影響(P＜0.01)。

表4 回歸模型的方差分析結果

2.2.2 因素交互作用對核桃青皮總黃酮得率的影響（見圖5）

圖5 各因素交互作用對核桃青皮總黃酮得率的影響

相應面越陡峭、等高線圖呈橢圓形表明兩交互作用對黃酮提取得率影響越顯著[27-29]。

由圖5 可知，交互項BC 和CD 的響應曲面坡度較為陡峭，且等高線呈橢圓，表明液料比與浸提溫度、浸提溫度與浸提時間對核桃青皮總黃酮得率影響達到顯著水平或極顯著水平，與表4方差分析結果一致。

2.2.3 回歸模型最優試驗組合驗證

通過響應面軟件得到核桃青皮總黃酮提取得率模型預測的最優參數工藝為乙醇濃度68.87%、液料比19.7 mL/g、浸提溫度62.5 ℃、浸提時間38.89 min，模型預測核桃青皮總黃酮提取得率為6.02%。為方便試驗操作，確定最終工藝參數條件為乙醇濃度70%、液料比20 mL/g、浸提溫度60 ℃、浸提時間40 min，實際測得核桃青皮總黃酮提取得率為6.13%，與預測值相近，說明回歸模型對核桃青皮總黃酮提取得率預測結果準確可靠。

2.3 抗氧化活性結果分析

2.3.1 核桃青皮總黃酮對DPPH 自由基的清除能力（見圖6）

圖6 核桃青皮總黃酮對DPPH自由基的清除能力

由圖6 可知，核桃青皮總黃酮與VC 對DPPH 自由基的清除能力隨著質量濃度的增加呈上升趨勢，核桃青皮黃酮對DPPH自由基的清除能力相對VC整體稍低。當核桃青皮總黃酮濃度為1.0 g/L 時，對DPPH 自由基的清除率為94.98%，與等質量濃度的VC對DPPH自由基的清除能力相近。因此，核桃青皮總黃酮對DPPH 自由基具有較強的清除能力。

2.3.2 核桃青皮總黃酮對羥自由基清除能力（見圖7）

圖7 核桃青皮總黃酮對羥自由基的清除能力

由圖7 可知，核桃青皮總黃酮對羥自由基清除率隨著質量濃度的增加上升趨勢。當核桃青皮總黃酮濃度為1.0 g/L 時，對羥自由基的清除率為89.89%，略低于同濃度下的VC對羥自由基的清除能力。因此，核桃青皮總黃酮對羥自由基具有一定的清除能力。

3 結論

本研究表明，核桃青皮總黃酮的最佳提取工藝參數為乙醇濃度70%、液料比20 mL/g、浸提溫度60 ℃、浸提時間40 min，實際測得核桃青皮總黃酮提取得率6.13%，與預測值相近，說明回歸模型準確可靠。體外抗氧化活性研究表明，質量濃度為1.0 g/L 的核桃青皮總黃酮提取液對DPPH 自由基和羥自由基清除率分別為94.98%、89.89%，略低于同質量濃度的VC 的抗氧化能力，但仍表現出較好的抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑應用。