右美托咪定誘導心肌細胞代償性肥大發揮心肌保護作用實驗研究

曹雪峰,趙 亮,劉旭東,段鳳梅,董天鑫,姬云飛

(1.承德醫學院附屬醫院麻醉科,河北 承德 067000;2.承德醫學院藥理教研室,河北 承德 067000;3.承德市中心醫院麻醉疼痛科,河北 承德 067000)

右美托咪定(Dexmedetomidine,DEX)目前被認為是一種α2腎上腺素受體高選擇性激動劑,具有鎮靜、輔助鎮痛和抗焦慮的作用,受到麻醉科,重癥監護室,兒科等科室的廣泛關注[1-2]。有報道稱,DEX可以減輕膿毒癥模型引起的全身炎癥[3]。另有研究表明,DEX可以抑制細胞凋亡保護組織免受缺血缺氧損傷并改善細胞的適應性缺氧[4-6]。DEX通過減少活性氧(Reactive oxygen species,ROS)和乳酸等有害代謝物的產生提高細胞活力[7-8]。近期研究表明,DEX有心臟保護、肺保護、神經保護和腎保護等作用[9-12]。總的來說,這些數據提示DEX通過不同的分子機制在多種疾病中起圍術期器官保護作用。然而,DEX對心肌細胞形態學的影響鮮有報道。

大量研究表明,在圍術期,麻醉藥物和心臟預處理之間存在重要關聯[13-14]。心肌肥大是一種常見的預處理,它對各種藥物刺激具有形態學適應性[15]。然而,DEX預處理是否誘發心肌細胞形態發生適應性變化尚不清楚。同時,這種心肌肥大對心肌是保護還是損傷,值得研究。這種類似生理性心肌肥厚的形態變化可能是一種會逆轉病理性肥厚和預防有害結果的新治療方法。這將是研究DEX在圍術期發揮心肌保護作用的新的視角,有待為臨床治療心臟疾病提供新的參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要儀器:Thermo-150i細胞孵箱,Thermo公司主營產品;MA100N倒置顯微鏡,日本株式會社尼康Nikon公司產品;低溫恒速變速離心機,美國賽默飛世爾Thermo公司產品;Odyssey生物安全紅外熒光掃描成像儀,中國科協有限公司;FV3000激光掃描共聚焦系統,日本奧巴株式會社。

1.1.2 主要藥品與試劑:右美托咪(批號:21080731,純度 99%) 購自美國Selleck生物科技有限公司;高糖培養基DMEM購于Hyclone(批號:8119045,中國),規格:每瓶500 ml;普諾賽胎牛血清,規格:每瓶500 ml,購于武漢普諾賽生命科技有限公司(批號:SA210518,中國);胰蛋白酶購于索萊寶(批號:20210930,中國),規格:每瓶100 ml;二甲基亞砜購于碧云天(批號:EZ1609C224,中國),規格:每瓶100 ml;ANP一抗購于圣克魯斯生物技術有限公司(批號:sc-515701,中國),規格:每支100 μl;BNP一抗購于abcom公司(批號:ab-23990,英國),規格:每支100 μl;β-MHC一抗購于圣克魯斯生物技術有限公司(批號:sc-53089,中國),規格:每支100 μl; alpha-actinin一抗購于CST生物技術有限公司(批號:6487T美國),規格:每支100 μl。

