濃縮沼液中添加芽孢桿菌對促生和抑菌功能的強化效應

劉艷麗 趙娜娜 范貝貝,2 李乃薈 董泰麗 陳 清 慕康國*

(1.中國農業大學 資源與環境學院,北京 100193;2.中國農業大學 有機循環研究院(蘇州),江蘇 蘇州 215000;3.東北農業大學 園藝園林學院,哈爾濱 150038;4.山東民和生物科技股份有限公司,山東 煙臺 264000)

隨著畜禽養殖業和沼氣工程的發展,沼液的排放量與日俱增,其利用途徑也成為環保及農業領域新的關注熱點。沼液含有大量的氮磷鉀等營養元素,以及氨基酸、腐植酸、維生素和生長激素等活性物質,可以作為良好的液體有機肥料,同時也具有抑病功能[1]。大量研究表明,長期施用沼液可以有效改善土壤肥力,促進農作物生長,增加作物產量[2-4]。對種子而言,外源施用沼液能提高種子養分轉運、酶活性以及新陳代謝能力,從而促進種子的萌發和提高種子的成秧率[5]。此外,沼液中的活性物質對一些病原菌具有抑制性作用,可以增強植物對于抵抗多種病原菌侵襲的能力,減少農藥施用,提高資源利用效率[6-7]。但沼液水分含量高,直接施用肥效不高,而且運輸成本高,商品化利用較困難,嚴重制約了沼液肥的推廣與應用[8]。利用膜濃縮技術對沼液進行濃縮,可以提高沼液的營養物質含量,有助于提高沼液的肥料價值。然而采用膜濃縮技術成本較高,仍需要復配其他活性物質增強沼液的功能,從而實現沼液肥的市場化推廣[9-11]。

土傳病害每年都會給農業生產造成重大經濟損失,常見的毀滅性土傳病害主要有枯萎病、軟腐病、紋枯病和青枯病等。生物防治因其低成本、環境友好和無藥物殘留等特點已成為當前國內外防治植物土傳病害的研究熱點[12]。芽孢桿菌廣泛分布于自然界中,具有抗逆性強、耐高溫及生防效果好等優點,已成為理想的土傳病害生防菌資源[13]。同時,芽孢桿菌及其代謝產物可以有效提高土壤肥力、改善土壤環境、提升作物品質以及增強植株抗病能力[14]。大量研究表明,芽孢桿菌通過定殖至植物根際、體表或體內,與病原菌競爭植物周圍的營養,分泌抗菌物質以抑制病原菌生長,同時誘導植物防御系統抵御病原菌入侵,從而達到生防的目的[15]。

具有多種功能的復合肥料已成為國內外新型肥料的主要研究內容之一。芽孢桿菌等微生物與沼液復配,兼具了有機肥和微生物肥料的優點,不僅含有大量有機質和營養養分,還含有大量生防微生物及其代謝產物,可以有效提高土壤肥力,恢復土壤微生態平衡,提升作物品質,增強植株抗病能力[16]。孫天姿等[17]將巨大芽孢桿菌添加到餐廚沼液中所制備的液態菌肥顯著提高了冬小麥和水稻土壤中有效氮磷的含量。也有研究表明,施用沼液微生物菌肥可顯著提高設施蔬菜的生物量和品質[18]。芽孢桿菌與沼液聯用不僅避免了沼液排放帶來的環境問題,還實現了沼液的增值化利用,具有較高的環保效益、經濟效益和社會效益。

