芽孢桿菌YF-15的篩選、鑒定及對蠶豆秸稈青貯營養品質的影響

楊福華 劉韶娜 廖雋銳 常雅潔 李新榮 霍金龍 趙智勇

（1．云南農業大學動物科學技術學院，云南 昆明 650201；2．云南省畜牧獸醫科學院，云南 昆明 650224）

近年來，隨著畜牧產業結構調整，牛羊養殖集約化、規模化模式日趨壯大，對飼料的需求量不斷增加[1]。常規飼料已無法滿足畜牧業生產需要，因此對非常規飼料進行開發尤為重要[2-3]。青貯飼料是畜禽生產的重要飼料來源之一，青貯發酵可以抑制有害菌生長[4]，延長飼料的存放時間，保留飼料的營養價值，解決飼料供給不足問題[5]。青貯劑能夠改善飼料營養狀況，降低纖維含量，增加適口性，是非常規飼料的首選制作方法[6]。

芽孢桿菌（Bacillus）是一類生物多樣性廣、抗逆性強且安全無害的有益菌群。芽孢桿菌可快速營造厭氧環境[7]，產生抗菌活性物質，抑制病原菌的生長繁殖[8]。芽孢桿菌處理后的飼料，中性洗滌纖維（NDF）和淀粉的消化率有所提高[9]。目前，芽孢桿菌制劑已在飼料發酵等領域表現出巨大潛力。有研究表明，添加枯草芽孢桿菌能夠降低飼料的pH值和氨態氮含量[10-11]。

蠶豆秸稈質地硬、適口性差，若作為粗飼料的來源，利用時間短且利用率低[12-13]。但蠶豆秸稈能夠改善母豬繁殖性能[14]，增加奶牛產奶量[15]，提高山羊生產性能[13]。為充分合理利用蠶豆秸稈資源，提高蠶豆副產品效益，本研究將分離純化后的芽孢桿菌經特性研究鑒定后接種到蠶豆稈中發酵，以青貯飼料感官評價和營養成分變化確定芽孢桿菌對蠶豆秸稈青貯品質的影響，為蠶豆秸稈的高效利用及青貯品質的提升提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源

菌株樣品分離自半散養條件下5 頭地方豬的新鮮豬糞混合物；蠶豆秸稈來自云南省畜牧獸醫科學院種植園。

1.1.2 培養基

LB 肉湯培養基：蛋白胨10.0 g、氯化鈉5.0 g、葡萄糖1.0 g、酵母膏粉5.0 g，調節pH 值至6.8～7.2 范圍內，超純水定容至1 L，121 ℃條件下滅菌20 min。

LB 瓊脂培養基：配方同LB 液體培養基，添加瓊脂粉20 g/L。

營養（NA）肉湯培養基：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化鈉5 g，121℃條件下滅菌20 min。

營養（NA）瓊脂培養基：配方同營養（NA）肉湯培養基，添加瓊脂粉20 g/L。

1.1.3 試劑與儀器

卡那霉素（k30）、慶大霉素（cn10）、青霉素（p10）購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

SX-500 高壓蒸汽滅菌器（TOMY-KOGYOCO.LTD）、SW-CJ1FD潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）、PHS-3C pH計（雷磁，上海儀電科學儀器有限公司）、CCH-HIGHPOINT20實驗室超純水機（湖南創純水處理設備有限公司）、ZQLY-180GV 振蕩培養箱（上海知楚儀器有限公司）、UV-9000S 紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）、1000 型高速多功能粉碎機（武義海納電器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 芽孢桿菌的分離純化

取半散養條件下的5 頭地方育肥豬的新鮮豬糞的混合樣品5 g，置于250 mL LB肉湯培養基中，在30 ℃恒溫培養箱中富集培養24 h，80 ℃水浴20 min，使用0.9%的生理鹽水做梯度稀釋后選擇10-5倍稀釋液，用接種環將菌液上清液接種于LB 瓊脂培養基，30 ℃恒溫培養箱培養24 h。分別挑取具有典型芽孢桿菌形態的單菌落到LB肉湯培養基中培養。反復挑斑，經過4 代篩選后篩選到菌落形態一致的單菌落，于30%的甘油中-20 ℃保存。

