新疆某規模化豬場“人-動物-環境”來源沙門菌耐藥性分析

吳慧敏 夏盼盼 吳海潮 陳萬昭 秦 蕾 徐琦琦 劉澤鵬 夏利寧

(新疆農業大學 動物醫學學院/新疆草食動物新藥研究與創制重點實驗室,烏魯木齊 830052)

食源性疾病是威脅公共安全最重要的因素之一[1],而沙門菌是一種廣泛分布于自然界、人和動物腸道中常見的食源性致病菌[2]。我國每年約有三億人因感染沙門菌而患病,占所有致病菌引起食源性疾病的70.0%～80.0%,其中由肉類造成沙門菌傳播高達90.0%以上[3]。防治沙門菌病最有效且常用的手段是應用抗菌藥物,但由于抗菌藥物的濫用,沙門菌的耐藥性逐漸增強,甚至產生了多藥耐藥菌株。日漸嚴重的耐藥問題給畜牧業的良性發展和人類的身體健康帶來了嚴重危害[4]。

豬是沙門菌的第二大宿主[5],在豬只養殖過程中,沙門菌極易通過糞便、水、土壤、飼料和空氣等傳播給養殖人員[6],尤其是在集中規模化的養殖方式下,畜禽數目龐大,養殖空間狹小,加劇了傳播風險[5]。有研究表明,在養殖過程中抗菌藥物的使用與人群中耐藥菌株的增加有關聯[7]。目前,我國沙門菌耐藥性研究多局限于人或動物,較少綜合性報道人、動物和環境中沙門菌的耐藥情況。故本研究在新疆某規模化豬場中,將采集的人、動物和環境源樣品中分離的沙門菌作為研究對象,了解其在豬場中的流行情況,比較3種來源沙門菌的耐藥性和攜帶耐藥基因的情況,并提供消殺和用藥建議,降低沙門菌的傳播和耐藥菌產生的風險。同時,提示人們關注沙門菌等人畜共患病原菌在環境中存在的風險,提高自我保護意識及建立抗菌藥物正確使用意識。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株

2021年6月在新疆奇臺縣某規模化豬場采集人、動物和環境樣品共855份,其中豬肛拭子407份(腹瀉豬肛拭子75份、經產豬肛拭子272份、后備豬肛拭子60份)、環境樣品412份(產房環境樣品70份、保育環境樣品150份、其他環境樣品156份、養殖人員鞋底樣品36份)及養殖人員糞便樣品36份。大腸埃希標準質控菌(ATCC 25922)購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.2培養基、試劑及藥品(抗菌藥物)

MH(Mueller-Hinton)培養基、氯化鎂孔雀綠增菌液(Rappaport-Vassiliadis Medium,MM)、SS瓊脂培養基(SalmonellaShigella Agar)均購自奧博星生物技術有限公司(北京);甘油和50×TE緩沖液購自生工生物工程(上海)股份有限公司;DL 2 000 DNA Maker,2×TaqPCR Master Mix、dd H2O、瓊脂糖與核酸染料均購自天根生化科技(北京)有限公司;藥敏試驗用抗菌藥物購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1細菌分離鑒定

將采集的樣品拭子放入裝有滅菌MH肉湯的EP管中混勻,吸取20 μL MH肉湯至1 mL滅菌MM增菌液中,于搖床37 ℃培養48 h后用滅菌接種環在SS瓊脂培養基上劃線培養18～24 h,培養基上的中間黑色周圍透明的菌落,可初步鑒定為沙門菌,對疑似沙門菌的菌株進行持家基因invA的PCR擴增[8]。擴增產物經加核酸染料的1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,將目的片段進行膠回收并送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序結果經美國國家生物技術信息中心網站(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)比對,相似性>96.0%判定為沙門菌,20.0%滅菌甘油-80 ℃保存備用。

