新疆部分地區環形泰勒蟲Tams1基因型及遺傳多樣性分析

葛曉敏 溫麗翠 繆榮浩 李才善 劉凱強 陳宋琴 鄭會珍 巴音查汗 郭慶勇

(新疆農業大學 動物醫學學院,烏魯木齊 830052)

環形泰勒蟲(Theileriaannulata)是由璃眼蜱屬傳播的頂復門專性細胞內寄生蟲,經蜱吸血時釋放子孢子入侵并感染宿主白細胞,發育為裂殖體,成熟后由白細胞釋放裂殖子感染紅細胞形成梨形蟲體[1]。環形泰勒蟲在國內外分布廣泛;其感染牛單核細胞/巨噬細胞、B淋巴細胞和紅細胞,導致淋巴結腫大、體溫升高、貧血和消瘦等,是造成致命性淋巴組織增生疾病的主要病原[2-3]。由于治療成本高、抗蜱控制策略不完善和動物死亡率高等,環形泰勒蟲病對養牛業造成較大的經濟影響[4-5]。環形泰勒蟲生命周期涉及宿主體內無性繁殖和媒介蜱體內有性繁殖階段[1,6]。Tams1蛋白作為免疫顯性主要裂殖子表面抗原能引發針對環形泰勒蟲的保護性反應,并且Tams1編碼基因已開發用于PCR檢測[7]。Tams1多樣性由無性繁殖時核苷酸的隨機突變和生物學優勢的變化而產生,且未表現出地理特異性,因此被用于ELISA檢測等[8]。Tams1是由寄生蟲單倍體基因組中的單個拷貝基因編碼的,目前,尚無證據表明Tams1的多樣性是由于基因家族成員的差異表達所致[9]。印度、伊朗和突尼斯先前也報道了基于環形泰勒蟲Tams1基因的序列和系統發育分析[10]。研究Tams1的系統發育變異性和分子遺傳特性有助于了解環形泰勒蟲的分子進化史與新環形泰勒蟲的出現、爆發與傳播之間的關系。新疆環形泰勒蟲病在多個地區發生不同程度的流行[11],本研究團隊前期研究發現,近幾年吐魯番和阿勒泰等地區發病率持續增多,且夏季多發[12-13]。目前,新疆地區環形泰勒蟲Tams1基因多應用于PCR檢測及抗原制備階段,尚未對其分型情況進行研究。

為初步了解新疆地區環形泰勒蟲Tams1基因型及遺傳多樣性,本研究基于Tams1基因的檢測方法對新疆4個地區的牛血DNA進行PCR檢測,克隆測序獲得環形泰勒蟲Tams1序列,通過比對Tams1核苷酸和氨基酸序列,對環形泰勒蟲Tams1基因型和遺傳多樣性進行分析。本研究有助于了解新疆地區不同環形泰勒蟲種群的分布情況,并采取不同措施來防控環形泰勒蟲病,為制定有效診斷方法分析提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 血液DNA樣品的采集和分離

2022年4～6月在新疆艾丁湖(吐魯番)地區采集具有發熱、體表淋巴結腫大、結膜黃染、貧血、呼吸衰竭及虛弱等臨床癥狀的奶牛全血,將其置于含乙二胺四乙酸(EDTA)的5 mL抗凝管內,按照全式金基因組DNA提取試劑盒說明書提取牛全血基因組DNA,存于-20 ℃冰箱備用。此外,新疆農業大學動物醫學學院寄生蟲實驗室保存了托克遜(吐魯番)、青河(阿勒泰)、伊吾(哈密)地區的少量牛血DNA。

1.2 試劑及儀器

2×EcoTaq PCR Super Mix、DL-2000 Marker購自天根生化科技(北京)有限公司;血液DNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術股份有限公司;PMD19-T、DH5α感受態細胞購自寶日醫生物技術(北京)有限公司;PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR儀、紫外凝膠成像儀(型號為 Gel Doc2000)購自伯樂生命醫學產品(上海)公司;