沼液肥中芽孢桿菌的活菌數是發揮肥效至關重要的一點,通常沼液的EC較高且pH為堿性,對芽孢桿菌的活性有一定影響[19]。因此,針對現有問題,本研究通過在濃縮沼液中添加甘油等保護劑來探究芽孢桿菌在濃縮沼液中的存活情況以及兩者復配后的促生抑病效果。本研究在前期試驗中采用Salkowski比色法測定了8種芽孢桿菌生產生長素(IAA)的能力,其類別分別為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、側孢芽孢桿菌(B.laterosporus)、巨大芽孢桿菌(B.megatherium)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis),最終選擇IAA產量較高的解淀粉芽孢桿菌B3和濃縮沼液進行復配。促生功能的探究需要大量的發芽試驗、盆栽試驗以及田間試驗來驗證。種子發芽是植物生長中最基礎和最重要的一步,可以有效體現作物的出苗質量,而且種子整個發芽周期很短,方便大批量進行。小麥、黃瓜和白菜在我國種植范圍廣泛,是我國重要的糧食作物和蔬菜作物[20]。皿內抑菌試驗可以快速驗證肥料對于不同土傳病原菌的抑菌效果。本研究采用芽孢桿菌與沼液復配制備沼液菌肥,通過研究配制的芽孢桿菌沼液肥對小麥、白菜和黃瓜種子發芽的增強效果,同時探究芽孢桿菌沼液肥對尖孢鐮刀菌黃瓜專化型(F.oxysporumf.sp.Cucumerinum)、尖孢鐮刀菌番茄專化型(F.oxysporumf.sp.lycopersici)和茄鐮孢菌(Fusariumsolani)的抑菌效果,驗證所配制的芽孢桿菌沼液肥的促生和抑菌效果,為沼液增值化利用和農業生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試芽孢桿菌:解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)為水溶性工程菌粉,活菌數≥1011CFU/g。供試廠家為湖北中向生物工程有限公司。

供試濃縮沼液:雞糞濃縮沼液。將雞糞沼液進行預處理以去除其中的大量懸浮物,然后采用孔徑為1～100 nm的無機陶瓷超濾膜進行過濾,去除沼液中多余的水分和雜質,得到濃縮雞糞沼液。沼液外觀顏色為棕褐色或棕黑色液,pH為9.20,EC值為32.00 mS/cm,有機質質量濃度為4.5 g/L,腐植酸質量濃度1.9 g/L,總氮質量濃度5 g/L,總磷質量濃度2.4 g/L,總鉀質量濃度5.6 g/L,鈣質量濃度為864 mg/L,鐵質量濃度為104 mg/L,鎂質量濃度為25 mg/L,錳質量濃度為16 mg/L,鋅質量濃度為16 mg/L,銅質量濃度為11 mg/L。

供試種子:小麥種子(品種為‘輪選987’)、白菜種子(品種為‘綠如意’)和黃瓜種子(品種為‘津研4號’)購買于中國農業科學院。

供試病原菌:尖孢鐮刀菌黃瓜專化型、尖孢鐮刀菌番茄專化型和茄鐮孢菌,由中國農業科學院提供,在PDA培養基活化后備用。

供試培養基:LB(營養肉湯)培養基,配料為每升LB培養基含有NaCl 10.0 g、胰蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0 g、瓊脂20.0 g,pH為7.0～7.2,121 ℃高壓滅菌30 min后備用。

1.2 含芽孢桿菌沼液肥的配制及存放過程中活菌數的測定

將復配的增效物質以及甘油等作為保護劑添加到濃縮沼液中,在溫度為60 ℃、轉速為60 r/min磁力攪拌器上加熱攪拌60 min,然后按照50 g/L加入解淀粉芽孢桿菌。混合均勻后分別將其分裝在滅菌后的離心管中,25 ℃室溫條件下避光保存。分別在存放第0、7、30、45和90天取樣測定活菌數,每次取3管,采用稀釋涂布平板法測定活菌數。將濃縮沼液與芽孢桿菌的混合液按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7濃度梯度進行稀釋。用無菌槍頭吸取100 μL液體涂布于LB培養基平板中,不同梯度各涂3個平板,涂布均勻,將平板放入26 ℃培養箱中恒溫培養2～3 d后,計數。計數時應選擇菌落數在30～300 CFU/g的平板進行計數。

1.3 試驗設計

試驗以無菌水作為空白對照,BS為原濃縮沼液,BSF為沼液肥(添加甘油等保護劑的濃縮沼液),B3為芽孢桿菌菌液(每50 g解淀粉芽孢桿菌菌粉配制1 L菌液),FA為配制的芽孢桿菌沼液肥,FB為存放30 d的芽孢桿菌沼液肥。具體試驗設計見表1。

