小泛素化修飾調控糖尿病心肌病發生與發展

藺 潔,雷 燁,李曉苗,周 潔

(1.陜西中醫藥大學,陜西 咸陽 712046;2.空軍軍醫大學西京醫院內分泌科, 陜西 西安 710032)

糖尿病嚴重危害人類健康,其患病人數不斷上升,已成為21世紀威脅人類健康的主要慢性疾病之一。包括Framingham、UKPDS和MRFIT研究在內的許多流行病學研究表明,糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是心血管疾病的獨立危險因素,特別是2型糖尿病(Type 2 diabetes,T2DM)與心血管疾病的發病率和病死率密切相關[1-3]。心血管疾病是糖尿病最常見的并發癥之一,據估計接近一半的糖尿病患者死于心血管事件[4]。糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DCM)是一種特定形式的心臟病,獨立于其他心臟危險因素,其典型臨床特征包括早期的舒張功能障礙、隨后出現以各種代謝和神經體液通路紊亂為特征的收縮功能障礙、心律失常、最終發展為心力衰竭[5]。目前關于DCM的具體發病機制尚未闡明,在臨床上缺乏特異有效的臨床診治方法。糖尿病心肌病的病理生理機制復雜,包括高血糖、胰島素抵抗、自噬、線粒體氧化應激、腎血管緊張素-醛固酮(RASS)系統的激活等。表觀遺傳(Epigenetics)是指在基因的DNA序列沒有發生變化的情況下,對基因表達進行各種修飾,引起基因功能發生可遺傳變化,最終導致表型變化。表觀遺傳主要包括DNA修飾、組蛋白修飾和翻譯后修飾(Post translation modification,PTM)等,這些修飾使得DNA空間結構或染色質結構發生改變,基因沉默或過表達。研究發現很多心臟疾病都與表觀遺傳修飾相關,如糖尿病心肌中SERCA2a啟動子區域的甲基化,導致SERCA2a表達降低從而發生DCM[6];多種翻譯后修飾(PTMs),包括磷酸化和泛素化,控制NLRP3蛋白降解和炎癥小體激活,導致心肌炎癥發生等[7]。小泛素化修飾(Small ubiquitin-related modifier,SUMO)是一種類似于泛素化的翻譯后修飾,通過靶向NLRP3炎癥小體、參與氧化應激、影響線粒體功能、調節鈣穩態等參與心臟疾病的發生發展。在此我們重點論述SUMO化在DCM中的作用,以及其在調節上述病理損傷過程中的內在聯系。

1 SUMO化是一種翻譯后修飾

蛋白質翻譯后修飾,通過對蛋白質的各種生物功能以及生理性刺激做出及時的響應及精密調控,極大的豐富了蛋白的多樣性和生物活性。泛素化是一種很常見的翻譯后修飾,涉及到76個氨基酸的泛素與其他蛋白質的賴氨酸殘基結合。這種修飾按E1泛素激活酶、E2泛素結合酶和E3泛素連接酶的順序作用催化[8]。去泛素化則是由去泛素化酶(DUBs)催化,主要參與蛋白質降解、信號轉導和亞細胞定位[9]。SUMO化是一種10 kDa左右的類似于泛素化的蛋白質翻譯后修飾,主要影響蛋白質的穩定性、調控細胞分裂、DNA復制修復、信號轉導和細胞代謝等多種生物過程[10]。