1.3 Tams1基因PCR擴增及測序

參考文獻[10]中合成環形泰勒蟲Tams1引物(F:5′-CCGTTAATGCTGCAAATGAGGAGG-3′;R:5′-GAGGCGAAGACTGCAAGGGGAG-3′)進行Tams1基因序列擴增,片段大小751 bp。PCR擴增體系為:2×EcoTaq PCR SuperMix 25 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL,模板DNA 2 μL,加ddH2O至50 μL。PCR擴增程序為:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min,35個循環,72 ℃ 10 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,紫外凝膠儀下觀察。選取不同地區陽性樣品的Tams1產物克隆到PMD19-T載體并轉化至感受態DH5α細胞,涂板選陽性單菌落培養并進行菌液PCR驗證,每個樣品選取PCR檢測條帶最亮的2管菌液提取質粒,送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.4 Tams1基因序列的系統進化分析

將測序正確的新疆地區23條序列進行比對,從目的片段兩端截短以獲得同源核苷酸數據集[14],截短依據分別對應于環形泰勒蟲(MF346014,India)基因序列的第13位和第745位。同時,在GenBank中下載別國已上傳的Tams1序列,并根據文獻[10]篩選印度地區已證實的不同基因型(G1～G3型)的9條序列共同構建系統進化樹。

用MEGA7.0軟件中Clustal W算法,設置基本參數:最大似然法(ML),Bootstrap值為1 000,Tamura-Nei(T92+G+I)模型(+G=0.297 6;+I=34.69%位點)對序列進行比對,將萊氏泰勒蟲(LC430946,Iran)的MS-1基因序列作為外群。該分析涉及到47條核苷酸序列,最終數據集共有722個比對位置。

1.5 序列分析

為分析序列的變異,對新疆地區23條環形泰勒蟲的Tams1基因序列比對分析。使用BioEdit7.0程序計算多序列比對及核苷酸和氨基酸同一性百分比。使用DnaSP6.0估計種群多樣性指數和中性檢驗[15]。使用Network 10構建中值連接樹來進行單倍型網絡分析。本研究所有46條序列詳細信息見表1。

表1 Tams1分離株序列信息Table 1 Tams1 isolate sequences information

1.6 N-糖基化位點預測

糖蛋白的基本結構蛋白鏈與糖鏈通過共價鍵相連,蛋白鏈上連接糖鏈的位點稱為糖基化位點(Glycosylation sites)。糖基化位點在確定相關蛋白質的特性方面具有重要作用,比如抗原特性等[11]。由于糖基化屬于一種蛋白質翻譯后修飾,因此本研究僅在氨基酸水平上預測潛在的糖基化位點。使用NetNGlyc Server在線網站將蛋白質氨基酸序列上傳并預測序列中N-糖基化位點。

1.7 二級結構、同源性建模與抗原表位預測

使用幾種蛋白質預測程序,即SOPMA、ExPASy、SignalP 5.1、EzMol等,預測環形泰勒蟲Tams1基因序列的二級結構與抗原表位。使用SWISS-MODEL預測Tams1蛋白三級結構并自動同源模型。

2 結果與分析

2.1 Tams1基因PCR擴增

對環形泰勒蟲Tams1基因擴增產物進行電泳,出現約751 bp的特異性條帶且與預期片段大小一致(圖1)。

M:DNA標志物;1～5:擴增產物;6:陰性對照M:DNA Marker;1-5:Amplification products;6:Negative control

