柚皮素通過調控細胞增殖和線粒體自噬發(fā)揮神經細胞保護作用實驗研究

王凱華,楊鑫勇,李 巖,鄭光珊,陳真珍,黃龍堅

(1.廣西中醫(yī)藥大學附屬國際壯醫(yī)醫(yī)院,廣西 南寧 530201;2.廣西中醫(yī)藥大學,廣西 南寧530200;3.右江民族醫(yī)學院,廣西 南寧533000)

柚皮素(Naringenin,NAR)是一類天然黃酮類化合物,廣泛存在于柑橘屬、薔薇科等植物中,在西紅柿、葡萄等水果中含量也較高[1-2]。研究發(fā)現,NAR具有抗氧化、抗纖維化、抗腫瘤、抗損傷、調節(jié)內分泌、改善糖脂代謝、保護神經細胞等多種藥理作用,已被開發(fā)應用于醫(yī)藥、食品等多個領域[3-4]。在急性肺損傷動物模型中,NAR可減輕脂多糖誘導的小鼠肺組織病理改變,抑制炎癥細胞因子釋放,改善肺損傷的病理狀態(tài)[5]。在心肌缺血再灌注(Ischemia-reperfusion,I/R)損傷模型中,NAR預處理可明顯降低大鼠心肌細胞凋亡率和氧化應激水平,從而改善大鼠心肌I/R損傷[6]。在本實驗中,我們構建了大鼠原代皮層神經細胞糖氧剝奪/再灌注(Oxygen and glucose deprivation/reperfusion,OGD/Rep)模型,探索NAR處理對腦I/R損傷的保護作用及其與線粒體自噬的關系,為NAR保護神經細胞I/R損傷提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 柚皮素(#N164488);神經細胞培養(yǎng)基和胎牛血清為美國GIBCO公司產品;Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒、活性氧檢測試劑盒(DCF-DA)為上海碧云天生物技術有限公司產品;超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)測試盒、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)測定試劑盒、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)測定試劑盒,來自南京建成生物工程研究所。抗LC3抗體、抗P62抗體、抗細胞色素C抗體(Cytochrome C)、抗編碼線粒體定位激素的假定激酶1(PTEN-induced putative kinase 1,PINK1)抗體和抗Parkin抗體均購自美國Abcam公司。酶標儀為美國Bio-Red公司iMark型號。Guava easycyte流式細胞儀為美國Millipore公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 OGD/Rep法模擬神經細胞體外I/R模型:取本實驗室先前制備并鑒定的大鼠皮層神經元[7],參照經典的神經細胞OGD/Rep模型制作方法制備[8]。取生長狀態(tài)良好的神經細胞,用無糖Earle’s鹽溶液洗滌數次再加入無糖Earle’s鹽溶液培養(yǎng),置于細胞培養(yǎng)箱內,向箱內緩慢通入含有95% 氮氣(N2)和5%二氧化碳(CO2)的混合氣體30 min,以形成低氧環(huán)境。關閉培養(yǎng)箱氣體進出管,靜置90 min(氧糖剝奪,體外模擬缺血缺氧)。取出細胞,吸去無糖Earle’s鹽溶液,換成細胞正常培養(yǎng)基,放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)正常培養(yǎng)(復糖復氧,體外模擬再灌注),獲得OGD/Rep神經細胞模型,用于后續(xù)實驗。

1.2.2 實驗分組和干預措施:將未經處理的大鼠皮層神經元和經OGD/Rep造模的細胞分組如下:正常組(NC,正常大鼠皮層神經細胞);模型組(OGD/Rep造模的大鼠皮層神經細胞);模型+NAR組(OGD+NAR,經OGD/Rep造模處理后用含80 μmol/L NAR的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)組);正常+NAR組(NC+NAR,大鼠皮層神經細胞用含80 μmol/L NAR的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)組)。

1.3 觀察指標

1.3.1 MTT檢測細胞增殖活力:取上述各實驗分組的細胞,加入96孔板,37 ℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)0、24、48、72 h,每組每個時間段設置3個復孔。取出細胞培養(yǎng)板,磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered solution,PBS)洗滌1次后加入10% MTT溶液,放回細胞培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h。輕輕吸棄各孔溶液,加入150 μl二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO),輕微震蕩充分溶解結晶物。酶標儀490 nm波長處檢測各孔吸光度(Optical density,OD)值并記錄數值。

1.3.2 Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡:各組細胞培養(yǎng)72 h后,經胰蛋白酶消化后收集細胞,1500 r/min離心5 min,棄上清,適量PBS重懸細胞,加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶(Propidium iodide,PI),混勻。室溫下避光反應10 min。離心洗滌2次后,PBS重懸細胞,流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率(凋亡率為PI陽性和FITC陽性之和)。

