eIF5A基因敲除MARC-145多克隆細胞系的建立及其對PRRSV增殖的影響

李華瑋 王旭英 井匯源 萬 博 喬宏興 郭科威 侯文靜

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院 食品與生物工程學院,鄭州 450046;2.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院 畜產(chǎn)品質(zhì)量安全技術(shù)研究院,鄭州 450046;3.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院 動物醫(yī)藥學院,鄭州 450046;4.河南農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院,鄭州 450046)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的豬繁殖障礙和呼吸系統(tǒng)的急性、高度接觸性傳染病[1]。PRRSV屬于動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬,單股正鏈、不分節(jié)段的RNA病毒,有囊膜包裹,基因組全長為15.4 kb,編碼 10個開放閱讀框[2]。根據(jù)抗原的差異性PRRSV分為兩種類型,即PRRSV I型和PRRSV II型,兩種基因型間氨基酸的相似性78%～81%[3-4]。PRRS傳染性強、流行范圍廣、危害持久,嚴重損害世界養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[5-7]。PRRSV在我國不斷變異、進化,多種毒株并存的局面讓PRRS防控成為棘手問題。病毒沒有自身的復制體系,必須通過劫持宿主的翻譯系統(tǒng)完成自身復制,真核生物翻譯起始因子(Eukaryotic translation initiation factors,eIFs)則是幫助病毒實現(xiàn)這一生物學過程的關(guān)鍵宿主蛋白。大量研究表明,eIFs與多種病毒存在直接或間接的相互作用[8-10]。病毒可以通過調(diào)控eIFs表達及修飾,抑制核糖體對宿主 mRNA招募或影響翻譯起始復合體活性等方式,創(chuàng)造有利于自身復制的環(huán)境。

真核翻譯起始因子5A(Eukaryotic translation initiation factor 5A,eIF5A)廣泛存在于各種真核細胞中,是唯一包含羥脯胺酸修飾的蛋白[11-12]。羥脯胺酸修飾合成過程需要脫氧羥脯胺賴氨酸合酶和脫氧羥脯胺賴氨酸羥化酶2個關(guān)鍵酶參與[13]。只有經(jīng)過羥脯胺酸修飾,eIF5A才具有活性。有研究表明eIF5A與病毒感染密切相關(guān),人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)輔助因子Rev蛋白能與eIF5A結(jié)合,eIF5A功能缺失突變體阻斷了Rev蛋白核輸出和HIV的復制[14]。酵母雙雜交技術(shù)進一步發(fā)現(xiàn)HIV Rev蛋白通過eIF5A與核糖體蛋白L5形成復合物而獲得病毒mRNA核輸出路徑,用核糖體蛋白L5抗體處理細胞會導致病毒mRNA不能正常運輸至細胞質(zhì),HIV結(jié)構(gòu)蛋白不能合成[15]。另有研究表明,埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)需要多胺和eIF5A羥脯氨酸修飾進行復制[16]。使用脫氧羥脯胺賴氨酸合酶的小分子抑制劑GC7處理細胞能有效地阻斷EBOV復制,并使其滴度下降約30%[17]。eIF5A在登革熱病毒感染時起到了防止細胞死亡的作用,促進登革熱病毒在細胞中的持續(xù)性感染[18]。課題組前期研究表明,PRRSV感染PAMs后eIF5A等翻譯相關(guān)蛋白顯著下調(diào)[19],但eIF5A是否能調(diào)控PRRSV復制尚未可知。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)首次在古生物和細菌中被發(fā)現(xiàn),其作用是降解序列特異性DNA[20-25]。本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建敲除eIF5A基因的MARC-145多克隆細胞系,通過間接免疫熒光(IFA)、熒光定量PCR(Real-time PCR)、免疫印跡(Western blot)和病毒滴度(TCID50)測定來驗證病毒在敲除eIF5A的MARC-145-△eIF5A多克隆細胞系的增殖情況。本研究為探索eIF5A調(diào)控PRRSV增殖的分子機制提供理論基礎,也為抗PRRSV新藥的篩選提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1細胞、病毒及載體

HEK293T和MARC-145細胞均由河南省非常規(guī)飼料資源創(chuàng)新利用重點實驗室保存并穩(wěn)定傳代。PRRSV HN07-1毒株為河南農(nóng)科院動物免疫學重點實驗室惠贈(GenBank登陸號為KX766378.1)。慢病毒載體LentiCRISPR v2、輔助質(zhì)粒Pmd2.G和psPAX2均購自Addgene公司。