1.2.2 形態學觀察和革蘭氏染色

將復篩獲得的菌株利用接種棒劃線于LB固體培養基平板上，30 ℃恒溫培養箱中倒置培養24 h，觀察菌落的隆起形狀、透明度、顏色、質地、邊緣等，挑取少許單菌落進行革蘭氏染色后置于光學顯微鏡下觀察。

1.2.3 分子生物學鑒定

使用試劑盒提取總DNA作為模板，采用細菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3'） 進行PCR 擴增。電泳檢測PCR 產物，大小約1.5 kb，產物交到擎科生物技術有限公司測序。測序結果提交GenBank 進行Blast比對分析，并選取同屬內近緣種的16S rRNA基因序列，采用MEGA 11.0軟件和利用MegAlign分析氨基酸序列同源性比對，構建系統發育樹。

1.2.4 生長曲線及產酸特性

將篩選的芽孢桿菌在LB液體培養基中活化（30 ℃、100 r/min過夜）。另配制LB液體培養基并分裝于100 mL錐形瓶，每個錐形瓶中接種預先過夜培養的菌液100 μL，放入30 ℃恒溫培養箱中振蕩培養，每隔2 h 快速吸取每種菌液5 mL 測定pH 值和OD600nm吸光度值。統計測量結果并繪制芽孢桿菌生長曲線和pH值變化曲線。

1.2.5 抗生素的耐藥性

采用藥敏紙片擴散法檢測芽孢桿菌對3 種抗生素的耐藥性。以1%接種量將測試菌株菌液接入50 ℃左右的經高壓蒸汽滅菌的LB瓊脂固體培養基中，搖勻，倒入平板中。將含有定量抗生素[卡那霉素（k30）、慶大霉素（cn10）、青霉素（p10）]的濾紙片貼在已接種了測試菌的LB瓊脂培養基表面，30 ℃恒溫培養箱中培養24 h，測量抑菌圈的大小。根據《抗菌藥物敏感性試驗執行標準》[16]判斷細菌對抗生素的敏感性效果。抑菌圈直徑小于10 mm，不敏感；直徑10～15 mm，中度敏感；直徑大于15 mm，敏感[17]。

1.2.6 菌株對蠶豆稈青貯發酵的影響

收割采摘蠶豆后的蠶豆秸稈，含水率為75.17%，用微型粉碎機將蠶豆秸稈的粉碎長度為5～10 mm，按1∶0.4的比例與米糠混勻。試驗組添加試驗菌株YF-15，添加量為106CFU/g，對照組加入同等體積的無菌水，混勻后每袋1 000 g樣品裝入發酵袋，壓緊，排出空氣，密封，放在室外避光發酵。30 d 后進行常規成分分析和青貯飼料質量的評定。參照《食品中灰分的測定》（GB 5009.4—2016）[18]測定灰分（Ash）含量，參照《食品中蛋白質的測定》（GB 5009.5—2016）[19]測定粗蛋白（CP）含量，參照《食品中脂肪的測定》（GB 5009.6—2016）[20]測定粗脂肪（EE）的含量，按國標方法檢測水分、粗纖維、酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維含量，青貯飼料質量評定參照德國農業協會（DLG）評分標準，對氣味、結構、色澤進行評分，分為優、上、中、下等[21]。評分細則見表1。實驗室測定指標包括青貯飼料的pH 值和營養成分，以表1判斷青貯飼料發酵情況[22]。

表1 DLG推薦的青貯飼料質量感官評分標準

2 結果與分析

2.1 分離株形態觀察和革蘭氏染色結果

從半散養地方豬育肥豬的新鮮豬糞中篩選得到一株有孢子、革蘭氏染色呈陽性的芽孢桿菌，菌落形態及革蘭氏染色鏡檢結果見圖1。由圖1 可知，菌株在LB 固體培養基上單菌落呈圓形，表面光滑，邊緣規則，顏色為灰白色；經過革蘭氏染色后，表現為革蘭氏陽性、桿狀、單一或串生、有芽孢，分離菌株命名為YF-15。