SUMO蛋白是一個保守的真核蛋白修飾家族,大約有100個氨基酸,目前已經鑒定了五種亞型,分別是SUMO1、SUMO2、SUMO3、SUMO4和SUMO5[11]。SUMO1和SUMO2、SUMO3在體內廣泛分布,而SUMO4和SUMO5似乎具有組織特異性,但研究較少。SUMO4 (M55V)與1型糖尿病(Type 1 diabetes,T1DM)和T2DM的發展高度相關[12]。SUMO5是新近發現的家族成員,對靈長類動物的研究發現,SUMO5具有很高的組織特異性,參與早幼粒細胞白血病核小體的調控。從一級結構上看,SUMO1與SUMO2和SUMO3的序列同源性為46%,而SUMO2和SUMO3的序列同源性為97%[13]。SUMO化同泛素化一樣通過多步驟的酶級聯反應可逆地吸附在賴氨酸殘基上,這一過程由E1激活酶、E2結合酶和E3連接酶催化,目前所檢測的生物體只含有一種E1(SAE1/SAE2)酶和E2(UBC9)酶,但含有多種E3酶[14]。E1酶利用ATP水解將成熟的SUMO蛋白與其活性位點的半胱氨酸共價連接,隨后將SUMO蛋白轉移到E2酶的活性位點上。在E3酶的幫助下,E2酶進一步將SUMO蛋白轉移到靶蛋白上,最終使靶蛋白發生SUMO化。SUMO化修飾是一種動態可逆的過程,SUMO特異性蛋白酶家族(SUMO-specificproteases,SENPs)是去SUMO化過程中的關鍵酶,主要催化去除靶蛋白上的SUMO蛋白。目前共發現6種SENPs,即SENP1、SENP2、SENP3、SENP5、SENP6和SENP7,其中SENP1主要分布在細胞核的核體,SENP2分布在核孔,SENP3和SENP5分布在核仁,而SENP6和SENP7主要分布在胞質。不同的SENP成員靶向特定的SUMO化蛋白[15]。在人體生理狀態下,SUMO修飾通過SUMO化和去SUMO化保持動態平衡。當SUMO化和去SUMO化的動態平衡被破壞后,細胞的某些功能被破壞,從而促進疾病的發生發展。

2 SUMO蛋白在DCM中的作用

《Nature》《Circulation Research》等著名雜志都曾發文指出SUMO化修飾對于維持心肌細胞的生理功能具有非常重要的作用[16]。SUMO化修飾減少見于多種心臟病,包括心肌缺血、心衰等,恢復SUMO化修飾可能不同程度的改善心臟形態學變化和功能下降。但是研究發現SUMO不同及相同亞型的修飾在心臟中發揮著不同的作用,例如心肌特異性過表達SUMO1的轉基因小鼠可抑制壓力過度誘導的心肌肥厚和功能障礙,而心臟特異性過表達SUMO2的小鼠表現為劑量依賴性心肌肥厚和功能障礙[17-18]。但也有研究表明,SUMO2、SUMO3介導的動態蛋白1 (Dynamic protein 1,DRP1)的SUMO化也可以保護心功能[19]。這不能簡單解釋為SUMO1、SUMO2和SUMO3的基因表達差異,可能與它們的誘導方式不同有關。不同的誘導方式對應不同的靶蛋白,從而表現出對心功能的不同影響。高糖環境是否會誘導心肌細胞內的SUMO修飾發生異常變化,以及哪些分子可能參與其中從而影響心肌細胞功能我們將進一步論述。

2.1 ERK5- SUMO化在DCM中的作用 細胞外信號調節激酶5(Extracellular signal-regulated kinase 5,ERK5)是心肌發生SUMO化修飾的主要靶點之一。在糖尿病心肌梗死(Myocardial Infarction,MI)動物模型中,ERK5被SUMO2、SUMO3高度修飾[10,20],同時ERK5可被SENP2催化發生去SUMO化。有研究者將心肌細胞暴露于H2O2或高糖后觀察到ERK5-SUMO化修飾增加,而ERK5的轉錄活性明顯下降,突變ERK5的K6R/K22R位點后,ERK5轉錄活性升高,降低了ROS介導的心肌細胞凋亡,改善了心功能,提示K6R/K22R是ERK5的SUMO化位點[20]。糖尿病心肌梗死小鼠模型中過表達MEK5α后ERK5-SUMO化被抑制從而在轉錄水平上激活ERK5,另外PDE3A-ICER反饋環誘導心肌細胞凋亡也被抑制。因此高糖或H2O2誘導的心肌細胞的凋亡可能與ERK5-SUMO化修飾增加,影響PDE3A-ICER反饋環路有關。

