中國荷斯坦奶牛乳脂中miR-2285f生物信息學分析及靶基因驗證

張 迪 劉佳敏 禹保軍 李德生 顧亞玲 溫 萬 張 娟*

(1.寧夏大學 農學院,銀川 750021;2.寧夏回族自治區反芻動物分子細胞育種重點實驗室,銀川 750021;3.寧夏畜牧工作站,銀川 750002)

乳脂肪是乳中的主要能量物質和重要的營養成分,由編碼轉錄調節因子和非編碼因子共同調控表達,并涉及到一個龐大、復雜的分子調控網絡,受到多個激素及信號分子等調控,包括脂肪酸、甘油三酯的攝入、轉運、活化、合成、脂滴的形成和分泌等過程[1]。隨著候選基因篩選測序和比較基因組學研究方法的發展,更多的乳脂代謝相關基因及調控因子被發現并驗證其功能[2],miRNA便是其中一種重要的調控因子。

MicroRNA(miRNA)是長度為18～24個核苷酸的非編碼RNA分子,通過堿基互補配對的方式調控生物個體的某些生理生化指標[3],并在調節乳腺發育[4]、泌乳過程[5]、脂肪代謝[6]、天然免疫[7]等生物學功能方面發揮一定作用。Bu等[8]在牛乳腺組織中獲得99條miRNA,其中miR-23a、miR-24、miR-143和miR-103的表達水平較高。miR-33a、miR-103過表達可促進乳腺上皮細胞(Bovine mammary epithelial cells,BMECs)中甘油三酯的合成[9-10],miR-25、miR-454都可抑制靶基因PPARγ(Peroxisome proliferator activated receptor gamma)的表達從而降低細胞內甘油三酯的合成[11-12]。還有研究發現,羊乳腺組織中miR-103、miR-200a、miR-27a及miR-23a協同調控了乳腺脂肪酸合成過程[13]。通過對山羊泌乳期差異表達的miRNA并定位于與乳脂含量相關的QTL中發現miR-2285家族在其中顯著表達[14]。同時,miR-2285家族也是一類高表達的牛特異性miRNA,miR-2258o-3p通過負調控靶基因同源性磷酸酶PTEN(Phosphatase and tensin homolog)和極低密度脂蛋白受體VLDLR(Very low density lipoprotein receptor)緩解低氧引起的細胞凋亡[15]。同時,通過課題組前期工作,對乳脂率極端差異的8頭寧夏中國荷斯坦奶牛乳腺上皮細胞轉錄組測序,miR-2285f在高乳脂組表達量較高且顯著差異,并且轉錄組測序通過熒光定量的方法進行了驗證,數據可靠性高[16]。但是miR-2285f是否影響中國荷斯坦奶牛乳脂代謝尚不清楚。因此本研究通過對中國荷斯坦奶牛miR-2285f生物信息學分析以及靶向關系驗證,進一步了解miR-2285f在乳脂代謝中的作用,為后續miR-2285f對牛乳腺上皮細胞乳脂代謝功能驗證提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 中國荷斯坦奶牛miR-2285f基因組位置分析

通過NCBI數據庫(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)和UCSC數據庫(UCSC Genome Browser Home)查找miR-2285f在牛基因組的位置以及參考基因組序列(ARS-UCD1.2或bosTau9)和注釋信息。

1.2 miR-2285f生物信息學分析

在miBase(https:∥www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_entry.pl?acc=bta-miR-2285f)中檢索獼猴、大猩猩、人、牛、黑猩猩、褐家鼠、小鼠、山羊和家犬的miR-2285f序列,分析其在不同物種間的保守性。

使用NCBI數據庫獲得前體序列bta-miR-2285f和其宿主基因TBK1的上游序列(2 kb),并使用EMBOSS軟件(https:∥www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/)和UCSC軟件(https:∥genome.ucsc.edu/)進行CpG島分析。

通過Promoter2.0(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php/Promoter-2.0)和Neural Network Promoter Prediction(https:∥fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)預測啟動子區域。

1.3 miR-2285f靶基因預測以及功能分析

通過靶基因預測軟件TargetScan(https:∥www.targetscan.org/vert_71/)和miWalk(http:∥mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)對miR-2285f靶基因預測并取其交集進行miRNA-mRNA關聯分析,并通過Cytoscape (https:∥cytoscape.org/)軟件可視化。使用DAVID軟件(https:∥david.ncifcrf.gov/)對互作候選靶基因集進行GO和KEGG分析。