1.2 實驗方法

1.2.1 新生大鼠心肌細胞(NRVMs)分離培養:無菌條件下把乳鼠(1～3 d)心室肌剪成0.8 mm×0.8 mm×0.8 mm,用DMEM緩沖液洗1 次。棄去DMEM上清液,加入37 ℃溫浴的0.25 %胰蛋白酶進行消化,邊消化邊搖動,目的是讓組織塊充分與胰蛋白酶接觸。丟掉第一次胰蛋白酶消化液,目的是去除血細胞和其他雜質,將已消化下的心肌細胞懸液用巴氏滴管吸至含有35 ml 完全培養液(含15%胎牛血清)的無菌離心管中,4 ℃,2000 r/min 離心3 min,棄掉離心后上清液,細胞沉淀再次用培養液重懸。經200目不銹鋼篩網過濾后,用國際通用的差速貼壁分選法細胞培養箱培養1.5 h后,鏡下人工計數、統計細胞密度,以1.8×104/cm2細胞懸液接種于細胞中皿,3 d后取出用于實驗。本實驗方案已通過河北省承德市承德醫學院動物保護及動物使用委員會批準,并完全達到《國家衛生研究院實驗動物中心小動物區動物使用》的要求。

1.2.2 原代乳鼠心肌細胞表面積測量:SD乳鼠心肌細胞消化、測密度后按照每孔3×105細胞接種于加有24 mm無菌蓋玻片中,不同組別分別加入0.9%氯化鈉溶液或右美托咪定(5 μmol/L)孵育細胞24 h,應用醫學圖像分析系統測量單個細胞的表面積。

1.2.3 免疫熒光化學染色:選取不同組別的心肌細胞用PBS沖洗3遍,冷甲醇固定30 min,加TritonX2100,1%BSA室溫孵育1 h,封閉羊血清封閉5 h后,加入一抗37 ℃孵育,熒光二抗37 ℃孵育,運用共聚焦成像系統觀察蛋白的定位和表達。

1.2.4 Western blot:取不同組別的心肌細胞(數量約2×106～3×106)吸管吹打或機械研磨后冰里放置30 min,離心(13520 r/min、4 ℃、16 min),小心吸取上清液,嚴格按照Bradford公司試劑盒測定蛋白質濃度。100 ℃煮5 min,12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質,快速轉膜30 min,快速封閉液室溫封閉20 min。一抗4 ℃過夜,第二天加入Ⅱ抗室溫孵育1 h后,化學增強發光劑DAB 顯影,凝膠成像儀分析系統掃描,計算目的條帶與GAPDH的相對灰度值作為各蛋白表達的相對含量。

1.2.5 CCK8檢測細胞活性:細胞生長達到70%～95%時,收集消化下的細胞并人工計數,小心吹打混勻制成細胞懸浮液,將密度均勻的5000個細胞加入96孔板中。將處理板孵育24 h。更換新鮮1%FBS+DMEM低血清培養液,隨機分為四組,每組6個復孔,并設置空白對照孔。在96孔細胞板中精準加入12 μl CCK8原液,制成10%的CCK8工作液。細胞孵箱內培育90 min后,酶標儀震蕩混勻450 nm檢測吸光強度(氣泡會影響測定)。

1.2.6 離體原代心肌肥厚模型建立:血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)誘導心肌細胞肥大:細胞貼壁3 d后,用含有1% FBS的維持培養液替換正常的細胞培養液,加入濃度為10-7mol/L的Ang Ⅱ,在37 ℃、5% CO2、95%濕度環境進行培養,隔48 h換1次液,培養3 d后,檢測心肌細胞表面積、細胞體積、肥大相關基因和蛋白含量。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0統計學軟件進行分析。組間比較應用ANOVA分析。應用Bonferroni校正t檢驗進行多組比較,應用配對或非配對t檢驗進行單個比較。雙尾概率P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組大鼠心肌細胞的形態變化 與C組比較,D組細胞面積增大,差異有統計學意義(P<0.01),見圖1A、B。

2.2 兩組大鼠心肌細胞心房利鈉肽(Atrialnatriureticpeptide,ANP)、腦鈉肽(Brain natriuretic peptide,BNP)和β-肌球蛋白重鏈(β-Myosin heavy Chain,β-MHC)蛋白的表達 與C組比較,D組的ANP、BNP、β-MHC蛋白表達增加,差異有統計學意義(均P<0.05),見圖2A、B。