表1 不同試驗處理的稀釋倍數Table 1 Dilution ratio of different test treatments

1.4 含芽孢桿菌沼液肥的皿內發芽試驗

試驗于2021年2～3月在中國農業大學西校區進行。挑選籽粒飽滿且大小基本一致的種子,在1%的NaClO溶液中浸泡消毒10 min,期間不斷攪拌;用去離子水沖洗3次后,風干至初始含水量。在直徑為9 cm的培養皿中放入一層無菌定性濾紙,分別加入不同稀釋倍數的10 mL處理液,然后均勻放置20粒種子,加皿蓋保濕,置于溫度為25 ℃培養箱中暗培養,每個處理9次重復。測定根長、芽長、發芽率、發芽指數、發芽勢和活力指數[21]。根長和芽長用精度為1 mm米尺直接測量。

根據農作物種子檢驗規程,以胚根長超過種子長度的1/2計為發芽,每天記錄種子的萌發數。試驗結束標準為:連續2 d發芽數不發生變化。

發芽勢(率)=供試種子的發芽數/供試種子數×100%

(1)

式中:發芽勢在第2天統計,%;發芽率在第5天統計,%。

發芽指數(GI)=ΣGt/Dt

(2)

式中:Gt為第t日的種子萌發數,粒;Dt為相應的種子萌發天數,d。

活力指數(VI)= GI×S

(3)

式中:GI為發芽指數;S為平均根長,mm。

1.5 含芽孢桿菌沼液肥的平板抑菌試驗

吸取100 μL稀釋不同倍數的處理液,均勻涂布到PDA培養基表面,每個處理9次重復。然后用打孔器從培養好的病原菌菌株中取直徑為5 mm的菌餅,倒扣于平板的中央,每個培養皿中放1個菌餅,將接種病原菌的平板放于28 ℃培養箱中黑暗培養3～10 d(視菌落生長情況而定)。用十字交叉法測量菌落直徑,并計算菌絲生長的抑菌率(Antifungal index,AI)[22]。公式如下:

(4)

1.6 數據處理

采用Microsoft Excel軟件進行數據處理,采用Origin 2021軟件作圖,采用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 含芽孢桿菌沼液肥存放過程中活菌數的變化

通過稀釋涂布平板法測定芽孢桿菌沼液肥隨存放時間活菌數的變化(圖1),沼液肥中芽孢桿菌的數量隨存放時間的增加而減少。其中,存放時間為0～30 d減少趨勢最明顯,在第30天時,芽孢桿菌沼液肥中活菌數為3×109CFU/mL,存活率為48.4%;存放時間為30～90 d時活菌數基本保持穩定,無顯著差異。存放90 d時芽孢桿菌活菌數的數量為2.8×109CFU/mL,滿足中華人民共和國農業部NY/T 798—2015《復合微生物肥料執行標準》[22]中對于復合微生物肥料中活菌數量的規定(5×107CFU/mL)。

圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Small letters in the figure indicate significant differences (P<0.05).

2.2 芽孢桿菌沼液肥對種子發芽的影響

2.2.1對黃瓜種子發芽的影響

通過發芽試驗測定了芽孢桿菌沼液肥等物質對黃瓜種子發芽的影響,如圖2(a)～(e)所示。與對照相比,稀釋250和500倍的含芽孢桿菌沼液肥處理(FA和FB)降低了黃瓜種子的發芽勢和發芽指數,對黃瓜種子的萌發具有抑制作用。但稀釋1 000倍的含芽孢桿菌沼液肥處理提高了黃瓜種子的發芽勢和發芽指數。其中,稀釋1 000倍的FA和FB處理的黃瓜種子發芽勢分別為87.8%和87.2%,比對照分別提高15.3%和14.6%。稀釋1 000倍的FB顯著促進了黃瓜種子的發芽率(圖2(b))。

圖中小寫字母表示同一濃度的不同處理之間差異顯著(P<0.05)。圖中序號代表的具體處理詳見表2。下同。Small letters in the figure indicate significant differences among different treatments at the same concentration (P<0.05).See Table 2 for specific treatments represented by serial numbers in the figure.The same below.