圖1 分離株形態觀察和革蘭氏染色結果

2.2 菌株YF-15的分子鑒定結果

根據北京擎科生物科技有限公司（昆明）測定的DNA 序列，獲得1 405 bp 的序列長度，將測序結果提交GenBank獲得登錄號為OP349652，通過Blast序列比對以及利用MegAlign進行序列同源性比對，結果見圖2。

圖2 菌株的同源性比對

由圖2 可知，芽孢桿菌YF-15 與阿氏芽孢桿菌（MT525305.1）的相似性達到了96%；與阿氏芽孢桿菌（MT538470.1）、清生芽孢桿菌（MT353876.1）、巨大芽孢桿菌（MT279338.1）、巨型芽孢桿菌（MH127618.1）、惠州芽孢桿菌（MK618613.1）、蒼白桿菌（KU877680.1）相似性達到了98%。

菌株YF-15的16S rDNA系統發育樹見圖3。由圖3可知，菌株YF-15和巨型阿氏芽孢桿菌（MH748616.1）在同一分支，提示兩者的親緣關系較近。

圖3 菌株YF-15的16S rDNA系統發育樹

2.3 菌株YF-15的生長曲線和pH值變化曲線（見圖4）

圖4 菌株YF-15的生長曲線和pH值變化曲線

由圖4（a）可知，菌株YF-15 在30 ℃的LB 液體培養基中能夠正常生長且可達到較高的濃度，培養到2 h快速生長，4 h 時后生長逐漸減慢，14 h 后生長逐漸平緩，進入穩定期，20 h后進入穩定后期。

由圖4（b）可知，菌株YF-15 菌液的pH 值在2～4 h內快速降低，4 h后逐漸上升，表明芽孢桿菌的生長消耗了培養液中的酸性營養物質。培養至16 h時，菌液pH值變化趨于平緩，但隨著菌株生長，消耗了菌液中的酸性物質，pH值持續升高。

2.4 菌株YF-15對抗生素的耐藥性（見表2）

表2 菌株YF-15對抗生素的耐藥性

由表2 可知，菌株YF-15 對青霉素（p10）不敏感，對卡那霉素（k30）和慶大霉素（cn10）為中度敏感。

2.5 菌株YF-15對蠶豆秸稈青貯的感官及營養成分的影響（見表3、表4）

表3 菌株YF-15對蠶豆秸稈青貯感官評價的影響

表4 菌株YF-15對蠶豆青貯飼料常規營養成分含量的影響 單位：%

由表3、表4可知，試驗組蠶豆秸稈青貯的氣味評分和pH 值均優于對照組，CP、EE 含量均高于對照組，DM、Ash、CF、ADF和NDF含量均低于對照組。

3 討論

3.1 芽孢桿菌的生物特性分析

芽孢桿菌廣泛存在于土壤、動物腸道、植物體、空氣以及水體等環境中，是動物腸道內的主要菌群之一。芽孢桿菌具有抗逆性強、營養要求低、繁殖速度快、穩定性好等優點[23]，具有改善動物胃腸道的功能，可增強動物免疫力，提高動物生產性能[24-25]。