2.2 Nrf2-SUMO化參與DCM氧化應激 核轉錄因子Nrf2[nuclear factor erythoid 2(NF-E2)related factor 2]調控多種編碼抗氧化與解毒作用相關靶基因的表達,在細胞核內與靶基因啟動子中的抗氧化反應元件(ARE)結合后,抵抗氧化應激,維持細胞穩態。Nrf2的一種胞質阻遏蛋白Keap1與Nrf2在細胞質中結合,阻止Nrf2的核易位,Nrf2與Keap1解耦聯后被激活。另外p62作為Keap1的特異性自噬受體與Keap1結合后,將其與其他泛素化蛋白聚合體嵌入降解,釋放并激活Nrf2[21]。 正常狀態下,Nrf2-Keap1-P62的回路處于動態穩定狀態,維持細胞氧化還原穩態,一旦進入糖尿病狀態,受損的內部環境產生過多的活性氧(ROS),導致p62依賴性的Nrf2激活延長,心肌細胞發生過度自噬,降解更多的p62-Keap1復合物,反饋影響Nrf2核易位,抑制Nrf2的激活,導致心肌細胞凋亡,引起心肌功能障礙[22]。

SUMO化參與調節Nrf2抗氧化應激。在肝癌細胞中SUMO1與Nrf2結合后Nrf2的抗氧化應激能力提高,而突變Nrf2的K110位點后,Nrf2的穩定性被破壞,ROS的水平升高,說明K110位點是Nrf2的SUMO化位點。另外去SUMO化酶SENP1的敲低可上調Nrf2的SUMO1修飾,提高了Nrf2的穩定性。SUMO-E2結合酶Ubc9是發生SUMO化修飾必不可少的酶。通過這一點,有研究者發現Ubc9的缺失導致胰腺β細胞中Nrf2賴氨酸殘基K525和K595缺乏SUMO化,使Nrf2介導的抗氧化應激保護缺失,繼而導致小鼠發生嚴重糖尿病[23]。有趣的是,SUMO-E3連接酶RNF4在PML-NBs中與Nrf2結合導致Nrf2降解[24]。雖然目前對于Nrf2-SUMO化修飾在心肌中研究很少,但是SUMO化在調節Nrf2抗氧化應激發揮的作用毋庸置疑。

2.3 DCM中SUMO化介導的線粒體應激反應 眾所周知,線粒體在生物體能量代謝中至關重要。線粒體通過氧化葡萄糖、脂肪酸、氨基酸等小分子物質產生能量,同時線粒體代謝產生的中間產物可作為合成代謝和調節細胞活性的信號分子的原料[25]。越來越多的研究證實線粒體代謝和功能是由細胞外環境的改變觸發的[26-28]。線粒體對細胞外環境各因素的反應稱為線粒體應激反應。

SUMO化修飾是一個應激誘導的過程。許多有關SUMO化的研究表明,它在真核生物的應激反應中起著至關重要的作用[29]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARγ)共激活因子1α (PGC-1α)作為線粒體生物發生的主調控因子,可激活轉錄因子表達,進而調節線粒體生物發生和呼吸[30]。有證據表明,PGC-1α可以在K183位點上被SUMO化,負性調控PPARγ-依賴的轉錄功能[31- 32]。更重要的是SENP1介導的PGC-1α去SUMO化增強了線粒體的生物發生和功能[33]。在T2DM中高血糖和脂肪酸氧化失衡誘導產生過多AGEs、ROS觸發線粒體應激,導致線粒體融合和裂變之間的轉換失衡。在線粒體融合和裂變的調節中,SUMO化已被證明參與調節線粒體動力學。DRP1是線粒體裂變的關鍵調控因子[34]。 最近的一項研究表明,DRP1是SUMO修飾的直接靶標,SUMO結合酶UBC9與DRP1之間的相互作用控制著DRP1的定位,阻止正常的線粒體裂變[35]。Harder等進一步確定UBC9和SUMO1是DRP1的特異性相互作用蛋白,他們發現SUMO1通過抑制DRP1的溶酶體降解穩定內源性DRP1。Zunino等發現,SENP5缺失增加了ROS的產生,促進了線粒體碎裂。相反,SENP5過表達抑制DRP1的SUMO化,從而挽救線粒體裂變,抑制線粒體應激。SUMO2/3修飾抑制DRP1從細胞質向線粒體轉位,從而保護心功能,而心肌細胞特異性過表達SENP5可抑制DRP1的SUMO2/3修飾,繼而誘導心肌細胞凋亡[36]。綜上可見SUMO修飾在心肌細胞線粒體融合和裂解的轉換中發揮著至關重要的作用。