1.2.2藥物敏感性試驗

采用瓊脂稀釋法對分離株進行11種抗菌藥物最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentrations,MICs)的測定,測試藥物包括養殖場常用抗菌藥物以及部分備選抗菌藥物:氨基糖苷類(阿米卡星、慶大霉素)、喹諾酮類(恩諾沙星、環丙沙星、左氧氟沙星)、β-內酰胺類(氨芐西林、頭孢噻呋、亞胺培南)、四環素類(四環素、多西環素)和酰胺醇類(氟苯尼考),測試所用抗菌藥物敏感性判斷標準及具體試驗操作按照美國臨床實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)[9]推薦的動物源細菌抗菌藥物敏感性試驗執行標準進行。

1.2.3耐藥基因檢測

對不同來源的沙門菌進行氨基糖苷類(ant(3″)-Ia、aac(6′)-Ib)、喹諾酮類(oqxA、oqxB、qnrS)、β-內酰胺類(blaCTX-M、blaTEM、blaNDM)、四環素類(tetA、tetM)和酰胺醇類(floR)耐藥基因進行檢測。所用耐藥基因的引物見文獻[10-16],由生工生物工程(上海)有限公司合成上述引物。

1.2.4數據分析

采用SPSS 19.0軟件對不同來源沙門菌分離率、耐藥率與基因檢出率進行差異性分析,P<0.05為差異顯著,P>0.05為差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 豬場中人、動物和環境源沙門菌的分離鑒定

該豬場母豬存欄量大約為2 300頭,年產合格健仔數約為67 000頭,養殖場常用四環素類、頭孢菌素類、氨基糖苷類、青霉素類和酰胺醇類抗菌藥物作為防治性藥物使用。本研究以855份新疆奇臺縣某規模化養豬場采集到的人、動物和環境源樣本為研究對象,共分離得到288株沙門菌,分離率為33.7%。人源沙門菌的分離率最高,為47.2%(17/36),豬源沙門菌的分離率為33.9%(138/407),環境源沙門菌的分離率最低,為32.3%(133/412)。其中豬源樣品中腹瀉豬源和經產豬源沙門菌的分離率較高,分別為42.7%(32/75)和37.9%(103/272),而后備豬源沙門菌的分離率僅為5.0%(3/60);環境源樣品中產房環境源沙門菌的分離率高達77.1%(54/70),工人糞源沙門菌(47.2%,17/36)與工人鞋底源沙門菌(41.7%,15/36)的分離率相近(表1)。結果表明該豬場人-動物-環境源樣品中均能檢出沙門菌,且人源沙門菌的分離率最高,其次是豬源和養殖場中的環境源。

表1 養豬場人-動物-環境來源的沙門菌分離情況Table 1 Isolation rates of Salmonella from human-animal-environment in the pig farm

2.2 豬場中人、動物和環境源沙門菌耐藥及多藥耐藥情況

豬場分離的288株沙門菌對四環素(86.1%,248/288)、多西環素(84.4%,243/288)、氟苯尼考(79.9%,230/288)和氨芐西林(78.5%,226/288)的耐藥率較高,均在75.0%以上;未檢出對左氧氟沙星和阿米卡星耐藥的菌株,僅檢出4株對頭孢噻呋耐藥的菌株和6株對亞胺培南耐藥的菌株。

3種來源沙門菌的耐藥嚴重程度由高到低為:環境源沙門菌、人源沙門菌、豬源沙門菌。環境源沙門菌對氟苯尼考(92.5%,123/133)的耐藥率顯著高于豬源沙門菌的耐藥率(P<0.05);環境源沙門菌對恩諾沙星(70.7%,94/133)的耐藥率顯著高于豬源沙門菌(9.4%,13/138)和人源沙門菌(11.8%,2/17)的耐藥率(P<0.05);環境源和人源沙門菌對四環素、多西環素、氨芐西林、環丙沙星和慶大霉素的耐藥率均在52.0%以上,顯著高于豬源沙門菌的耐藥率(P<0.05);該豬場沙門菌對亞胺培南和頭孢噻呋的耐藥率較低,均低于3.0%,耐藥菌株僅在豬源和環境源中檢出(表2)。

