枯草芽孢桿菌和復合酶制劑對紫花苜蓿青貯品質的影響

孫 宇 楊燕燕 吳春會 祖曉偉 王明亞 李秋鳳

（1．河北農業大學動物科技學院，河北 保定 071000；2．河北省畜牧總站，河北 石家莊 050000）

紫花苜蓿是奶牛的優質飼草，但受雨季影響，苜蓿干草調制受到制約[1]，因此可以對紫花苜蓿進行青貯保存。但苜蓿中水溶性碳水化合物不足，緩沖能力高，附生乳酸菌數量少，青貯苜蓿的條件并不理想[2]。在青貯飼料中添加微生物可保證青貯飼料的優良品質。許多研究使用布氏乳桿菌和一些有機酸提高青貯品質，枯草芽孢桿菌也被用作微生物青貯飼料添加劑，以抑制好氧腐敗并增加青貯飼料的體外消化[3]。

枯草芽孢桿菌可產生纖維素酶，這些酶可通過水解植物細胞壁增加可溶性糖的釋放，從而提高乳酸生產速率[4]。枯草芽孢桿菌產生的多肽和抗真菌化合物可以抑制酵母和絲狀真菌等不良微生物生長，防止青貯飼料變質和真菌毒素產生[5]。因此，枯草芽孢桿菌被認為是一種有效的青貯飼料添加劑。Gandra 等[6]研究表明，添加枯草芽孢桿菌能夠顯著增加青貯甘蔗中乙酸的含量，同時降低丁酸含量。李立波等[7]研究發現，枯草芽孢桿菌可顯著降低玉米秸稈中木質纖維素，提高蛋白質含量，從而改善玉米秸稈的營養品質。在青貯過程中，添加酶制劑也有利于發酵，酶可將植物細胞壁的結構性多糖降解為單糖，為乳酸菌提供發酵底物，加速發酵，達到抑制梭酸菌發酵的目的。復合酶制劑含有多種酶，對青貯可能有一定的促進效用。本試驗擬在苜蓿青貯中添加不同濃度的枯草芽孢桿菌和復合酶制劑，對其發酵品質和營養品質進行測定分析，旨在篩選出適合苜蓿青貯的添加量，提高青貯品質，為畜牧生產中苜蓿青貯技術的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紫花苜蓿：中苜2 號，現蕾期，第一茬，晾曬至水分含量55%，留茬高度7～8 cm，鍘短長度為2～3 cm。紫花苜蓿營養成分見表1。

表1 紫花苜蓿營養成分（風干基礎） 單位：%

復合酶制劑含有復合酶、GE 生物制劑、植物甾醇、天然植物提取物、微生態制劑、有機微量元素等由河北草酶生物科技有限公司與武漢亞維微生物科技有限公司提供。枯草芽孢桿菌的有效活菌數≥10.0億/g，購自河南土好金生物科技有限公司。

1.2 試驗設計

采用4×3雙因素設計，每個處理3個重復。A0組不添加枯草芽孢桿菌，A1組添加0.1%枯草芽孢桿菌，A2組添加0.2%枯草芽孢桿菌，A3組添加0.3%枯草芽孢桿菌，B0 組不添加復合酶制劑，B1 組添加0.1%復合酶制劑，B2 組添加0.2%復合酶制劑（均以鮮重為基礎）。本試驗采用200 mm×300 mm 聚乙烯袋真空青貯，每袋裝青貯原料1.5 kg，且將不同的添加劑均勻噴灑于青貯原料中，于室內常溫青貯45 d。

1.3 試驗方法

袋開袋后，將青貯飼料均勻混合，稱取20 g 青貯樣和180 mL 蒸餾水一起放入榨汁機，榨汁1 min 左右后過濾汁液，使用4 層紗布過濾，將所得濾液用定性濾紙過濾至干凈的燒杯中。將濾液分裝為兩部分，一部分濾液為備用樣，放入-20 ℃冰箱中保存，另一部分濾液用于測定發酵指標pH 值及氨態氮（NH3-N）、乳酸（LA）、乙酸（AA）含量。采用pH測定儀測定pH值，比色法測氨態氮（NH3-N）含量，氣相色譜測定LA和揮發性脂肪酸（VFA）。

將剩余青貯樣品收集，烘干后粉碎過10 目和40 目篩，用于測定青貯營養品質。參照《飼料分析及飼料質量檢測技術》[8]，測定青貯中DM、CP、EE、Ash、NDF、ADF、WSC含量。