本研究從半散養育肥豬的新鮮豬糞中篩選分離到一株芽孢桿菌，經常規特征觀察、革蘭氏染色以及生長趨勢、產酸性能、抗生素耐受性分析，并經16S rDNA測序后鑒定得到菌株的序列信息，將測序結果提交GenBank獲得的登錄號OP349652。該芽孢桿菌YF-15 能夠在LB瓊脂培養基中生長良好，主要包括遲緩期、對數期、穩定期，在測定的24 h內未出現衰亡期；菌株在2 h時開始快速生長，4 h 后生長逐漸平緩，進入穩定期。夏超篤等[26]研究了一株解淀粉芽孢桿菌的生長規律，發現菌株在4～6 h 后進入對數生長期，12 h 后進入穩定期。王君等[27]研究了一株地衣芽孢桿菌生長規律，發現培養4 h后菌株生長進入對數期，此時活菌數開始迅速上升，在第12 h 進入穩定期。本研究結果顯示，芽孢桿菌YF-15 菌液的pH 值可維持在7.0 左右，且隨著菌株生長pH 值在5.5～7.5 范圍內變化。劉軍生等[28]對一株阿氏芽孢桿菌的產酸試驗結果表明，菌株生長最適pH 值約7.0，在6.0～7.5范圍內生長良好，無法在強酸或強堿的環境中生長。

本研究通過Blast 序列比對分析了多菌株序列同源性，并構建了進化樹，菌株YF-15 與其他芽孢桿菌的相似度均在98%以上。進化分析結果表明，菌株YF-15 和MT748616.1Priestiaaryabhattai在同一分支，提示芽孢桿菌YF-15 與該菌株的親緣關系較近。抗生素能夠殺死敏感的有益菌，留下耐藥菌株。這些菌株的數量會隨著時間的推移而增加，并可能成為耐藥菌株。為使有益菌發揮最大的作用，在使用有益菌時應避免與其敏感的抗生素一同使用[29]。菌株YF-15 的抗生素耐藥性試驗結果表明，該菌株對青霉素（p10）不敏感，對卡那霉素（k30）和慶大霉素（cn10）為中度敏感。菌株YF-15 對所試驗抗生素的耐藥性表現優于前人研究，表明芽孢桿菌YF-15可在含有一定量抗生素的環境中生長[17,30-31]。

3.2 芽孢桿菌作為青貯添加劑對蠶豆青貯發酵效果的影響

將從新鮮豬糞中分離的芽孢桿菌YF-15 添加到蠶豆秸稈青貯飼料后，青貯飼料的氣味評分和pH值評分均優于對照組，常規成分檢測發現飼料的EE、CP等含量高于對照組，并且CF 含量顯著降低。試驗組的ADF 和NDF較對照組分別降低了18.81%和7.68%，說明芽孢桿菌YF-15 對CF 具有較強的降解能力，并且還具有提高EE和CP 含量的能力，可使飼料營養物質得到較好的保存。產生這些變化的原因可能是因為青貯飼料在發酵過程中，芽孢桿菌的生長、發酵影響了蠶豆的細胞壁結構，細胞內容物大量流出，與微生物進行各種反應，從而導致色澤、氣味、質地和pH值等發生了變化。有研究表明，添加青貯添加劑對青貯飼料的色澤、氣味、質地和pH值有所改變[32]。青貯飼料的原料中含有大量的微生物，而有害微生物是造成飼料中營養成分減少的主要原因之一。在青貯發酵過程中添加有益菌可抑制有害菌的生長，從而降低飼料中營養物質的損失[33]。有研究發現，用枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌發酵桑葉可降低飼料CF 和EE含量，提高CP含量，與本研究結果相似[34-36]。有研究表明，NDF和ADF含量越高，飼料品質越差。有研究對蠶豆秸稈的洗滌纖維含量進行分析，發現NDF和ADF含量達到了55.08%和63.04%[37]。本試驗中添加了米糠，導致NDF和ADF含量較高。也有研究表明，蠶豆秸稈對綿羊生長的NDF和ADF均無顯著影響[38]。

4 結論

本研究從新鮮豬糞中篩選分離得到一株芽孢桿菌（Bacillus），命名為BacillusYF-15。對BacillusYF-15 的特性研究發現，該篩選菌株具有較好的生長性，對常見的抗生素具有一定的耐藥性。將菌株YF-15 作為微生物添加劑對蠶豆秸稈發酵，能夠提高蠶豆秸稈青貯飼料的CP、EE 的含量，降低DM、Ash、CF、ADF 和NDF 含量，提高感官評價水平。