2.2 基于Tams1基因的多序列比對和系統發育分析

經測序證實后,通過最大似然法(ML)對Tams1基因核苷酸序列構建系統發育樹(圖2)。所有序列被分為兩大支,在第一支中發現多系聚類,而第二支中僅包含2個聚類且與已報道的兩類分型對應[10];可能由于所選擇的建樹參數有差異,因此第二支以92%相似性聚在一起;根據已報道的分型命名,G1、G2和G3基因型分別由40、3和3條序列組成,因此G1為主要基因型。新疆地區的23條序列,除伊吾地區2號樣品序列被歸為G3型,其余均屬于G1型,因此本次采集的樣本中環形泰勒蟲Tams1基因G1型為主要基因型。所有3種基因型中未觀察到地理從屬關系。

2.3 環形泰勒蟲Tams1基因序列分析

對新疆地區Tams1序列進行分析,在核苷酸與氨基酸水平上分別具有90.1%～100%(左下方)和83.9%～100%(右上方)的相似性,為方便呈現,表格僅展示部分序列(表2)。同時,發現整個共有序列中存在序列變異,尤其在核苷酸的168～217和479～528位置之間檢測到廣泛序列變異(圖3),其中G2和G3在168～217位置序列一致性較高(橘色虛線框區域),而在479～528位置序列差異較顯著(藍色虛線框區域);該數據結果與系統進化樹結果相對應。

表2 環形泰勒蟲新疆地方Tams1核苷酸和氨基酸序列的相似性Table 2 The similarity of nucleotide and amino acid sequences of Tams1 isolated from Xinjiang of T.annulata %

據上述分析發現新疆地區序列多屬于G1型,因此,選取本研究所有序列共46條進行序列變異及中性測試指標分析,結果見表3。檢測到高單倍型多樣性(Hd)和低核苷酸多樣性(π)。本研究的46條Tams1基因序列的總單倍型(Hd)和核苷酸多樣性(π)分別為0.994±0.006和0.071±0.002。序列組合數據集的Hd>0.5,反映了較高的遺傳多樣性。任意2個序列之間的平均核苷酸差異數非常高(k=52.32)。在3種基因型中觀察到了38個單倍型(h)。中值連接的單倍型網絡共顯示38種單倍型,其中一些單倍型由多個序列組成(圓圈大小)。與基因型1的單倍型相比,基因型2和3的單倍型彼此之間的關系更密切(圖4)。此外,Tajima’s D和Fu-Li’s F檢驗總體數值大于零,表明該基因單倍型數大于多態位點個數,呈現平衡選擇。

G1型:黃色圓圈;G2型:綠色圓圈;G3型:紅色圓圈;圓圈大小:分離株的數量(成正比)。G1:Yellow circle;G2:Green circle;G3:Red circle;Circle size:Number of isolates (proportional).

表3 Tams1基因型G1～G3的單倍型、核苷酸多樣性和中性測試Table 3 Haplotype/nucleotide diversity and neutrality tests of genotypes G1-G3 based on the Tams1 gene

2.3.1環形泰勒蟲Tams1基因型1(G1)

由新疆地區22條序列組成,且序列在核苷酸和氨基酸上相似性為97.6%～100%和96.3%～100%。該基因型的單倍型(Hd=0.994±0.008)和核苷酸(π=0.052±0.004)多樣性最高;此外,具有最多的多態性位點(S=164)、單倍型數(h=33)及核苷酸差異數(k=49.35)。證實了G1基因型中存在最高的遺傳多樣性水平。Tajima’s D和Fu-Li’s F檢驗值大于零,表明是平衡選擇(表3)。

2.3.2環形泰勒蟲Tams1基因型2(G2)

本研究在新疆未檢測到該型。由印度2條和意大利1條分離株組成,序列在核苷酸和氨基酸水平分別表現出98.0%～100%和86.1%～100%的相似性。G2型的Hd和π分別為0.997±0.027和0.012±0.003。S=13、h=3和k=9.33的數量表明該基因型存在中等水平的遺傳多樣性(表3)。

2.3.3環形泰勒蟲Tams1基因型3(G3)