表2 不同來源沙門菌對11種抗菌藥物的耐藥率Table 2 Resistance rate of Salmonella from different sources to 11 kinds of antibiotics %

豬場分離的沙門菌多藥耐藥在0～8耐均有分布,共有30種耐藥譜型,3耐及3耐以上的菌株占81.3%(234/288);多藥耐藥菌株以7耐為主(34.0%,98/288),其中GEN-TET-DOX-CIP-ENO-FFC-AMP譜型最多(33.0%,95/288);7耐菌株主要從環境源沙門菌中檢出,占65.4%(87/133),僅從環境源沙門菌中檢出1株8耐菌株;豬源沙門菌中以4耐菌株為主,檢出率為47.8%(66/138);人源沙門菌中以6耐菌株為主,檢出率為41.2%(7/17)(表3)。結果表明該豬場不同來源沙門菌的耐藥情況嚴重,耐藥譜廣,耐藥表型種類多,其中環境源沙門菌耐藥情況最為嚴峻。

表3 豬場人-動物-環境來源的沙門菌多藥耐藥率Table 3 Multidrug resistance rate of Salmonella from human-animal-environment sources %

2.3 豬場中人、動物和環境源沙門菌的耐藥基因檢測

該豬場分離的沙門菌中β-內酰胺酶耐藥基因blaTEM的檢出率為100.0%,豬源和人糞源菌中分別檢出7株(5.1%)和1株(6.3%)blaCTX-M基因陽性菌,此外,2株豬源沙門菌中檢出blaNDM基因;環境源和人源沙門菌中氨基糖苷類耐藥基因ant(3″)-Ia和aac(6′)-Ib的檢出率均大于70.0%,高于豬源沙門菌;70株(50.7%)和68株(49.3%)豬源沙門菌檢出四環素類耐藥基因tetA和tetM,檢出率顯著高于環境源和人源沙門菌(P<0.05);喹諾酮類耐藥基因oqxA和oqxB在環境源和人源的沙門菌中檢出情況相同,各檢出104株(78.2%)和9株(52.9%)攜帶上述2種基因的沙門菌,且同時攜帶2種基因的菌株占陽性菌株的98.2%(111/113);豬源沙門菌中共檢出65株(47.1%)qnrS基因陽性菌株,顯著高于環境源和人源沙門菌的檢出率(P<0.05)(表4)。結果表明該豬場不同來源沙門菌中攜帶的耐藥基因種類多,以blaTEM、ant(3″)-Ia和floR基因的檢出率較高,基因共存情況嚴重,環境源沙門菌的耐藥基因檢出率最高。

表4 豬場人-動物-環境來源的沙門菌耐藥基因檢出率Table 4 Detection rate of drug resistance genes in Salmonella from human-animal-environment sources %

3 討 論

3.1 豬場中人源沙門菌分離率高于養殖環境源和豬源

沙門菌是引起人畜共患病及食物中毒的主要食源性致病菌之一,沒有中間宿主,在自然界中廣泛分布,給畜牧養殖業和公共衛生安全造成了潛在危害[17]。本研究中沙門菌總分離率為33.7%,以人源沙門菌分離率最高,達到47.2%,高于新疆烏魯木齊市人源沙門菌的檢出率[18]。養殖業規模的快速發展,雖然減少了養殖場養殖人員的數量,但是養殖人員與帶菌動物的接觸卻更加頻繁了[19-20]。Su等[21]研究表明,豬是沙門菌的主要動物宿主,沙門菌極易通過糞-口途徑感染給其服務業工人。本研究中環境源沙門菌與豬源沙門菌的分離率(32.3%～33.9%)相近,但低于郭昱含[22]報道的我國不同地區飼料廠工人鞋底上沙門菌的檢出率,遠高于吉林省豬源沙門菌的分離率[23]。通過與該場工作人員交流,分析其原因可能是在樣品采集時正逢懷孕母豬進入圍產期,孕豬所在圈舍無法按時進行消殺,導致環境中及工人鞋底上沙門菌的檢出率高。并且,本研究中有腹瀉癥狀豬只的沙門菌分離率較高,其腹瀉的原因可能是沙門菌的直接感染或繼發感染。多項研究表明,疾病的傳播過程會涉及人、動物和環境3個層面,當病原體存在于廢水、土壤及其他環境中時,通過相關儲存宿主或媒介,極易導致動物或人感染疾病[24]。此外,養殖人員鞋底與自身糞便的帶菌情況有較密切的相關性,這可能與其出入場地沙門菌污染嚴重程度有關。根據本研究結果,應加強對腹瀉豬只和經產豬只圈舍的消毒,適當增加消毒液中藥物的有效濃度,增加消毒頻率,在消毒過程中應加強對角落的消毒工作;產房應在一個圍產期結束后對其環境進行全方位消毒,并且配懷舍也要加強消毒,改善待產母豬生活環境的衛生條件,降低待產母豬與沙門菌等病原菌的接觸幾率,從而降低待產母豬進入產房時的帶菌率;同時工作人員要加強鞋底、手部等日常消毒。