1.4 bta-miR-2285f在中國荷斯坦奶牛組織中的表達譜分析

本研究所用組織樣本均由實驗室前期保存。利用Trizol法提取中國荷斯坦奶牛小腸、肝臟、乳腺、心臟、腎臟和卵巢組織的總RNA,按照HiScript Ⅲ 1 st Strand cDNA Synthesis kit轉錄試劑盒的說明反轉錄合成cDNA。莖環法設計miRNA的引物,Primer Premier 6設計mRNA的引物(表1)。miRNA和mRNA分別以U6和GAPDH為內參,每個樣本3個重復,使用SYBR Green Pro Taq HS 預混型qPCR試劑盒進行實時熒光定量PCR檢測。

表1 本研究中用到的引物信息Table 1 Information of primers in the study

表2 CAB39基因野生型突變型載體序列信息Table 2 Sequence information of CAB39 wild-type mutant vector

反應體系:上下游引物各0.5 μL,cDNA 2 μL,2x QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix 10 μL,RNAase Free ddH2O補至20 μL。反應條件:95 ℃預變性 30 s;95 ℃變性5 s,退火30 s,40個循環,每個樣品3個重復。利用2-ΔΔCt計算 miRNA和mRNA 的相對表達量,結果表示為“平均值±標準誤”。

1.5 bta-miR-2285f mimic和inhibitor轉染乳腺上皮細胞系

1.5.1乳腺上皮細胞系的培養

試驗所采用的乳腺上皮細胞系由寧夏大學王興平教授惠贈。將乳腺上皮細胞系復蘇后培養并接種到6孔板中,添加10% FBS的DMEM/F12培養基,置于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。

1.5.2bta-miR-2285f mimic和inhibitor轉染BMECs

bta-miR-2285f模擬物(5′-AAAACCUGAA-UGAACUUUUUGG-3′)和抑制劑(5′-CCAAAA-AGUUCAUUCAGGUUUU-3′)均由廣州銳博生物科技有限公司所合成。當細胞密度達到70%時,用去血清培養基Opti-MEM代替生長培養基孵育細胞。按照制造商的說明使用脂質體LipofectamineTM3 000混合Opti-MEM,在混合物中加入bta-miR-2285f mimic和mimic NC(Negative control)、bta-miR-2285f inhibitor和inhibitor NC(Negative control),室溫孵育20 min后添加到6孔板細胞中。37 ℃、5%CO2的培養箱中孵育6 h,去除細胞原有培養基加入2 mL 10%FBS的DMEM/F12生長培養基繼續培養。

1.6 牛CAB39基因熒光素酶報告載體構建及活性檢測

1.6.1牛CAB393′UTR雙熒光素野生型和突變型載體構建

將bta-miR-2285f對應結合位點的CAB39基因3′UTR 序列克隆到pmirGLO載體上,構建野生型表達質粒;突變型表達質粒是將bta-miR-2285f對應CAB39基因(Calciumbindingprotein39)3′UTR靶位點的堿基突變序列后構建入pmirGLO載體產生,由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.6.2雙熒光素酶活性分析

在雙熒光素酶報告分析中,293T細胞由湖南豐暉生物科技有限公司購買。將293T細胞復蘇并接種于24孔板,當細胞密度達到70%～80%時,加入400 μL無血清DMEM高糖培養基孵育4 h,隨后用LipofectamineTM3 000將bta-miR-2285f mimic或mimic NC和CAB393′UTR報告質粒共轉染細胞。轉染48 h后用PBS清洗細胞,加入100 μL細胞裂解液裂解后收集細胞。在96孔板每孔加入50 μL AR Ⅱ后加入20 μL細胞裂解液輕輕混勻后用酶標儀(OMG Labtech)測定螢火蟲熒光酶值。最后每孔加入50 μL Stop and Glo Reagent,輕輕混勻后使用酶標儀測海腎熒光素酶數值。

1.7 數據分析

使用SAS2.0軟件對數據進行單因素方差(One way ANOVA)分析,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著,P>0.05表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 miR-2285f來源及保守性分析