注:左圖為Western blot檢測C組和D組的心肌細胞ANP、BNP和β-MHC表達結果,以β-actin作為內參對照;右圖為Western blot檢測心肌細胞ANP、BNP和β-MHC的相對表達,與C組比較,*P<0.05,**P<0.001圖2 DEX誘導心肌細胞肥大相關蛋白表達上調

2.3 CCK8檢測大鼠心肌細胞活性 與CTL組比較,D組(5 μmol/L)細胞活性明顯增加,差異有統計學意義(P<0.01),見圖3。

注: CTL、對照組及實驗組分別加DEX(1、2、5 μmol/L)處理24 h,與CTL組比較,*P<0.01圖3 DEX增加了心肌細胞的活性

2.4 三組大鼠心肌細胞ANP、BNP和β-MHC蛋白的表達 D組停藥24 h后ANP、BNP、β-MHC蛋白表達明顯恢復,接近C組。而A組停藥24 h后ANP、BNP、β-MHC蛋白表達并未恢復正常(圖4)。

注:C組為無血清培養基處理心肌細胞48 h;A組為Ang Ⅱ(1 μmol/L)處理心肌細胞24 h后,換成無血清培養基繼續培養心肌細胞24 h;D組為DEX處理心肌細胞24 h后,換成無血清培養基繼續培養心肌細胞24 h。圖4 三組大鼠心肌細胞ANP、BNP和β-MHC蛋白的表達

3 討 論

相關文獻報道心血管疾病已成為人類致死的首位元兇[16]。隨著經濟水平的提高和人們生活方式的改善,心血管疾病的患病率和病死率逐年攀升,并呈現年輕化,其中心肌肥大是引起心血管疾病病死率逐年升高的一個主要因素。心肌肥大是一種適應性和代償性機制,在有害刺激下保持心輸出量。然而,長期的刺激會導致慢性肥厚,并可能導致心力衰竭,進而導致患者死亡。由于心肌細胞屬于終末分化細胞,增殖能力有限,心臟通過肥厚性重塑改變其體積和肌肉質量,以增加收縮力和工作負荷。在這種動態反應中,心肌細胞體積增大,形狀變形,基因表達改變,細胞骨架和細胞外基質(ECM)均發生重塑。這種性質的心肌肥厚稱之為病理性心肌肥厚。病理性心肌肥厚主要由于心肌對持續性不良負荷增加的一種適應性反應,如這種刺激得不到緩解,會導致各種惡性事件的發生。比如臨床上常見的惡性心律失常及心力衰竭,同時心肌細胞可能發生多種形式的損傷,如凋亡、壞死、焦亡、鐵死亡、纖維化,這種損傷均可以導致心功能進一步下降和心室惡性重構的發生。這種肥厚通常認為是不可逆轉的,但也有報道在一定的條件下是可逆的[17],而這一特定條件正是可逆性臨床干預的靶點。這種特點的心肌肥厚在發生的初級階段即代償階段,也是一種相對保護心肌的適應性改變。另一種心肌肥厚是生理性心肌肥厚,發生人群比如長期體育鍛煉的人員或妊娠婦女等,隨著時間的推移可維持心臟功能,這種變化通常是可逆的[18]。長期負荷內運動是一種慢性心臟刺激因素,可以誘導心臟發生生理性心肌肥厚,這是一種良性適應性改變,有助于提高心功能,同時對病理性的心肌損傷具有保護效應。因此,心肌肥大是一個平衡的過程:當心肌肥大得到緩解時,它是適應性和代償性的,并對心臟收縮產生有益的影響;當它是慢性得不到緩解的時候,它會變得不適應,并為病理疾病打開了道路。