3.2 豬場中環境源沙門菌耐藥情況較人源和豬源更嚴重

抗菌藥物耐藥性在人、動物和環境層面的流動與循環,對人類、動物和環境的健康造成了巨大威脅[25]。本研究中3種來源沙門菌對四環素類和酰胺醇類藥物的耐藥率均在65.0%以上,在對四環素和多西環素表現為不耐藥的菌株中分別檢出了92.5%和55.6%處于中介狀態的菌株,暗示養殖場近期如果使用上述藥物會造成耐藥沙門菌數量的快速增加。不同來源的沙門菌對喹諾酮類藥物耐藥率差異較大,環境源沙門菌對環丙沙星和恩諾沙星的耐藥率均顯著高于豬源沙門菌,而人源沙門菌對環丙沙星(64.7%)的耐藥率接近于環境源沙門菌的耐藥率,對恩諾沙星(11.8%)的耐藥率接近于豬源沙門菌的耐藥率。分析原因可能是環境中耐環丙沙星的沙門菌主要來自于飼養員,尤其是工人流動相對頻繁的產房環境和保育豬環境中環丙沙星耐藥菌株檢出率更高也間接的證明這點。值得注意的是,本研究中腹瀉豬源沙門菌對環丙沙星和恩諾沙星的耐藥率是健康豬源沙門菌耐藥率的6.5倍以上,但是腹瀉豬源沙門菌對上述2種藥物的中介率低于健康豬源沙門菌,出現這種耐藥性差異可能是因為養殖場僅對腹瀉豬只進行隔離治療,導致腹瀉豬只攜帶的中介耐藥沙門菌快速轉變為耐藥菌。此外,該場沙門菌對頭孢噻呋和亞胺培南敏感性較高,未檢出對左氧氟沙星和阿米卡星耐藥的菌株,因此上述藥物可以作為治療細菌性疾病的備選藥物,但是在使用時也應注意使用劑量和用藥周期,避免出現新型耐藥菌株。

多藥耐藥結果顯示,該場的沙門菌多藥耐藥集中在4耐(26.0%)和7耐(34.0%),耐藥譜型種類多達30種。由于健康狀況和飼養環境的不同,腹瀉豬源沙門菌多藥耐藥率(81.3%)高于健康豬源沙門菌多藥耐藥率(68.6%),與酒躍光等[26]報道的結果相似。在環境源沙門菌中,產房環境源和保育豬環境源沙門菌的多藥耐藥率均為100.0%;通過對比發現,工人鞋底源、產房環境源和保育豬環境源沙門菌多藥耐藥譜種類較為單一,且均以GEN-TET-DOX-CIP-ENO-FFC-AMP 7耐譜型為主,分析可能是因為工人頻繁進出產房和保育豬圈舍,加劇了耐藥菌在二者之間的傳播。

