全反式維甲酸對糖尿病腎病模型大鼠轉化生長因子β1基因甲基化水平影響的實驗研究

張世魯,張 麗,溫文杰,張啟倫,武曉影,薛競帆, 周 婉, 葉山東1,

(1.中國科學技術大學附屬第一醫院內分泌科糖尿病實驗室,安徽 合肥 230001;2.皖南醫學院研究生學院,安徽 蕪湖 241002;3.中國科技大學生命科學與醫學部,安徽 合肥 230001)

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者普遍存在的一種微血管并發癥,可表現出腎小球硬化、腎小管萎縮及腎間質纖維化的病理學改變,存在著發展為終末期腎病的風險[1-2]。轉化生長因子(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)是一種多功能細胞因子,可被各種類型的腎臟細胞及浸潤的炎性細胞分泌,機體高糖可通過多元醇通路和活性氧類激活蛋白激酶C發揮生物學效應,引起腎臟TGF-β1表達增多,刺激腎小管上皮和間質成纖維細胞的細胞外基質聚集,促使微量尿蛋白產生,加劇DN患者疾病進展[3-5]。全反式維甲酸(All-trans retinoic acid,ATRA)是維生素A重要的一種衍生物,能與維甲酸受體(RAR)或維甲類X受體(RXR)結合,作用于維甲酸反應原件(RARE),調控與腎間質纖維化相關基因蛋白表達,起到延緩疾病進展的作用[6]。

DN形成機制復雜,表觀遺傳學在DN中有重要作用,DNA甲基化是目前研究最廣泛、透徹的表觀遺傳學之一,在基因型與表型之間起聯接作用,參與了細胞的多種生理活動,腎臟組織細胞中異常的DNA甲基化,也可能是導致DN發病相關的基因表達異常的原因之一[7]。故本研究使用甲基化特異性PCR技術(MSP)檢測糖尿病腎臟組織病變中TGF-β1基因的DNA甲基化情況,并分析ATRA對糖尿病腎病TGF-β1基因的DNA甲基化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠30只,SPF級,體重180～200 g,自上海南方模式生物公司購入,動物飼養條件:20～23 ℃,濕度60%～70%,明暗各12 h,自由飲水、攝食。

1.2 主要試劑和儀器 鏈脲佐菌素(美國Sigma 公司,貨號:S8050)、血糖儀(中國三諾公司)、考馬斯亮藍法蛋白含量測試盒(上海酶聯生物科技有限公司,貨號:ml2766)、全自動生化分析儀(日本奧林巴斯,型號:AU400)、蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號:G1120-100)、糖原PAS染色試劑盒(貨號:G1281)、甲基化特異性PCR試劑盒(MSP;北京天根生化科技有限公司,貨號:EM101)、總RNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號:R6754-02)和反轉錄試劑盒(貨號:RP1105)、凝膠成像系統(美國Proteinsimple公司,型號:Fluor Chem R)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組與模型制備:將30只SD大鼠按隨機數字表法分為對照組、DN組、DN+ATRA組,每組10只。對照組正常飲食,DN組、DN+ATRA組高脂高糖飼料(購自江蘇協同生物科技有限公司),喂養4周后通過單次腹腔注射30 mg/kg 鏈脲佐菌素(STZ)復制糖尿病大鼠模型,72 h后,取大鼠尾部靜脈血樣測血糖值,當血糖≥16.7 mmol/L視為模型建立成功,期間繼續喂養高脂高糖飼料,于4周后對24 h尿白蛋白排泄率進行測定,尿白蛋白排泄率>20 mg、尿糖陽性提示DN大鼠造模成功。造模成功后,DN+ATRA組大鼠給予5 mg/kg ATRA(購自北京索萊寶科技有限公司)灌胃,對照組、DN組大鼠予以等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃,持續給藥4周。藥物干預4周后,大鼠放入代謝籠中進行24 h尿液采集。所有大鼠麻醉后腹主動脈取血標本,離心收集血清,頸椎脫臼處死大鼠,分離左腎組織,置入-80 ℃冰箱冷凍保存,用于后續實驗。