通過牛基因組分析發現,miR-2285f-1位于牛5號染色體的49 300 832～49 300 853位置,來源于宿主基因TBK1的第16內含子,屬于內含子miRNA(圖1(a));而miR-2285f-2位于牛20號染色體的21 823 443至21 823 464位置,來源于基因肌動蛋白樣蛋白2(Actin beta like 2,ACTBL2)和富含GC啟動子的結合蛋白(GC-rich promoter binding protein 1,GPBP1)基因之間(圖1(b))。采用Reciprocal BLAST檢測多個動物基因組上miR-2285f的直系同源物,結果僅在牛基因組定位到bta-miR-2285f序列,并在其他物種中未發現bta-miR-2285f的相似序列,表明bta-miR-2285f是牛特異性miRNA。

圖1 bta-miR-2285f-1(a) bta-miR-2285f-2(b)在牛基因組中的位置Fig.1 Location of bta-miR-2285f in the bovine genome

2.2 miR-2285的CPG島和啟動子分析

軟件預測發現bta-miR-2285f-1、bta-miR-2285f-2和TBK1基因均不含有CPG島(圖2),表明其不是典型的GC-rich啟動子,且極易被激活。

圖2 bta-miR-2285f-1(a)、bta-miR-2285f-2(b)和TBK1(c)的CPG島分析Fig.2 Analysis of CPG islands for bta-miR-2285f-1 (a),bta-miR-2285f-2 (b) and TBK1 (c)

軟件PROMOTER2.0預測結果表明,bta-miR-2285f-1的上游序列(2 kb)存在1個轉錄起始位點,并且在軟件Neural Network Promoter Prediction 預測的2個轉錄起始位點中相近位置586 bp處存在一個轉錄起始位點。綜上,bta-miR-2285f上游序列586處為TSS,啟動子范圍為上游序列2 004～1 504 bp左右處。

軟件PROMOTER2.0預測結果表明,bta-miR-2285f-2的上游序列(2 kb)存在2個轉錄起始位點,在1 400 bp處得分為:0.64,但是其可信度較低(Marginal prediction)。軟件Neural Network Promoter Prediction 預測1個轉錄起始位點442 bp處得分為0.83其范圍為上游序列2 098～1 598 bp。

軟件PROMOTER2.0預測結果表明,TBK1的上游序列(2 kb)存在1個轉錄起始位點,在100 bp處得分為:0.684。軟件Neural Network Promoter Prediction 預測4個轉錄起始位點,并同樣在相近105 bp預測到轉錄起始位點,并且得分最高為0.95。綜上,宿主基因TBK1上游序列105 bp處為TSS,啟動子范圍區域為2 435～1 935 bp。(表3和表4)。

表3 PROMOTER2.0預測啟動子Table 3 Promoter of prediction by PROMOTER2.0

表4 Neural Network Promoter Prediction預測啟動子Table 4 Promoter of prediction by Neural Network Promoter Prediction

2.3 過表達bta-miR-2285f轉染效率

通過qRT-PCR,使用乳腺上皮細胞系作為體外模型,對bta-miR-2285f的過表達組以及NC組轉錄水平的相對表達量進行檢測。結果顯示,bta-miR-2285f過表達量是NC組的5 000多倍。bta-miR-2285f表達量極顯著高于NC組(P<0.01)(圖3)。結果表明,通過轉染bta-miR-2285f mimic可顯著增加bta-miR-2285f在乳腺上皮細胞系中的表達水平。

**表示差異顯著(P<0.05),***表示差異極顯著(P<0.01)。下同。** indicates significant difference (P<0.05),*** indicates extremely significant difference (P<0.01).The same below.

2.4 bta-miR-2285f的組織表達譜分析

通過qRT-PCR檢測bta-miR-2285f在中國荷斯坦奶牛各個組織中的表達水平,由圖4所示,bta-miR-2285f在奶牛乳腺、心臟、卵巢、腎臟、小腸和肝臟組織中廣泛表達其中在乳腺組織中表達量最高,在心臟和卵巢的表達量次之,在肝臟中的表達量最低(P<0.05)。

圖4 bta-miR-2285f在中國荷斯坦奶牛不同組織的表達水平Fig.4 Expression levels of bta-miR-2285f in different tissues of Chinese Holstein dairy cows