1.3.3 細胞內ROS測定:培養(yǎng)48 h后,取上述各實驗分組的細胞,PBS洗滌2次,加入DCF-DA工作液,100 μl/孔,充分混勻。5% CO2、37 ℃下染色30 min。去掉上清,PBS洗滌2次,流式細胞儀檢測FL1通道熒光強度。FL1通道熒光強度與細胞內ROS水平成正比。

1.3.4 化學比色法檢測細胞內MDA和GSH水平及SOD 活性:培養(yǎng)48 h后,取出各組細胞,PBS洗滌3次,棄上清,收集細胞于離心管內,向細胞沉淀內加入PBS,冰水浴中超聲(超聲功率300 W,超聲一次3～5 s,間隔30 s,共超聲4次)。經蛋白定量后,按照各說明書所列方法進行取樣、加樣、孵育,并于酶標儀對應波長處進行OD值檢測,計算 MDA和GSH水平及SOD 活性。

1.3.5 Western blot實驗:培養(yǎng)72 h后,取出各組細胞,提取細胞總蛋白并測定其濃度,進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。濕轉法轉膜后5%脫脂奶粉封閉80 min,分別使用抗LC3(ab192890,1∶2000)、抗P62(ab109012,1∶1000)、抗Cytochrome C抗體(ab133504,1∶5000)、抗PINK1抗體(ab186303,1∶1000)、抗Parkin抗體(ab77924,1∶2000)和抗GAPDH(ab8245,1∶5000)進行一抗孵育,室溫下1 h,然后置于抗鼠或抗兔辣根過氧化物酶標記的IgG二抗中(1∶5000)。洗滌后,超敏化學發(fā)光試劑進行發(fā)光,黑暗下X線底片覆蓋曝光。經顯影、定影后,待干燥后拍照。

2 結 果

2.1 NAR可增強OGD/Rep模型細胞活力 MTT檢測結果如圖1所示。與NC組相比,OGD模型組細胞OD值明顯降低,說明OGD/Rep造模使大鼠原代皮層神經細胞增殖活性受到明顯抑制;NAR加入到模型細胞中后,神經細胞的增殖活力明顯增強(OD值明顯升高,P<0.05)。

注:與OGD組比較,*P<0.05;與OGD組比較,#P<0.05;與OGD組比較,△P<0.05圖1 NAR可增強OGD/Rep模型細胞活力

2.2 NAR可抑制OGD/Rep模型細胞凋亡 流式細胞儀檢測NAR對OGD/Rep模型細胞凋亡的影響見圖2。與NC組比較,模型組細胞凋亡率明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與OGD模型組比較,OGD+NAR組細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。流式細胞儀檢測結果表明,NAR處理可保護神經細胞,抑制OGD/Rep模型細胞凋亡。

圖2 NAR可抑制OGD/Rep模型細胞凋亡

2.3 NAR可抑制OGD/Rep模型細胞ROS產生 流式細胞儀檢測NAR對OGD/Rep模型細胞ROS產生的影響見圖3。與NC組比較,OGD模型組細胞ROS值明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與OGD模型組比較,OGD+NAR組ROS值明顯降低(P<0.05)。流式細胞儀檢測結果表明,NAR處理可抑制OGD/Rep模型ROS產生。

圖3 NAR可抑制OGD/Rep模型細胞ROS產生

2.4 NAR可增強OGD/Rep模型細胞抗氧化能力 NAR處理OGD/Rep模型細胞和正常培養(yǎng)的大鼠原代皮層神經細胞后,其抗氧化指標(MDA、GSH和SOD)檢測結果見表1。與正常細胞NC組比較,OGD/Rep模型細胞的MDA水平顯著升高,而經NAR處理后其水平表現出下降趨勢(P<0.05)。對于GSH和SOD,與NC組比較OGD/Rep模型組細胞的GSH和SOD水平明顯降低(均P<0.05),與OGD/Rep模型相比OGD+NAR組GSH和SOD水平明顯升高(均P<0.05)。此外,NAR處理可降低正常培養(yǎng)的大鼠原代皮層神經細胞MDA水平,增強GSH和SOD水平(均P<0.05)。