所有處理均不同程度增加了黃瓜種子的芽長、根長和活力指數(圖2(c)、(d)和(f)),稀釋1 000倍的含芽孢桿菌沼液肥對黃瓜種子的芽長和根長的促進作用顯著高于稀釋1 000倍的沼液肥和芽孢桿菌菌液處理。與對照相比,稀釋1 000倍的FA和FB能顯著增加黃瓜種子的芽長和根長,芽長分別為48.9和47.0 mm,分別增加了56.3%和50.1%;根長分別為52.7和53.0 mm,分別增加了72.3%和73.3%。與BSF的1 000倍稀釋液處理相比,FA和FB的1 000倍稀釋液處理使根長分別增加了2.1%和12.8%,與芽孢桿菌菌液的1 000倍稀釋液相比,根長分別增加了18.8%和18.2%。

2.2.2對小麥種子發芽的影響

芽孢桿菌沼液肥等物質對于小麥種子發芽的影響如圖3所示。芽孢桿菌沼液肥(FA和FB)的250和500倍稀釋液處理的小麥種子發芽勢和發芽指數顯著低于其他處理,但FA和FB的1 000倍稀釋液處理顯著提高了小麥種子的發芽勢和發芽指數。FA和FB的1 000倍稀釋液的發芽勢分別為87.2%和86.4%,與對照相比,分別提高22.7%和21.6%(圖3(a)和(e))。FA和FB處理對小麥種子的發芽率沒有顯著影響(圖3(b))。所有處理對小麥種子的芽長、根長和活力指數均有不同程度的促進作用。芽孢桿菌沼液肥(FA和FB)對小麥種子的根部促進作用較明顯,1 000倍稀釋液處理的小麥種子根長分別可達118.9和117.1 mm,與對照相比,分別提高47.5%和45.2%;與沼液肥的1 000倍稀釋液相比,根長分別提高了7.1%和5.4%;與芽孢桿菌菌液的1 000倍稀釋液相比,分別提高了27.3%和25.3%(圖3(c)、(d)和(f))。

圖3 不同處理肥料對小麥種子發芽勢(a)、發芽率(b)、芽長(c)、根長(d)、發芽指數(e)和活力指數(f)的影響Fig.3 Effects of different fertilizer treatments on germination potential (a),germination rate (b),bud length (c),root length (d),germination index (e) and vigor index (f) of wheat seeds

2.2.3對白菜種子發芽的影響

芽孢桿菌沼液肥等物質對白菜種子發芽的影響見圖4。芽孢桿菌沼液肥(FA和FB)的250和500倍稀釋液處理顯著降低了白菜種子的發芽勢和發芽指數。但FA和FB的1 000倍稀釋液處理提高了白菜種子的發芽勢和發芽指數,與對照相比,分別提高14.3%和13.7%(圖4(a)和(e))。所有處理均顯著提高了白菜種子的活力指數(圖4(f))。FA和FB的1 000倍稀釋液處理的白菜種子的根長分別可達78.3和78.9 mm,與對照相比,分別提高50.6%和51.7%。此外,與沼液肥1 000倍稀釋液相比,FA和FB的1 000倍稀釋液處理使根長分別提高了6.2%和7.1%;與芽孢桿菌菌液的1 000倍稀釋液相比,根長分別提高了50.6%和51.7%(圖4(b)和(c))。

圖4 不同處理肥料對白菜種子發芽勢(a)、發芽率(b)、芽長(c)、根長(d)、發芽指數(e)和活力指數(f)的影響Fig.4 Effects of different fertilizer treatments on germination potential (a),germination rate (b),bud length (c),root length (d),germination index (e) and vitality index (f) of Chinese cabbage seeds