2.5 bta-miR-2285f的靶基因預測、GO和KEGG分析

采用TargetScan和miRWalk分別預測bta-miR-2285f的靶基因(圖5),后取其交集后獲得172個靶基因集進行KEGG通路注釋(圖6)和GO功能(圖7)。結果顯示,KEGG通路富集結果顯示,bta-miR-2285f的靶基因共注釋到172個信號通路。重點關注乳脂合成代謝相關通路,包括mTOR信號通路、PI3K-AKT信號通路、ErbB信號通路,Hippo信號通路以及甘油酯代謝通路。靶基因集合顯著富集的GO條目有854個。靶基因多處于細胞質中、細胞器內和細胞膜中,具有轉錄輔助因子活性和傳遞信息的分子作用。生物學過程中主要參與生物新陳代謝、維持細胞的動態性穩定、調節細胞代謝、細胞間信息傳遞以及細胞增殖、凋亡、免疫等。

圖5 Targetscanhuman7.2和miRWalk2.0數據庫對靶基因的預測Fig.5 Prediction of the target genes by Targetscanhuman7.2 and miRWalk2.0 database

(a)靶基因富集相關通路注釋;(b)靶基因富集前20信號通路。(a) Annotation of target gene enrichment related pathways;(b) Target genes were enriched in the top 20 signaling pathways.

圖7 bta-miR-2285f靶基因的GO分析Fig.7 GO analysis of bta-miR-2285f target genes

2.6 bta-miR-2285f和靶基因CAB39關聯分析

將bta-miR-2285f靶基因集合提交到STRING數據庫進行蛋白互作網絡分析,結果如圖8所示,乳脂相關的多個靶基因相互作用并共享功能。功能分析發現,通過在mTOR信號通路和PI3K-Akt信號通路中顯著富集的基因CAB39與10個基因具有互作關系(圖9(a)),并且參與的信號通路主要在AMPK信號通路、mTOR信號通路、脂肪細胞因子信號通路、FoxO信號通路、自噬、胰島素信號通路、催產素信號通路、PI3K-Akt信號通路。同時參與脂肪酸生物合成代謝、膽固醇生物合成以及多種氨基酸激酶活性調節過程,具有能量代謝和分子活性調節等多種功能(圖9(b))。因此選擇基因CAB39為后續進行與bta-miR-2285f的靶向驗證。

圖8 bta-miR-2285f靶基因蛋白互作網絡分析Fig.8 Protein interaction network analysis of bta-miR-2285f target gene

(a)靶基因CAB39互作基因網絡;(b)靶基因CAB39靶基因生物學功能(BP)和分子功能分析(MF)。(a) Target gene CAB39 interaction gene network;(b) Biological function and molecular function analysis of target gene CAB39.

2.7 bta-miR-2285f與CAB39的靶向關系驗證

由圖10(a)知,將CAB39基因的野生型和突變型重組質粒經過PCR分析,野生型重組質粒CAB39-3′UTR-WT質粒和突變型重組質粒CAB39-3′UTR-Mut質粒均構建成功。

(a)重組質粒酶切鑒定。其中①為添加野生型目的基因的pmirGLO載體,②為野生型重組質粒對照組,③添加突變型目的基因的pmirGLO載體,④為突變型重組質粒對照組,⑤為DNA maker。(b)雙熒光素酶活性檢測。mimic NC+CAB39-3′UTR-WT:共轉染bta-miR-2285f mimic NC和基因CAB39野生型重組質粒。mimic+CAB39-3′UTR-WT:共轉染bta-miR-2285f mimic和基因CAB39野生型重組質粒。mimic NC+CAB39-3′UTR-Mut:共轉染bta-miR-2285f mimic NC和基因CAB39突變型重組質粒。mimic+CAB39-3′UTR-Mut:共轉染bta-miR-2285f mimic和基因CAB39突變型重組質粒。(a) Identification of restriction enzyme products of recombinant plasmids.Among them,① is pmirGLO vector with wild-type target gene added,② is wild type recombinant plasmid control group,③ is pmirGLO vector with mutant target gene added,④ is mutant recombinant plasmid control group,and ⑤ is DNA maker.(b) Dual luciferase activity assay.mimic NC+CAB39-3′utr-wt:bta-miR-2285 fmimic NC and gene CAB39 wild type recombinant plasmid are co-transfected.mimic+CAB39-3′utr-wt:bta-miR-2285f mimic and CAB39 wild-type recombinant plasmid are co-transfected.mimic NC+CAB39-3′utr-mut:bta-miR-2285f mimic NC and CAB39 mutant recombinant plasmid were co-transfected.mimic+CAB39-3′utr-mut:bta-miR-2285f mimic and CAB39 mutant recombinant plasmid are co-transfected.