1.4 感官評定

采用德國農業協會（DLG）的飼料評價方法從青貯飼料的氣味、結構、色澤等方面進行感官評定，共分為4 個等級：1 級（20～16 分）、2 級（15～10 分）、3 級（9～5分）、4級（4～0分）[9]。

1.5 隸屬函數評價方法

采用隸屬函數評價法對不同處理青貯苜蓿的各指標進行評價，得出最佳處理。

式中：UX(+)為各指標呈正相關隸屬函數值；UX(－)為各指標呈負相關隸屬函數值；X為某樣品某指標平均測定值；Xmax為某樣品某指標最大測定值；Xmin為某樣品某指標最小測定值[10]。

1.6 數據統計與分析

試驗數據采用Excel 軟件進行初步處理，SPSS 23.0軟件進行方差分析，Duncan's 法進行多重比較。結果以“平均值±標準差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌和復合酶制劑對苜蓿青貯感官評定的影響（見表2）

表2 枯草芽孢桿菌和復合酶制劑對苜蓿青貯感官評定的影響

由表2 可知，A2+B2 組青貯的得分最高，A0+B0 組得分最低。12 個處理組中，A0+B1 組、A1+B1 組、A1+B2 組、A2+B2 組、A3+B2 組得分均在16～20 之間，評定為等級1，其氣味芳香，無丁酸臭味；其余處理組評定為等級2，芳香味弱，有較強的酸味。A0+B0組、A0+B2組和A1+B0 組的葉子結構保存較差，其他處理組莖葉結構保持良好。各處理組的色澤均稍有變色，呈褐色。

2.2 枯草芽孢桿菌和復合酶制劑對苜蓿青貯營養品質的影響（見表3）

由表3 可知，枯草芽孢桿菌與復合酶制劑處理對苜蓿青貯CP和EE含量具有顯著的交互影響（P＜0.05）。

添加復合酶制劑對苜蓿青貯Ash、CP、EE和NDF含量具有顯著影響（P＜0.05）。與B0 組相比，添加復合酶制劑顯著增加了Ash和CP的含量（P＜0.05）。

添加枯草芽孢桿菌對苜蓿青貯DM、CP、NDF、ADF 和WSC 含量具有顯著影響（P＜0.05）。添加不同劑量的復合酶制劑時，A3 組DM 含量均顯著高于A0、A1組（P＜0.05）。

在B2 水平上，A2 組的CP 含量顯著高于A1 和A3 組（P＜0.05），A1 組ADF 含量顯著低于其他各組（P＜0.05）。各復合酶制劑添加水平下，苜蓿青貯WSC含量均隨著枯草芽孢桿菌添加量增加而顯著降低（P＜0.05）。

2.3 枯草芽孢桿菌和復合酶制劑對苜蓿青貯發酵品質的影響（見表4）

由表4 可知，枯草芽孢桿菌和復合酶制劑對苜蓿青貯的pH 值具有顯著交互作用（P＜0.05）。添加復合酶制劑和枯草芽孢桿菌對苜蓿青貯的pH 值、NH3-N 均具有顯著影響（P＜0.05），添加復合酶制劑對苜蓿青貯的AA含量具有顯著影響（P＜0.05），而添加枯草芽孢桿菌對LA 含量具有顯著影響（P＜0.05）。在不同復合酶制劑添加水平下，A3 組NH3-N 的含量顯著高于A0 和A1 組（P＜0.05），且NH3-N 含量隨著枯草芽孢桿菌添加量的增加呈顯著上升趨勢（P＜0.05）。在B1水平下，A3組的LA含量顯著高于A2組（P＜0.05）。

2.4 隸屬函數分析及綜合價值排序（見表5）

表5 隸屬函數分析及綜合價值排序

由表5 可知，DM、CP、EE、WSC、LA、AA 為正向指標，Ash、pH值、NH3-N、NDF、ADF為負向指標。對各處理組指標的函數值平均并排序，平均值越大，排序越靠前，表示其綜合價值最高。各處理組的排序為A2+B2 組＞A1+B2 組＞A3+B2 組＞A1+B1 組＞A0+B1 組＞A3+B0 組＞A2+B1 組＞A0+B2 組＞A2+B0 組＞A1+B0 組＞A3+B1組＞A0+B0組。

3 討論

3.1 枯草芽孢桿菌和復合酶制劑對苜蓿青貯感官評定的影響

青貯飼料的青貯品質不同，其氣味、色澤、質地、結構等外形特征也存在差異，氣味芳香、色澤與青貯原料相近、莖葉結構完整的青貯飼料，適口性更好。本研究中，各處理組苜蓿青貯在色澤和結構上差異不大，添加0.2%枯草芽孢桿菌與0.2%復合酶制劑的青貯苜蓿感官評價均優于其他處理組，無霉變，具有芳香味，色澤呈褐色，結構良好，屬于優質飼料。對照組芳香味弱，具有較強的酸味，葉片保存不良，屬于2級青貯飼料。