新疆伊吾地區2號樣本序列為該型,同時還有印度2條分離株共同組成。G3型核苷酸和氨基酸水平分別表現出94.3%～100%和83.7%～100%的相似性。該型的Hd和π分別為0.667±0.031和0.024±0.004;S=10、h=2和k=6.43(表3)。

在線軟件對N-糖基化位點預測結果顯示新疆氨基酸序列含有潛在糖基化位點,但不包含信號肽,因此在體內糖基化可能不會被激活。

2.4 Tams1基因型分布情況

本研究發現環形泰勒蟲最常見G1基因型在新疆多個地區存在,其中包括托克遜地區4條、艾丁湖地區12條、青河地區3條及伊吾地區3條序列;此外在國外各地區也分布廣泛。G2型分布于意大利和印度不同地區。G3型分布有限,本研究僅發現伊吾地區1條序列和印度2株存在于該型(圖2)。

2.5 Tams1蛋白特征分析和同源性建模

本研究翻譯得到Tams1蛋白約為27.39 ku蛋白,含有249個氨基酸。由于不同位置的替換、添加和缺失,不同株氨基酸序列在整個序列比對中表現出較大的差異。在每個基因型內相互比對篩選遺傳差異性較典型的序列,之后對所選的3個基因型間的序列進行比對(圖5)。結果顯示,在氨基酸N端位置27～52、138～175和180～196這3個區域存在廣泛變異,基因型間鑒定出52個出現變異的特征堿基。Tams1蛋白二級結構分析預計存在7個α螺旋和17個β折疊(圖6(a)),該蛋白不存在跨膜區和信號肽。使用IEDB Analysis Resource在線網站預測Tams1蛋白B細胞抗原表位,結果顯示抗原性較好,根據預測結果,以Mycoplasmapneumoniae粘附素1為模板對Tams1蛋白3D結構同源建模(圖6(b)),并使用EzMol網站對Tams1蛋白同源3D模型進行抗原表位標記(圖7)。

*表示出現變異的氨基酸。* Indicates the mutated amino acid.

圖6 Tams1蛋白質二級結構(a)及同源模型(b)Fig.6 Secondary structure (a) and homology model (b) of Tams1 protein

(a)B細胞抗原表位預測;(b)Tams1蛋白3D模型:抗原位點標記(紅色區域)(a) B cell epitope prediction;(b) Tams1 protein 3D model:antigen site marker (red areas)

3 討 論

環形泰勒蟲感染會造成牛較高的發病率和死亡率,導致重大經濟損失,是影響新疆牛養殖業發展的原因之一。輕微感染時一般染蟲率較低且無明顯臨床癥狀,常規檢查難于發現,通常采用核酸檢測技術。然而,近幾年有學者猜測針對環形泰勒蟲特定地方株的基于Tams1基因診斷工具可能無法準確檢測到其他分離株[16]。研究頂復門寄生蟲如何通過適應新的宿主物種而進化,并確定此類進化是否以低頻率或高頻率發生很有意義。為了建立新型的控制措施并評估其有效性,需要有關環形泰勒蟲的遺傳多樣性和種群結構的信息。因此,本研究分析新疆部分地區環形泰勒蟲的遺傳多樣性。

研究表明,Tams1基因為高度多態性,是用于環形泰勒蟲抗原多樣性研究的候選基因[17-18],該基因作為一種免疫顯性表面抗原[8],已被報道用于疫苗研發[19]、ELISA診斷[20-21]及PCR分子診斷[22-23]等方面。盡管國外有針對環形泰勒蟲研發的疫苗[24-27],但在印度近幾年也常有報道環形泰勒蟲病,其中患病率最高的地區可達66.67%,此外秋季發病率占53%[28-30]。環形泰勒蟲株間的遺傳多樣性可能是未能控制該疾病的原因之一[18]。有報道病毒、細菌、立克次體和原生動物抗原基因通過正向選擇氨基酸取代和基因內重組來產生多樣性[9,31-32]。