為驗證bta-miR-2285f是否直接靶向調節CAB39基因,將CAB39基因的野生型和突變型重組質粒與bta-miR-2285f mimic、mimic NC分別共轉染293T細胞,結果表明,bta-miR-2285f mimic與野生型重組質粒(CAB39-3′UTR-WT)共轉染組熒光素酶活性顯著低于NC組(P<0.05);而bta-miR-2285f mimic與突變型重組質粒(CAB39-3′ UTR-Mut)共轉染組熒光素酶活性與NC組無顯著差異(圖10(b))(P>0.05)。結果表明,CAB39為bta-miR-2285f的靶基因,bta-miR-2285f可以通過調控CAB39基因表達影響乳脂代謝過程。

2.8 bta-miR-2285f調控乳脂標志基因表達

為探究bta-miR-2285f在奶牛乳脂代謝中的潛在作用,將bta-miR-2285f mimic 和 inhibitor 轉染到乳腺上皮細胞中。結果發現,過表達bta-miR-2285f后,乳脂標志基因ELOVL6、SLC27A6、PPARG和FASN的mRNA表達量較對照組(NC)顯著增加(圖11(a))(P<0.05)。而轉染bta-miR-2285f inhibitor后,ELOVL6、SLC27A6、PPARG和FASN的mRNA表達量較對照組顯著降低(圖11(b))(P<0.05)。

圖11 bta-miR-2285f對不同乳脂標志基因的表達水平Fig.11 Expression levels of different milk fat marker genes by Bta-miR-2285f

3 討 論

哺乳動物中50%的miRNA屬于內含子miRNA(Intronic microRNA),其功能是與宿主基因拮抗或協同作用[17]。本研究通過生物信息學分析確定bta-miR-2285f是牛內含子miRNA,其宿主基因為TBK1。雖然TBK1以免疫作用而出名[18],但有研究表明,TBK1可以通過促炎細胞因子激活從而調節小鼠脂肪細胞的生長代謝[19]以及影響細胞凋亡與增殖[20]。TBK1通過影響糖原合成以及在促炎因子與抗炎因子的平衡過程中起關鍵作用的糖原合成激酶3β(Glycogen synthase kinase 3β)基因從而參與糖原合成和平衡促炎因子與抗炎因子的產生過程[21]。此外,TBK1在其他通路上也有著重要影響,如在胰島素信號轉導通路(TBK1作用于胰島素受體994位絲氨酸)[22],脂質代謝信號通路、與脂肪細胞合成有關的mTOR通路[23-24]等,因此,bta-miR-2285f對乳脂代謝調節可能反饋調節宿主基因TBK1的表達有關。

啟動子CpG島的DNA甲基化情況與基因的表達調控密切相關[25]。DNA甲基化是真核生物中一種重要的表觀遺傳修飾,它只發生在CpG雙核苷酸的胞嘧啶上[26]。DNA甲基化通過抑制轉錄因子在基因啟動子區域的結合,從而導致基因轉錄水平的下降甚至停止轉錄[27],以達到調控基因轉錄的目的。本研究通過對bta-miR-2285f上游區域(2 kb)和宿主基因上游(2 kb)分析表明不含有明顯的CpG島以及啟動子序列,表明其基因可能不是經典的CG-rich啟動子[28],說明該區域可能不受甲基化的影響。

內含子miRNA隨著宿主基因的啟動子共同轉錄,有共同的調節元件[29]。但是也有研究表明,內含子miRNA不隨著宿主基因的啟動子轉錄,有自己獨立的轉錄因子[30]。啟動子屬于DNA序列的一段,必須與相應的轉錄因子結合才能激活基因轉錄,不同的轉錄因子對基因的表達調控起著不同的作用,基因的表達是這些轉錄因子共同作用的結果[31]。本研究通過不同軟件對bta-miR-2285f-1、bta-miR-2285f-2和TBK1上游(2 kb)啟動子序列以及轉錄結合位點進行分析,發現多個啟動子以及轉錄因子結合位點。研究表明,鱈魚TBK1基因的基礎啟動子和陽性轉錄調節轉錄起始位點在上游-875 至-425 bp和-245至+28 bp的序列,與本試驗預測中國荷斯坦奶牛TBK1基因預測結果相接近[32]。miRNA也可以通過影響基因啟動子的CpG島甲基化,從而在轉錄水平上直接調控靶基因的表達變化[33]。所以通過對miRNA及其宿主基因CPG島并結合啟動子、轉錄因子結合位點分析,有助于了解miRNA如何反饋調節宿主基因表達,為后續試驗提供理論依據。