1.1.2主要試劑

質(zhì)粒提取試劑盒購自TIANGEN公司,限制性內(nèi)切酶BsmbⅠ、DMEM細胞培養(yǎng)液購自Thermo Fisher;T4 DNA連接酶、T7E1酶購自NEB公司;DNA凝膠回收試劑盒、ECL發(fā)光試劑盒、嘌呤霉素、Lipo8000TM轉(zhuǎn)染試劑、RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;胎牛血清購自杭州四季青有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa 公司;熒光定量檢測試劑盒購自Roche公司;Trizol試劑購自Invitrogen公司;MTS試劑盒購自Promega公司;FITC標記的羊抗鼠IgG及羊抗兔IgG、HRP標記的羊抗鼠及羊抗兔IgG購自Abbkine公司;PRRSV N蛋白單克隆抗體購自VMRD公司;eIF5A蛋白單抗購自Cell Signaling公司。

1.2 試驗方法

1.2.1sgRNA序列的設計與合成

利用NCBI(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站查閱豬基因組eIF5A序列(GenBank登陸號為XM_005655285.2),然后根據(jù)網(wǎng)站(http:∥crispr.mit.edu/)設計相關(guān)sgRNA基因序列(表1),分別命名為sgRNA1-4,經(jīng)軟件預測和預試驗,sgRNA1 編輯效率最高,可用于做后續(xù)試驗。

表1 sgRNA序列信息Table 1 Information of sgRNA sequence

1.2.2LentiCRISPRv2-sgRNA載體構(gòu)建

使用BsmbⅠ限制性內(nèi)切酶,在37 ℃的條件下對LentiCRISPR v2載體酶切。4 h后使用瓊脂糖凝膠電泳檢測并用DNA回收試劑盒純化。利用T4 DNA連接酶,將回收產(chǎn)物與經(jīng)退火形成雙鏈的sgRNA1在16 ℃條件下連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞E.ColiTop10,隨后涂布于氨芐抗性的固體LB平板并培養(yǎng)過夜,挑取單克隆震蕩培養(yǎng),并提取質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒命名為LentiCRISPRv2-sgRNA1,挑取單個菌落進行基因測序鑒定,測序正確的質(zhì)粒用于后續(xù)試驗。

1.2.3eIF5A敲除多克隆細胞系的構(gòu)建

將生長對數(shù)期的HEK293T細胞均勻接種至10 cm細胞培養(yǎng)皿,待細胞密度達80%左右時,將重組質(zhì)粒LentiCRISPRv2-sgRNA1與慢病毒包裝質(zhì)粒pMD2.G、psPAX2按一定的比例(4∶3∶1)共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,同時設立轉(zhuǎn)入空載體的對照組細胞,2 d后收集慢病毒。將MARC-145細胞接種至12孔細胞板,待生長密度達到40%時,將MOI=1的慢病毒接種至MARC-145細胞。培養(yǎng)24 h,換用含有7 μg/mL的嘌呤霉素生長液。對照組細胞徹底死亡后,消化收集試驗組細胞,轉(zhuǎn)移至含有5 μg/mL嘌呤霉素生長液中擴大培養(yǎng)。獲得的細胞使用有限稀釋法進行篩選:用含有5 μg/mL嘌呤霉素生長液稀釋細胞,將細胞懸液加入96孔細胞培養(yǎng)板中,每孔加0.1 mL(約5.5個細胞/孔)。使用含有5 μg/mL嘌呤霉素生長液作倍比稀釋,直至使每孔含一個細胞。培養(yǎng)7～10 d后,選擇單個克隆生長的陽性孔再擴大培養(yǎng)。

1.2.4eIF5A基因敲除多克隆細胞系的鑒定

1.2.4.1 Real-time PCR檢測

收集對照組細胞和篩選得到的細胞,使用Trizol法提取細胞RNA并反轉(zhuǎn)錄,將得到的cDNA作為模板進行Real-time PCR檢測,反應程序為:95 ℃ 5 min預變性,95 ℃ 15 s、65 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min 重復50個循環(huán),最后60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s完成檢測。引物信息見表2。