2.4 DCM中SUMO化與炎癥

2.4.1 SUMO化靶向調控NLRP3炎癥小體:不受控制的NLRP3炎癥小體激活是慢性炎癥疾病的基礎。DCM以慢性低度炎癥為特癥[37]。大量研究表明NLRP3炎癥小體參與DCM的發病和進展[38];高糖狀態下激活NLRP3炎癥小體促進心肌細胞大量分泌白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-18等促炎細胞因子,加重心肌細胞血糖不耐受和胰島素抵抗[39]。心肌細胞是終末分化細胞,心肌細胞死亡是DCM進展中的一個致命分子事件,抑制心肌細胞中NLRP3炎癥小體可以降低高糖條件下Caspase-1和IL-1β的蛋白表達,降低心肌細胞的病死率。因此抑制NLRP3炎癥小體對于改善DCM患者的心功能非常重要。有研究證明SUMO的結合可負向調節NLRP3炎癥小體,在穩態條件下NLRP3與SUMO- E3連接酶MAPL連接并被SUMO化,激活NLRP3炎癥小體后,NLRP3和MAPL之間的相互作用被破壞,NLRP3被去SUMO化。去SUMO化酶SENP6和SENP7也可選擇性抑制NLRP3-SUMO化從而促進半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)激活和IL-1β的產生。由于NLRP3炎癥小體在許多炎性疾病中發揮關鍵作用,因此識別調節NLRP3的SUMO化、去SUMO化平衡是炎癥領域具有治療潛力的重要進展。深入研究NLRP3-SUMO化將為DCM提供新的診療策略。

2.4.2 核因子κB(NF-κB)是DCM的炎癥調節因子和SUMO化靶點:核受體NF-κB是調節炎癥反應的中心環節。在非活性狀態下,NF-κB與κB抑制劑(IκB)結合存在于細胞質中。當IκB激酶(IκK)被炎癥因子刺激時,NF-κB活化。由此產生的游離NF-κB轉位到細胞核并反式激活促炎基因。近期研究表明, NF-κB參與調節DCM的炎癥反應。在心臟中高血糖激活NF-κB信號通路性細胞因子IL-1β、IL-6、IL-18、 TNF-α和TGF-β1的表達,誘導心肌細胞肥大,促進心肌纖維化。

NF-κB自身是否發生SUMO化修飾,目前尚無足夠的證據支持,但是SUMO化及其相關酶對NF-κB以及下游基因的調控在DCM中發揮著重要的作用。IκK是兩個激酶IκKα和IκKβ的復合物,其亞基稱為NF-κB必要調制器(NEMO)。NEMO不具有催化活性,但對IκK的激活和IκB的磷酸化至關重要。敲除NEMO可阻止IκK有效磷酸化IκB并激活NF-κB信號通路。最近有報道稱,SUMO1在Ubc9的催化作用下與IκBα的K21和K22位點結合抑制其泛素化而不被破壞,阻斷與NF-κB的分離,從而抑制并下調NF-κB的活化。相比之下,SUMO2和SUMO3在高糖條件下與IκBα結合導致IκBα降解并激活NF-κB通路。另外,SUMO1與NEMO結合后激活NF-κB。SENP2是NF-κB的下游轉錄靶點,它與NEMO結合導致NEMO去SUMO化抑制NF-κB的激活。