表1 各組MDA、GSH和SOD水平比較

2.5 NAR可增強OGD/Rep模型細胞自噬 Western blot 分析NAR對OGD/Rep模型細胞和正常培養(yǎng)的大鼠原代皮層神經細胞自噬蛋白LC3和P62,Cytochrome C、PINK1、Parkin的影響見圖4。由圖4可知,與NC組比較,模型細胞的LC3、Cytochrome C、PINK1、Parkin水平顯著性升高,P62水平顯著性降低(均P<0.05);與OGD模型組比較,OGD+NAR組LC3、PINK1、Parkin水平顯著性升高,P62和Cytochrome C水平顯著性降低(均P<0.05);與NC組比較,NAR處理的正常培養(yǎng)的大鼠原代皮層神經細胞的LC3、PINK1、Parkin水平顯著性升高,P62和Cytochrome C水平顯著性升高(均P<0.05)。

圖4 各組細胞自噬相關蛋白表達情況

3 討 論

腦血管類疾病是一種嚴重危害人類健康的常見病,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢,目前已成為中國居民死亡的第一原因和成人殘疾的第一原因[9-10]。我們在前期研究工作中發(fā)現NAR對體外培養(yǎng)的神經細胞具有保護線粒體和抗氧化應激作用,動物模型也表明NAR對I/R造成的腦損傷有較好的保護作用[11]?；谏鲜鲅芯? NAR能否保護處于I/R病理過程中的神經細胞,以及NAR是否通過調控自噬過程來實現其神經保護作用等問題引起了我們的關注。本研究的結果證實了我們的猜想,NAR處理可以增強神經細胞增殖活力、抗氧化能力,促進自噬相關LC3、PINK1和Parkin蛋白表達,抑制P62蛋白表達,增強自噬水平。因此,NAR作為治療腦卒中的天然備選藥物之一,成為一大研究熱點。

線粒體功能失調和氧化應激損傷是造成腦I/R不可逆損傷的主要因素之一。線粒體功能失調和氧化/抗氧化失衡時,神經細胞的線粒體可產生大量ROS、誘導神經細胞凋亡甚至死亡[12]。因此,從線粒體功能失調和氧化/抗氧化體系失衡方面探尋治療腦I/R損傷的方法愈來愈受到研究者的關注,通過積極保護線粒體功能、抗氧化、清除自由基,加強自噬,成為保護腦I/R損傷神經細胞的策略之一[13-14]。眾多研究表明,腦缺血可以誘導缺血區(qū)神經細胞發(fā)生線粒體自噬,而進一步激活線粒體自噬可明顯減弱神經細胞損傷[15-16]。一些中國傳統(tǒng)中藥或者其活性成分正是通過促進線粒體自噬來發(fā)揮對腦I/R損傷的治療作用的[17-18]。本研究結果表明,NAR處理可以增強神經細胞的抗氧化能力,促進自噬相關LC3、PINK1和Parkin蛋白表達,抑制P62蛋白表達,增強自噬水平,對腦I/R損傷后的神經細胞和正常的皮層神經細胞均具有保護作用。

在哺乳動物中,線粒體實現自噬主要涉及兩個蛋白:PARK2以及PINK1,其蛋白產物Parkin是細胞質E3泛素連接酶,作為線粒體自噬中最主要的途徑,PINK1/Parkin介導線粒體自噬在各類損傷中發(fā)揮著重要作用[19]。PINK1/Parkin介導的線粒體自噬是心血管疾病、神經退行性疾病和腦I/R損傷中最重要的機制之一。在神經細胞PC12損傷模型中,PINK1介導的線粒體自噬是人參皂苷Rg1減輕線粒體損傷的可能機制,是保護神經細胞的重要方式之一。Wu等[20]的研究發(fā)現,燈盞花素可誘導PINK1表達并觸發(fā)Parkin易位到受損的線粒體以誘導線粒體吞噬,以減弱腦I/R損傷,但這些效應可被PINK1的敲除所抵消,表明燈盞花素可以促進PINK1/Parkin介導的線粒體吞噬途徑,參與I/R腦損傷的保護。在本研究中,NAR可促進腦I/R損傷后的神經細胞和正常的皮層神經細胞的自噬相關LC3、PINK1和Parkin蛋白表達,抑制P62蛋白表達,增強自噬水平,從而實現了保護神經細胞,改善腦I/R損傷的作用。

綜上所述,柚皮素可明顯增強正常培養(yǎng)大鼠原代皮層神經細胞及其OGD/Rep模型細胞的增殖活力,減少凋亡,提高抗氧化能力,其機制可能是通過促進線粒體自噬PINK1/Parkin通路來實現的。本研究的結果對于柚皮素的進一步臨床應用提供了實驗依據。線粒體自噬相關蛋白PINK1/Parkin信號通路的功能及其效應分子的關系較為復雜,需要進一步深入開展相關方面的研究。