3.2 枯草芽孢桿菌和復合酶制劑對苜蓿青貯營養品質的影響

DM 和CP 含量是評價青貯飼料營養成分的重要指標[11]。本研究結果表明，苜蓿青貯的DM 含量隨著枯草芽孢桿菌添加量的增加而升高。Yang 等[12]指出，枯草芽孢桿菌大量繁殖可產生多種次級代謝產物和菌體蛋白，這可能是DM 含量增加的原因。本研究中，添加復合酶制劑組CP 含量有一定的提升，且CP 含量隨著復合酶制劑添加量的增加呈上升趨勢，可能是由于復合酶制劑中的多種酶及營養物質為乳酸菌提供了發酵底物，且補充了少量蛋白，其中添加0.2%復合酶制劑處理組的效果最好。本試驗中，枯草芽孢桿菌添加量為0.2%的處理組CP含量高于添加量為0.1%和0.3%的處理組，可能是由于枯草芽孢桿菌添加量為0.2%時，青貯飼料中的營養物質能夠滿足枯草芽孢桿菌的快速繁殖，且枯草芽孢桿菌產蛋白酶能力強，還能夠分泌多種酶系，各種酶相互協同作用生成一定量的CP[13]，提高青貯飼料中CP 含量，與張艷萍等[14]研究結果相似。NDF和ADF是反映飼料飼用價值的重要指標，DNF和ADF含量越低，動物對其消化率越高，飼用價值越大[15]。本研究中，添加0.1%枯草芽孢桿菌組的NDF和ADF含量雖有降低，但與未添加組相比差異不顯著，與萬榮等[16]研究結果相似，表明復合酶制劑對NDF、ADF無降解作用。

3.3 枯草芽孢桿菌和復合酶制劑對苜蓿青貯發酵品質的影響

青貯主要通過乳酸菌厭氧發酵產生LA 及少量AA，使pH值短時間內快速降低，抑制其他微生物的繁殖與代謝，從而達到青貯效果，降低飼料的營養損失，延長保質期限[17]。因此，發酵品質直接反映了青貯品質，而發酵品質中乳酸含量、pH值及丙酸含量是決定發酵品質的關鍵指標。鄒詩雨等[18]研究表明，乳酸含量越高，丙酸含量和pH值越低，能夠有效抑制發酵過程中有害微生物的繁殖，保障青貯發酵成功。pH值是評定青貯發酵品質的關鍵指標[19]，pH值低有助于乳酸菌的快速發酵，從而抑制有害菌生長，減緩蛋白質降解，減少丙酸（PA）、丁酸（BA）等物質生成[20]。優質青貯飼料pH 值在4.2～4.8之間為良好，4.8以上則認為發酵品質較差[21]。本研究中，添加0.1%復合酶制劑或同時添加0.1%復合酶制劑和0.1%枯草芽孢桿菌的處理組pH值較理想。

NH3-N含量能夠反映青貯過程中蛋白質的降解情況，蛋白質降解越嚴重，NH3-N 含量越高，不利于優質青貯飼料形成[22]。青貯飼料發酵過程會產生LA、AA、PA 和BA，LA 占比越大，BA 占比越小，青貯效果越好[23]，Lara 等[24]研究發現，添加枯草芽孢桿菌會降低玉米青貯中的LA含量，與本研究結果相似。3.4 隸屬函數分析及綜合價值排序

由于枯草芽孢桿菌與復合酶制劑存在交互作用，各處理不同指標的趨勢不同，以任意單一的指標評定最優組合較為片面。因此，為合理、全面地評定其營養價值，將各處理組的11 個指標進行隸屬函數分析，求得平均值，值越大代表其青貯效果越好。本試驗通過對隸屬函數的分析得出，0.2%枯草芽孢桿菌+0.2%復合酶制劑組的平均值最大，表明同時添加0.2%枯草芽孢桿菌和0.2%復合酶制劑青貯效果最好。

4 結論

本研究表明，添加枯草芽孢桿菌和復合酶制劑均在不同程度上改善了苜蓿青貯品質，降低了營養物質損失。枯草芽孢桿菌與復合酶制劑對CP、EE、pH 值存在交互作用。同時添加0.2%枯草芽孢桿菌和0.2%復合酶制劑對紫花苜蓿青貯效果較好。