2.5 SUMO化修飾在肌漿網Ca2+ATP酶2a ( Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca ATPase 2a,SERCA2a)功能中的作用 DCM的主要特征是舒張和收縮功能障礙,而鈣離子(Ca2+)循環在心肌細胞的收縮和舒張中起著至關重要的作用。肌漿網(Sarcoplasmic reticulum,SR)作為一個儲存Ca2+的細胞器,在心肌收縮和舒張期間介導Ca2+的釋放和再攝取。SERCA2a作為心臟中表達的SERCA的一種亞型,介導心肌細胞的收縮和細胞質中的Ca2+重新進入SR。SERCA2a的活性調節控制心肌的收縮和舒張影響心功能。SERCA2a在衰竭心臟中的表達和活性降低,而通過增加心肌中SERCA2a表達的基因治療已經被證明是有效的。相關研究發現SERCA2a可以被SUMO1在賴氨酸480和585位點修飾從而提高其酶活性和蛋白質穩定性[16]。在人類衰竭心臟中,SUMO1蛋白和SERCA2a-SUMO化的水平顯著降低。而相關動物實驗表明,小鼠心肌特異性過表達SUMO1后,SERCA2a的活性明顯升高,心衰后心功能得到明顯改善。同時SUMO1過表達阻斷了H2O2對心肌細胞SERCA2a活性的負面影響,從而降低體內氧化應激指標。這些研究表明,靶向SERCA2a-SUMO化是治療DCM心衰的一個潛在方法。

3 小 結

經過幾十年的研究,SUMO化已被證明是一個主要的翻譯后蛋白修飾系統,涉及包括調節蛋白質相互作用、蛋白降解、調控轉錄活性、拮抗泛素化、亞細胞定位等細胞生物學的各個方面。盡管與泛素化途徑相比,SUMO化和去SUMO化途徑的生物化學結構簡單,但通過與其他生化途徑如泛素化、磷酸化和乙酰化的相互作用,SUMO化和去SUMO化能夠實現許多生物功能。在糖尿病心肌中,ERK5-SUMO 化修飾影響ERK5的轉錄活性,調控心肌細胞凋亡。SUMO化還通過調節Nrf2抗氧化應激參與糖尿病的發生。另外SUMO蛋白靶向NLRP3炎癥小體、NF-κB通路相關蛋白調節糖尿病心肌炎癥。心肌Ca2+是心肌收縮的關鍵,活性的SERCA2a調節控制心肌Ca2+的轉運,而SERCA2a- SUMO化可以提高其酶活性和蛋白質穩定性,改善心衰后心功能。除了以上分子的SUMO化修飾參與糖尿病心肌損傷外,還有許多分子的SUMO化修飾參與各類心臟疾病的發生發展,例如:p53、蛋白激酶C(PKC)的SUMO化與動脈粥樣硬化的進展相關;GATA4-6、肌細胞增強因子2(MEF2)、大鼠心臟特異性同源盒轉錄因子NKX2.5(NKX2-5)、血清反應因子(SRF)、T-box轉錄因子2(TBX2)和TBX5的SUMO化修飾在心臟發育中起著關鍵作用;組蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)、缺氧誘導因子1α(HIF1α)的SUMO化參與缺血性心肌病的發展。SUMO化作為未來DCM治療最有潛力的靶標之一,雖然對其研究取得了重大進展,但仍有許多問題待解決,例如SUMO化修飾與其他修飾是怎么相互作用的;在SUMO化修飾過程中靶蛋白如何選擇SUMO亞型;SUMO化修飾途徑中各組分的表達通過什么途徑控制以及各種酶類又是如何發揮作用的。未來對SUMO化修飾的深入研究,這些問題將會得到解決,從而為各類疾病治療提供新的策略。