表2 本研究中PCR引物序列信息Table 2 PCR primer sequences in the study

1.2.4.2T7E1核酸內(nèi)切酶檢測

以提取的基因組為模板,利用設計好的引物進行PCR擴增(表2),反應條件為:95 ℃ 30 s預變性,95 ℃ 15 s,65 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s重復30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后,膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化。使用T7E1酶,37 ℃ 孵育1 h后,通過瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物。

1.2.4.3 Western blot檢測

將篩選細胞均勻傳代至平皿中,待細胞長滿平皿80%后,消化收集至EP管,每管樣品約107個細胞,用RIPA裂解液冰上超聲細胞,加入5×上樣緩沖液100 ℃煮沸5 min后進行SDS-PAGE,將條帶轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,5%脫脂奶封閉1 h,然后以eIF5A兔源單抗作一抗(1∶1 000稀釋使用),HRP標記的羊抗兔IgG為二抗(1∶5 000稀釋使用)37 ℃孵育1 h,最后使用ECL化學發(fā)光試劑顯影成像。

1.2.5eIF5A基因敲除后MARC-145細胞活性的影響

MTS法可用于檢測細胞增殖活性和細胞毒性,利用活細胞中的線粒體脫氫酶將MTS 還原產(chǎn)生可溶性的褐黃色物質(zhì)這一反應,測定490 nm 波長處OD值,推算出細胞的存活率。分別將篩選得到的細胞和對照組細胞,按每孔1×104的數(shù)量接種至96孔板中,每孔加入10 μL MTS試劑,輕微震蕩混勻,然后于培養(yǎng)箱中37 ℃孵育4 h,用酶標儀于490 nm處測定OD值。

1.2.6eIF5A敲除對PRRSV滴度的影響

將篩選得到的細胞命名為MARC-145-△eIF5A細胞系,以轉(zhuǎn)入空載體LentiCRISPR v2的MARC-145細胞為對照,分別將MARC-145-△eIF5A細胞系和對照組細胞接種到96孔培養(yǎng)板培養(yǎng),細胞長至80%左右時,將PRRSV配制成10-1～10-1010個濃度梯度,分別接種到MARC-145-△eIF5A細胞孔中,37 ℃培養(yǎng)4～6 d后觀察并記錄CPE,通過Reed-Muench兩氏法計算病毒的TCID50值。

1.2.7eIF5A敲除對PRRSV ORF7 mRNA表達的影響

將對照組細胞和MARC-145-△eIF5A細胞均勻傳代至24孔板中,細胞密度達到80%后接種MOI=0.1的PRRSV,收集24 h的細胞,提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,通過Real-time PCR檢測PRRSV在MARC-145-△eIF5A細胞的增殖情況。PRRSV的Real-time PCR檢測方法及反應條件同1.2.4.1,使用引物信息見表2。

1.2.8eIF5A敲除對PRRSV N蛋白表達的影響

通過IFA法,將對照組細胞和MARC-145-△eIF5A細胞均勻傳代至24孔板中,待細胞密度達到80%以上時,接種MOI=0.1的PRRSV,24 h后收獲細胞,用預冷的95%甲醇固定細胞15～20 min,5%脫脂奶于37 ℃封閉1 h,PBST洗滌細胞3次,以PRRSV N蛋白單抗為一抗(1∶500稀釋使用),FITC標記的羊抗兔IgG為二抗(1∶1 000稀釋使用)于37 ℃各避光孵育1 h,避光環(huán)境下每孔覆蓋DAPI顯色液5 min,用PBST洗滌3～5次,在IX53型熒光倒置顯微鏡下觀察結(jié)果。

Western blot試驗方法同1.2.4.3,以PRRSV N蛋白單抗為一抗,HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗,用ECL化學發(fā)光法顯色并觀察結(jié)果。

1.2.9數(shù)據(jù)統(tǒng)計

各試驗均平行重復3次,采用Graphpad 8.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行t-test統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 LentiCRISPRv2-sgRNA載體構(gòu)建

在37 ℃的條件下,用Bsmb Ⅰ對LentiCRISPR v2質(zhì)粒線性化,4 h后使用瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。目的片段用DNA膠回收試劑盒進行回收純化,然后連接sgRNA,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入TOP10感受態(tài)細胞,構(gòu)建重組質(zhì)粒LentiCRISPRv2-sgRNA1。經(jīng)過測序比對發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒LentiCRISPRv2-sgRNA1構(gòu)建成功(圖1)。