2.3 含芽孢桿菌沼液肥的平板抑菌效果

在本研究中,隨著稀釋倍數的增加,所有處理的病原菌的菌落直徑增加(圖5和6)。與無菌水處理相比,稀釋1 000、5 000和10 000倍的原濃縮沼液、沼液肥、芽孢桿菌溶液、含芽孢桿菌沼液肥(現配現用)和含芽孢桿菌沼液肥(存放30 d)對尖孢鐮刀菌黃瓜專化型、尖孢鐮刀菌番茄專化型和茄鐮孢菌均表現出顯著的抑制效果。與沼液肥相比,含芽孢桿菌的沼液肥對病原菌具有顯著的抑制作用。原濃縮沼液的1 000倍稀釋液對尖孢鐮刀菌黃瓜專化型、尖孢鐮刀菌番茄專化型和茄鐮孢菌的抑菌率分別為62.1%、63.5%和62.1%,10 000倍稀釋液對尖孢鐮刀菌黃瓜專化型、尖孢鐮刀菌番茄專化型和茄鐮孢菌困的抑菌率分別為47.7%、47.7%和49.2%。芽孢桿菌菌液(B3)和芽孢桿菌沼液肥(FA和FB)的1 000倍稀釋液對尖孢鐮刀菌黃瓜專化型的抑菌率分別為87.5%、87.9%和83.2%,對尖孢鐮刀菌番茄專化型的抑菌率分別為71.3%、75.8%和72.6%,對茄鐮孢菌的抑菌率分別為87.5%、88.8%和86.5%。稀釋10 000倍的B3、FA和FB對3種病原菌依舊有很高的抑菌率,對尖孢鐮刀菌黃瓜專化型的抑菌率分別為65.3%、68.5%和65.3%,對尖孢鐮刀菌番茄專化型的抑菌率分別為71.3%、75.8%和72.6%,對茄鐮孢菌的抑菌率分別為78.0%、84.5%和79.5%。隨著稀釋倍數的增加,芽孢桿菌沼液肥對病原菌生長抑制效果減弱,其原因可能是稀釋后有益微生物數量減少,對病原菌的競爭作用減弱。

圖5 不同處理肥料對尖孢鐮刀菌黃瓜專化型(a)、尖孢鐮刀菌番茄專化型(b)和茄鐮孢菌(c)生長的影響Fig.5 Effects of different fertilizers on the growth of F. oxysporum f.sp.Cucumerinum (a)、F. oxysporum f. sp. lycopersici (b) and F. solani (c)

圖6 不同處理肥料對尖孢鐮刀菌黃瓜專化型(a)、尖孢鐮刀菌番茄專化型(b)和茄鐮孢菌(c)生長的抑制效果Fig.6 Inhibitory effect of different fertilizers on the growth of F. oxysporum f.sp.Cucumerinum (a)、F.oxysporum f. sp.lycopersici (b) and F. solani (c)

此外,含芽孢桿菌的沼液肥存放1個月后活菌數減少,與現配現用的含芽孢桿菌沼液肥相比對病原菌的生長抑制作用降低,但依舊具有較高的抑菌率。存放1個月的含芽孢桿菌的沼液肥對尖孢鐮刀菌黃瓜專化型、尖孢鐮刀菌番茄專化型和茄鐮孢菌的抑菌率與現配現用的沼液肥相比分別僅下降4.8%、4.2%和6.0%。因此添加芽孢桿菌可以顯著提高沼液肥的抑菌效果。

3 討 論

沼液中含有的赤霉素和有機酸等活性物質可以促進種子的發芽[23],以肥料形式施入土壤后,能促進植物的生長。王遠遠等[24]發現施用沼液能增加小白菜的葉寬和葉片數,產量增加97.74%,Yu等[25]發現沼液澆灌果樹可以促進葉子生長提高果實的品質和產量,這與本試驗中1 000倍稀釋液芽孢桿菌沼液肥的促生結果相符合。本研究通過種子發芽試驗快速驗證了含芽孢桿菌沼液肥的促生效果,發現稀釋250和500倍的芽孢桿菌沼液肥對黃瓜、小麥和白菜種子的萌發和生長具有抑制效果,而稀釋1 000倍的含芽孢桿菌沼液肥則具有協同增效作用,可以顯著促進種子的萌發和生長。沼液濃度過高可能是導致這一現象的重要原因,沼液中銨態氮過量會對作物造成銨毒害,抑制作物的生長[26]。此外,芽孢桿菌的產IAA能力是衡量其促生功能的重要指標,本研究采用的枯草芽孢桿菌的產IAA能力通過Salkowski比色法測定為38.8 mg/L,因此添加了芽孢桿菌的濃縮沼液對種子的促生效果顯著提升。含芽孢桿菌沼液肥存放30 d后活菌數減少,但在本研究中,其對種子萌發和生長與現配現用的含芽孢桿菌沼液肥沒有顯著差異。