DEX目前被人們廣泛認為是一種α2-腎上腺素能受體激動劑,并且具有高度選擇性。應用廣泛,備受臨床醫生的青睞,多用于手術麻醉、緩解患者焦慮及鎮靜。α2受體廣泛分布于心血管、中樞、外周神經系統和血小板中,在人體發揮重要的生物學作用。DEX 通過抑制皮質類固醇和皮質醇的分泌,降低體外循環(CPB)后血中cTnI和CK-MB的水平,而這些因子均可以加重心肌細胞的損傷,促進機體炎癥反應的發生。DEX減少心肌缺血/再灌注損傷中的促炎細胞因子和氧化產物,還有研究顯示,DEX可以上調抗凋亡因子Bcl-2的表達,下調促凋亡因子Bax的表達,從而減輕心肌凋亡的發生,起到心肌保護的作用。DEX通過抑制線粒體活性氧生成減輕阿霉素心臟毒性[19]。上述表明DEX通過不同的作用機制在不同的背景下發揮心臟保護作用。但至今有關DEX發揮心臟保護作用與它誘發細胞的形態學報道卻十分少見。本研究從新的視角去探討DEX對心肌的作用,該研究顯示DEX明顯誘發大鼠心肌細胞發生肥大。這種證明為DEX預處理在圍術期環境中的有益作用提供了新的重要證據。

ANP、BNP和C型利鈉肽(CNP)屬于胚胎基因,在胚胎期高表達,而生物體出生后該基因表達減少,直至表達停止。而這種心臟胚胎基因在出生成熟心臟中已停止表達,但在某些特定病理條件下,如壓力超負荷、去甲腎上腺素能神經長期過度興奮、心肌重構等,該類基因可再次激活,表達逐步上調。這一過程中,肌球蛋白重鏈 (MHC) 也會同步表達上調。前期研究顯示,心肌肥厚發生發展過程中,轉錄調節因子GATA4參與調控壓力負荷、內皮素等病理因素誘導的 ANP 、BNP 和MHC等心肌肥厚相關基因的表達[20-21]。可見ANP 、BNP 和MHC可通過轉錄因子調控參與胚胎基因再編程,成為心肌肥厚藥物治療研究的新靶點。本研究顯示DEX處理的乳鼠心肌細胞ANP、BNP和β-MHC的蛋白表達水平明顯增加,也是DEX誘發心肌細胞發生肥大的又一個有力證據。我們用CCK8檢測了兩組心肌細胞的活性,結果表明DEX (5 μmol/L)處理的心肌細胞活性明顯增加,差異是有統計學意義。這說明DEX誘發的心肌細胞肥大可能是一種暫時的可逆的代償性的,類似于生理性心肌肥厚的形態變化。為了證明這個猜測,將實驗分成三組,我們構建了國際通用的心肌細胞肥大模型A組。C組作為對照,無血清培養基處理心肌細胞48 h;A組Ang Ⅱ(1 μmol/L)處理心肌細胞24 h后,換成無血清培養基繼續培養24 h;D組DEX處理心肌細胞24 h后,換成無血清培養基繼續培養心肌細胞24 h。觀察三組心肌細胞肥大相關指標ANP、BNP和β-MHC的變化。結果顯示:D組心肌肥大指標ANP、BNP和β-MHC的表達能隨著時間的延長恢復正常,而病理性肥大組(A組)ANP、BNP和β-MHC的表達則不能恢復。這證明了我們的猜測,DEX發揮心肌保護作用是通過誘發心肌細胞肥大,而這種肥大是類似于生理性心肌肥大,是一種可逆的代償性的形態變化,對心臟是一種有利的保護作用。

近百年來,我們已經在動物實驗、細胞水平、亞細胞水平對心肌肥厚進行了廣維度、多角度的深入探究,研究包括:circRNA、lncRNA、miRNA、信號轉導轉錄激活因子等多個領域。但心肌肥厚的發生發展機制仍然不夠清楚。本研究局限性在于我們采用乳鼠心肌細胞做實驗,與人心肌細胞有一定的差異。開展在體實驗進一步研究DEX誘發心肌肥厚是我們下一步的研究內容。探明心肌肥厚發生機制是心血管領域研究的重要課題,具有重要的理論和臨床實用意義,這將是我們下一步的研究重點。