本研究檢測新疆地區23條環形泰勒蟲序列,除伊吾地區2號樣品序列被歸為G3型,其余均為G1型。根據系統發育分析,所選環形泰勒蟲序列存在3種不同基因型。此外,之前有基于Tams1基因報道在印度存在1種或2種分型情況[8,18]。本研究也展示了Tams1多樣性的存在,Tams1基因型的遺傳多樣性指數,即S、π、k、h和Hd以及Tajima’s D和Fu-Li’s F進一步證實了這一點。G1、G2和G3基因型以及總體數據的Hd值均大于0.5,反映了較高的遺傳多樣性。G1型Tajima’s D和Fu-Li’s F的正值表明種群規模減少和/或高頻的幾個等位基因平衡選擇,這意味著高核苷酸變異。此外,單倍型網絡分析產生38個單倍型,G1、G2和G3型分別由33、3和2個單倍型組成;其中G1型與其他型相比具有更豐富的多樣性及異質性。未檢測到基因型的地理特異性,且在不同的地理區域中存在幾乎相同的序列;造成這種情況的原因可能與不同國家之間的動物進出口貿易有關,此外,新疆地區主要為G1型為主,推測可能與采樣地大多為本地養殖有關。環形泰勒蟲是通過璃眼蜱屬傳播后等位基因的隨機分配、基因間和基因內的重組、交叉及生物學優先級選擇而發生變異[33]。在其他密切相關的寄生蟲中也提出了類似機制,即惡性瘧原蟲[34]和肉孢子蟲[35]。鑒于基因的遺傳多樣性有助于寄生蟲逃避宿主免疫反應,因此通常認為這種現象是積極選擇的結果[36]。

本研究Tams1蛋白大小約27.39 ku,含有249個氨基酸;二級結構分析預計存在7個α螺旋和17個β折疊,不存在跨膜區和信號肽,含有可能不會被激活的潛在糖基化位點;經預測該蛋白具有良好的抗原性,且抗原位點多位于表面,利于宿主免疫系統識別與捕捉,然而,本研究證實了Tams1基因存在多樣性,其抗原位點可能會發生改變,推測環形泰勒蟲可能會因此逃避宿主免疫。盡管Tams1序列高度可變,但典型泰勒蟲物種的Tams1和mMPSA[37]氨基酸序列似乎是保守的,因此,猜測保守區發揮功能/結構作用,而可變區暴露于免疫反應[9]。針對可變結構域(V4)開發的抗體可以阻斷針對參與加工和入侵的保守結構域的抗體的保護作用[9]。目前,通過使用活疫苗可以有效控制和預防由環狀泰勒蟲和小泰勒蟲引起的熱帶泰勒蟲病。Muguga cocktail疫苗被稱為活子孢子疫苗,許多非洲國家已用于控制由泰勒蟲引起的牛的東海岸發熱病[38]。此外,摩洛哥,以色列,伊朗,印度和突尼斯已有效地使用針對環形泰勒蟲病基于裂殖體的減毒活疫苗[39]。由于采樣數量及地區有限,不能對其遺傳多樣性進行全面的概述,未來可能需要對新疆更多地區環形泰勒蟲進行大規模的遺傳多樣性研究,以采取有效措施控制該疾病,同時檢測環形泰勒蟲Tams1是否存在其他新基因型;此外,不同基因型和遺傳多樣性是否與致病特性存在相關性,還需要進一步研究。

4 結 論

通過對新疆部分地區環形泰勒蟲Tams1存在的基因型及遺傳多樣性進行初步研究,發現所選采樣地區環形泰勒蟲存在基因分型情況,其中以G1型為主,僅發現一條G3型序列;根據S、π、k、h、Hd以及Tajima’s D和Fu-Li’s F等指數進一步證實Tams1基因有較高的遺傳多樣性,本研究為后續研究環形泰勒蟲基因型及如何逃避宿主免疫提供基礎方法與理論。