(a)構(gòu)建模式圖;(b)測序結(jié)果(a) Construction pattern diagram;(b) The results of sgRNA sequencing

2.2 MARC-145-△eIF5A多克隆細胞系的鑒定

收集對照組細胞和敲除eIF5A的細胞系,提取細胞總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,利用Real-time PCR方法檢測eIF5A基因在MARC-145對照、MARC-145-△eIF5A細胞中表達量的變化。圖2(a)MARC-145-△eIF5A細胞中eIF5A基因的mRNA相對表達量顯著低于對照組細胞(P<0.05),表明設計的sgRNA具有較高的編輯效率,能夠顯著降低eIF5A表達。提取細胞基因組后,以其作為模板進行PCR擴增,PCR產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒純化,按照T7E1核酸內(nèi)切酶說明書對多克隆細胞基因組進行酶切,檢測編輯效率。由圖2(b)可知,第4條泳道出現(xiàn)了小分子量條帶,表明sgRNA1能有效對eIF5A基因進行編輯。由圖2(c)可知,收集對照組細胞和MARC-145-△eIF5A細胞的蛋白樣品,進行Western blot檢測。結(jié)果顯示與對照組細胞相比MARC-145-△eIF5A細胞中eIF5A蛋白表達顯著降低。綜上,敲除eIF5A的MARC-145細胞系MARC-145-△eIF5A構(gòu)建成功。

(a)Real-time PCR檢測;(b)T7-E1酶切鑒定。1:DL 2 000 Marker;2:對照;3:sgRNA-eIF5A;4:對照+T7E1;5:sgRNA-eIF5A-T7E1;(c)Western blot鑒定。**P<0.01。(a) Detection of real-time PCR;(b) Restriction enzyme digestion.1:DL 2 000 Marker;2:Control;3:sgRNA-eIF5A;4:Control+T7E1;5:sgRNA-eIF5A-T7E1;(c) Western blot.

2.3 eIF5A基因敲除對MARC-145細胞活性的影響

將MARC-145細胞和MARC-145-△eIF5A傳代培養(yǎng),待細胞生長密度達到80%時,分別于0、6、12和24 h使用MTS試劑盒檢測490 nm波長下的吸光度值。結(jié)果顯示:MARC-145-△eIF5A細胞與對照組細胞MARC-145相比,490 nm波長下的吸光度值無顯著差異,表明eIF5A基因的敲除對MARC-145細胞的增殖無顯著影響(P>0.05)(圖3)。

圖3 eIF5A基因敲除對MARC-145細胞活性的影響Fig.3 Effect of eIF5A gene knockout on cell viability of MARC-145 cells

2.4 eIF5A敲除對PRRSV增殖的影響

用PRRSV分別感染MARC-145細胞和MARC-145-△eIF5A多克隆細胞系。設置12和 24 h 2個比較組,由Real-time PCR結(jié)果可知(圖4(a)),與對照組相比PRRSV感染MARC-145-△eIF5A細胞系病毒ORF7 mRNA表達量顯著降低(P<0.05),說明體外敲除eIF5A可顯著抑制PRRSV復制。通過Western blot檢測PRRSV感染12和24 h的細胞樣品,結(jié)果顯示MARC-145-△eIF5A細胞系PRRSV N蛋白的表達顯著低于對照組(圖4(b)),表明體外敲除eIF5A能夠顯著抑制PRRSV N蛋白的表達。通過IFA檢測PRRSV感染MARC-145細胞和MARC-145-△eIF5A細胞24 h的細胞樣品,以PRRSV N蛋白單抗為一抗,FITC標記的羊抗鼠抗體為二抗,在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)MARC-145-△eIF5A細胞系與對照組相比熒光均有不同程度的減少(圖4(c)),說明體外敲除eIF5A可顯著抑制PRRSV復制。用PRRSV分別感染MARC-145細胞和MARC-145-△eIF5A細胞系,從TCID50結(jié)果可知(圖4(d)),MARC-145-△eIF5A細胞系PRRSV病毒滴度顯著低于對照組(P<0.05),這表明體外敲除eIF5A可顯著抑制PRRSV的滴度(P<0.01)。

(a)Real-Time PCR檢測PRRSV ORF7 mRNA的表達量;(b)Western blot檢測PRRSV N蛋白的表達;(c)IFA檢測PRRSV N蛋白的表達;(d)TCID50檢測PRRSV濃度。*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。(a) Identification of the mRNA expression of PRRSV N protein by real-time PCR;(b) Identification of the expression of PRRSV N protein by Western blot;(c) Identification of the expression of PRRSV N protein by IFA;(d) Identification of PRRSV titer by TCID50.