3.3 豬場中環境源沙門菌耐藥基因檢出情況較人源和豬源更嚴重

細菌可以通過可移動元件的水平轉移獲得抗菌藥物的耐藥基因,并且會造成耐藥基因在人、動物和環境中流動循環[27-31]。本研究耐藥基因結果顯示,該場分離的沙門菌blaTEM基因的檢出率高達100.0%,說明blaTEM基因是介導該場沙門菌對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥的主要原因之一。本研究blaCTX-M基因檢出結果與楊丹[32]和Wang等[33]一致,在7株檢出blaCTX-M基因的豬源沙門菌中有6株來自腹瀉豬糞樣,并且其中2株還同時攜帶碳青霉烯類多藥耐藥基因blaNDM。blaNDM基因陽性菌株可以通過人和動物傳播到環境中,目前在河水、污水、養殖場周圍環境中都有檢出blaNDM基因陽性菌株[34],該基因已經成為中國第二流行的碳青霉烯酶,并且產NDM酶的菌株大多同時攜帶多種耐藥基因[35]。qnrS、oqxA和oqxB這3種質粒介導的喹諾酮類耐藥基因在豬場不同來源沙門菌中的檢出率有所差異,環境源和人源沙門菌以攜帶oqxA基因和oqxB基因為主,而豬源沙門菌以攜帶qnrS基因為主,耐藥基因檢測結果與耐藥表型呈正相關。攜帶上述基因的細菌可以通過飼料、飲水、人員流動甚至空氣進行傳播,且在臨床濫用藥物的壓力下,這些基因的表達可能會增強,菌株突變的頻率會增大,導致敏感菌迅速發展為耐藥菌,因此不容輕視[32,36]。該場中3種來源沙門菌攜帶的氨基糖苷類和氟苯尼考耐藥基因分別以ant(3″)-Ia基因和floR基因為主,與對應抗菌藥物的耐藥表型基本一致。豬源沙門菌攜帶的四環素類耐藥基因以tetA基因(50.7%)和tetM基因(49.3%)為主,推測豬源沙門菌對四環素和多西環素耐藥主要是由tetA基因和tetM基因介導,而另外兩種來源的沙門菌對四環素的耐藥率超過85.0%,但tetA基因和tetM基因的檢出率未超過10.0%,耐藥表型與耐藥基因型不相符,分析可能存在其他介導四環素類藥物耐藥的基因(如tetB、tetC和tetO等)或酶解蛋白[37]。由于耐藥菌株和耐藥基因會跨物種進行傳播,所以,從人、動物和環境3個方面防控耐藥菌株及耐藥基因的流動尤為重要[34]。

我國大部分地區的養豬場都存在較為嚴重的耐藥問題,細菌耐藥監測是掌握細菌耐藥性的重要措施,可以為臨床使用抗菌藥物提供數據支持,實驗室與臨床結合,遏制抗菌藥物耐藥,保護公共衛生安全。當前,我國正處于“減抗”時期,養豬場應該堅持飼喂生物飼料,多使用抗菌藥物替代品防治疾病,如中獸藥、生物獸藥、微生態制劑和動物用免疫增強劑等,這些都可以有效控制動物源細菌耐藥性,減少獸藥殘留,促進養豬業向好發展。同時,養豬場應該堅持科學、規范做好圈舍和用具消殺工作,這樣能有效抑制病原菌的傳播和生長,結合定期打掃圈舍衛生,可以減少帶菌或發病豬只數量的增加。

4 結 論

新疆該豬場人源樣品中沙門菌的檢出率高于養殖環境和豬源樣品中的檢出率,環境源沙門菌的耐藥情況和耐藥基因檢出情況較人源和豬源沙門菌更嚴重。在對豬只臨床用藥時推薦選取人、動物和環境3種來源沙門菌敏感性均比較高的藥物治療細菌性疾病,如頭孢噻呋等。由于該豬場沙門菌多藥耐藥情況嚴重,耐藥表型種類多,且耐藥基因攜帶率高,為治療和耐藥菌防控增加難度,應從人-動物-環境健康的視角出發,結合沙門菌的分離和耐藥性檢測,同時規范消殺流程,合理使用抗菌藥物,全面的對豬場中沙門菌進行持續監測,實驗室與臨床結合,共同促進人、動物和環境健康。