沼液中所包含的有機酸成分,植物激素中的赤霉素、乙酸和維生素B12等對病原菌有顯著的抑制效應。關于沼液抑菌的相關研究表明,沼液可以顯著抑制植物病原菌的孢子在體內萌發、菌絲在體外的生長以及分生孢子的形成等[27]。馮自立等[28]研究發現,采用濃縮沼液對棉花進行灌根處理,可以誘導棉花葉片活性氧爆發,增強過氧化物酶、幾丁質酶、β-1,3-葡聚糖酶、杜松烯合酶、苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶基因的表達,從而抑制棉花黃萎病菌在植物體內的存活和擴展。本研究中,單獨施用稀釋后的濃縮沼液,對病原菌的抑菌率為50.0%～65.0%,抑菌率隨著沼液稀釋倍數的增加而降低。此外,相關研究也表明沼液中的銨和腐植酸可能是其主要的抑菌因子[7]。腐植酸有利于土壤中有益微生物的生長繁殖,對病原微生物有抑制作用,從而降低作物土傳病害的發生[29];含氮量高的有機物料施入土壤后,因氨化作用會使土壤pH暫時性升高,導致土壤中NH3的濃度快速升高,因此可以有效殺滅病原菌[30]。

芽孢桿菌是一種具有廣泛抑菌作用的生防菌。Gowtham等[31]研究發現,解淀粉芽孢桿菌顯著增強了辣椒植株對炭疽病的防御作用,并且有效促進了辣椒生長。Cao等[32]研究表明,芽孢桿菌所產生的伊枯草菌素(Iturin)能夠有效抑制尖孢鐮刀菌的生長。張德珍等[33]發現淀粉芽孢桿菌JF-1對多種植物病原真菌產生明顯的抑菌作用,能有效降低苗期黃瓜枯萎病的發病率和病情指數。郭珺等[34]發現芽孢桿菌Pb-4菌株對番茄枯萎病菌、黃瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、青椒枯萎病菌、辣椒疫霉病菌和蘋果腐爛病菌均有抑制作用,其抑菌活性具有廣譜性。本研究中所采用的解淀粉芽孢桿菌的1 000倍稀釋液對尖孢鐮刀菌黃瓜專化型、尖孢鐮刀菌番茄轉化型和茄鐮孢菌的抑制作用均在80.0%以上,具有較高的抑菌率,與前人的研究結果相一致。

本研究將濃縮沼液與芽孢桿菌進行復配后,對尖孢鐮刀菌黃瓜專化型、尖孢鐮刀菌番茄專化型和茄鐮孢菌的抑制效果均高于單獨施用芽孢桿菌菌液或濃縮沼液,顯著提高了對病原菌的抑菌率。含芽孢桿菌沼液肥的10 000倍稀釋液仍具有很高的抑菌作用,對3種病原菌的抑菌率均高于80.0%。隨著稀釋倍數的增大,對3種病原菌的抑菌率呈現下降趨勢。但由于菌液稀釋后仍含有大量的芽孢桿菌,對病原菌依舊具有60.0%以上的抑菌率。此外,本研究僅采用種子發芽試驗和皿內抑菌試驗探究了芽孢桿菌沼液肥的促生抑病功能,還需在大田環境下對其作用效果、用量和作用機理進行深入探究和論證。

4 結 論

本研究將芽孢桿菌添加到濃縮沼液中,明確了芽孢桿菌活菌數隨著存放時間的增加而減少,存放90 d后活菌數仍滿足國家對于復合微生物肥料中活菌數量的規定(5×107CFU/mL)。與對照或單獨施用沼液相比,含芽孢桿菌沼液肥的1 000倍稀釋液能不同程度的提高種子的6項發芽特征指標,顯著促進了黃瓜、小麥和白菜種子的萌發和生長;含芽孢桿菌沼液肥可顯著提高對尖孢鐮刀菌黃瓜專化型、尖孢鐮刀菌番茄專化型和茄鐮孢菌的抑制作用。存放30 d的芽孢桿菌沼液肥的10 000倍稀釋液對本試驗中的3種病原菌的抑菌率仍在65.0%以上。因此,芽孢桿菌和濃縮沼液復配后對種子萌發的促進和對病原菌的抑制具有協同增效作用。