3 討 論

PRRSV是危害我國生豬生產(chǎn)的重大流行病之一,由于PRRSV在豬體內(nèi)增殖十分迅速,并且具有易變異和持續(xù)性感染等特點,使得當前PRRSV的防控具有較大難度,迫切需要尋找新藥靶點,研制有效的治療藥物[26]。Wang等[27]研究發(fā)現(xiàn)OAS1b的過表達可抑制PRRSV的復制,而OAS1b RNA沉默導致病毒滴度增加。此外,OAS1b促進了干擾素的表達以及干擾素-β啟動子的活性。TRIM(Tripartite motif,TRIM)家族成員是對抗病毒感染的先天免疫反應的重要效應物。Wei等[28]對豬的TRIM(pTRIM)家族進行了表征,并預測pTRIM5、14、21、25和38是抵抗PRRSV感染的宿主限制因子。pTRIM21過表達可以明顯抑制PRRSV的復制,但不影響PRRSV附著和內(nèi)吞作用。DDX21是DDX家族成員,除了調(diào)節(jié)細胞RNA代謝的功能外,DDX21還調(diào)節(jié)先天免疫,并參與一些病毒的復制周期。DDX21的過表達可促進PRRSV的復制,而DDX21敲除則抑制PRRSV的增殖,進一步研究發(fā)現(xiàn)敲除DDX21可激活PRRSV感染細胞的IFN-β信號通路,促進IFN-β的表達抑制PRRSV復制[29]。

課題組前期在PRRSV感染PAMs蛋白質(zhì)組學研究中發(fā)現(xiàn)eIF5A在PRRSV感染細胞后顯著下調(diào),推測其是調(diào)控PRRSV復制的潛在藥物靶點[19]。eIF5A也被稱為eIF4D,是從未成熟的紅細胞中分離出來的。它是一種分子質(zhì)量為17 ku的酸性蛋白質(zhì),從酵母到人類高度保守。近年來,eIF5A在翻譯過程中的功能得到了廣泛研究,eIF5A與核糖體中翻譯功能相關(guān)的區(qū)域結(jié)合,促進了多脯氨酸鏈的延伸。eIF5A也與真核mRNA的3′端多聚腺苷酸化尾結(jié)合,并在翻譯終止中發(fā)揮重要作用。eIF5A另一個重要功能是介導mRNA的核質(zhì)轉(zhuǎn)運,保證mRNA在細胞核和細胞質(zhì)中的平衡分布[30]。eIF5A及其羥脯氨酸修飾在HIV以及EBOV復制中的作用已被證實,而eIF5A對PRRSV復制的影響尚未見報道。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)首次在MARC-145細胞對eIF5A基因成功敲除,構(gòu)建了MARC-145-△eIF5A多克隆細胞系,研究eIF5A對PRRSV感染的影響。通過IFA、Western blot證實eIF5A基因敲除可顯著抑制PRRSV N蛋白的表達,Real-time PCR試驗證實MARC-145-△eIF5A細胞系中PRRSV ORF7 mRNA的表達顯著低于對照組,TCID50試驗證實MARC-145-△eIF5A細胞系中子代病毒的滴度顯著低于對照組。以上結(jié)果均說明體外敲除eIF5A對PRRSV復制有抑制作用。說明eIF5A是抑制PRRSV復制的潛在藥物靶點。PRRSV RNA基因組的復制是一個十分復雜的過程,涉及到由病毒和細胞成分組成的復制和轉(zhuǎn)錄復合物的組裝[31-33],推測宿主細胞中eIF5A的缺失有可能影響了PRRSV轉(zhuǎn)錄復制復合體的形成,從而抑制了PRRSV的復制。本研究為新型抗PRRSV藥物的研發(fā)提供理論依據(jù),也為PRRSV的防控提供新思路。但目前eIF5A對PRRSV復制的調(diào)控機制尚未明確,尚需要進一步深入研究。