MicroRNA(miRNA)在轉錄水平后與靶基因結合從而發揮調控作用。所以通過預測靶基因并對其所富集通路進行分析可以對研究miRNA的功能機制有著指向作用。通過TargetScan數據庫和miWalK數據庫對bta-miR-2285f預測并取交集獲得靶基因,對其顯著富集的前20個通路進行分析。發現候選靶基因主要參與脂質代謝相關的通路,其中mTOR信號通路能夠促進脂肪合成[34]、甘油酯代謝通路、PI3K-Akt信號通路主要與脂肪代謝有關[35]、ErbB信號通路可以激活Akt信號通路和MAPK信號通路從而調控脂肪代謝[36]、Hippo信號通路能夠抑制成熟脂肪細胞的生成[37]。同時,通過對bta-miR-2285f富集通路進行分類注釋可以發現,bta-miR-2285f 還顯著富集于免疫疾病相關通路中,其可能原因可能與宿主基因TBK1的免疫調控有關。

雙熒光素酶試驗表明,bta-miR-2285f mimic+CAB393′-UTR野生型組與bta-miR-2285f mimic NC組相比,野生型組的相對熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。然而,在突變組中沒有觀察到熒光活性的變化,這表明CAB39是bta-miR-2285f的一個靶基因。有研究表明,小鼠中CAB39可以激活AMPK通路從而控制脂肪細胞的脂肪生成和脂肪溶解[38]。CAB39基因通過AMPK/Akt信號通路抑制脂肪酸誘導促炎細胞因子的產生[39]。Wang等[340]研究表明,CAB39基因可以作用于PI3K-Akt通路調控人機體葡萄糖攝取代謝。CAB39基因通過激活mTOR信號通路影響細胞的增殖和凋亡[41]。通過對CAB39蛋白互助網絡分析,可以關注到基因CAB39與脂質代謝密切相關。通過對CAB39互作基因的KEGG和GO分析可知CAB39互作基因可以調控蛋白質、葡萄糖、甘油酯的代謝,由此推斷bta-miR-2285f可通過與CAB393′-UTR結合來調控基因CAB39的表達,從而發揮對乳代謝調控作用。通過對miRNA靶基因預測及其功能分析,靶向關系驗證對miRNA調控乳脂代謝提供了參考。

bta-miR-2285f對乳脂標志基因的表達含量的檢測結果表明,bta-miR-2285f能夠顯著調控ELOVL6、PPARG、FASN和SLC27A6基因。ELOVL6是一些哺乳動物內源性合成飽和和單不飽和長鏈脂肪酸的重要蛋白質[42]。ELOVL6同時也是影響乳脂表達的標志基因。PPARG能夠促進奶牛乳腺上皮細胞甘油三酯的合成[43]。FASN在中國荷斯坦牛乳脂合成和代謝中起著重要作用[44]。同時研究發現,ELOVL6基因表達量上調會促進PPARG、FASN的表達量[45]。SLC27A6基因能夠調節脂肪酸在牛乳腺中向大量乳脂合成[46-47]。bta-miR-2285f在中國荷斯坦牛不同組織中乳腺表達水平最高(P<0.05),表明bta-miR-2285f在乳腺上皮細胞中高表達可能影響乳脂標志基因的表達從而促進乳脂的分泌。為后續bta-miR-2285f對乳中甘油三酯,脂滴的影響提供了一定的依據。

4 結 論

綜上所述,牛特異性bta-miR-2285f在乳腺組織中的表達水平最高,其靶基因集合在mTOR信號通路、PI3K-AKT信號通路、ErbB信號通路、Hippo信號通路以及甘油酯代謝等乳脂代謝相關的信號通路中顯著富集。構建了可能影響乳脂代謝bta-miR-2285f-mRNA調控網絡,并證明了bta-miR-2285f可以直接靶向CAB39的3′UTR。此外,bta-miR-2285f mimic可以顯著上調乳腺上皮細胞中乳脂標志基因ELOVL6、SLC27A6、PPARG和FASN的表達。該研究結果為進一步探究bta-miR-2285f調節中國荷斯坦奶牛乳脂合成代謝的潛在機制提供理論基礎。