1.3.2 24 h尿蛋白和血液生化指標的檢測:取24 h尿液樣本,3000 r/min離心5 min,收集上清,考馬斯亮藍法測定大鼠24 h尿蛋白定量。取大鼠空腹尾靜脈血樣本,利用血糖儀測定空腹血糖值(Fasting blood glucose,FBG)。全自動生化分析儀測藥物干預4周后血清中肌酐(Serum creatinine,Scr)、血尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)水平。

1.3.3 腎臟組織學檢查:腎臟組織去除被膜固定在4%多聚甲醛溶液中,經脫水、包埋等步驟后制成4 μm切片,分別進行HE染色和PAS染色,光鏡(200×)下觀察腎臟組織病理。

1.3.4 MS-PCR檢測各組大鼠腎臟中TGF-β1基因的DNA甲基化水平:通過http://www.genome.UCSC.edu/網站搜索查詢找尋TGF-β1基因在 5’-非翻譯區附近的CpG島(TGF-β1 基因表達調控區 CpG富含區域),設計MSP甲基化和非甲基化TGF-β1引物,引物區段為CpG最大富含區,位于第一外顯子區,共424 bp。參照說明書提取大鼠腎臟組織的DNA,采用超微量分光光度計測定DNA濃度及吸光度值,對提取的基因組DNA進行亞硫酸氫鹽轉化,PCR擴增,引物序列:甲基化TGF-β1上游5’-TCGCGGAGTAGTTAGATAGC3’、下游5’-ACTACTGCTCGAC-GACTCC-3’;非甲基化TGF-β1引物序列:上游5’-TTTTTGTCAGTAGTTAGATAGT-3’、下游5’-AACTACTGTCAACAACTCCTT-3’,MSP擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像儀獲取圖像。

1.3.5 RT-PCR檢測各組大鼠腎臟組織中TGF-β1 mRNA表達:將大鼠腎臟組織研磨收集于1 ml EP管內,保存至-80 ℃條件下,進行Trizol法提取總RNA并取2 μg RNA進行逆轉錄,引物序列:TGF-β1上游5’-GACCACTTTGTCAAGCTCTATTTCC-3’,下游5’-GTGAG-GGTCTCTCTTCCTCTTGT-3’;內參GAPDH上游5’-GACCACTTTGTCAAGCTCTATTTCC-3’,下游5’-GTGAGGGTCTCTCTTCCTCTTGT-3’。逆轉錄后常規反應條件下擴增40個循環,凝膠成像儀獲取圖像,2-ΔΔCT對樣本基因進行表達差異相對定量分析。

1.3.6 Western blot檢測各組大鼠腎臟組織中TGF-β1蛋白表達:取適量腎臟組織加入裂解液和蛋白酶抑制劑,充分研磨后超聲破碎,收集上清液,測定蛋白濃度并制樣,電泳分離后轉入PVDF膜,用10%的山羊血清,封閉2 h,分別加入一抗4 ℃孵育過夜,二抗常溫孵育2 h,常溫環境下洗膜三次,GAPDH作內參,加入化學發光液顯色,成像拍照,進行灰度值統計分析。

1.3.7 免疫組織化學檢測各組大鼠腎臟組織中TGF-β1蛋白表達: 取腎臟組織4%多聚甲醛溶液固定,石蠟包埋,脫蠟水化,滴加抗原消化液、修復液,滴加特異性一抗,4 ℃過夜,滴加二抗,DAB顯色(黃褐色顆粒),蘇木素襯染,脫水后可烘干,光鏡下進行觀測。

2 結 果

2.1 各組大鼠空腹血糖(FBG)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)及24 h尿蛋白比較 與對照組比較,DN組大鼠FBG、BUN、Scr、24 h尿蛋白升高;與DN組比較,DN+ATRA組大鼠FBG、BUN、Scr、24 h尿蛋白降低,但高于對照組,差異有統計學意義(均P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠FBG、Scr、BUN及24 h尿蛋白比較

2.2 各組大鼠腎組織HE染色 對照組大鼠腎臟組織形態正常,腎小球系膜無增生,腎小管無萎縮,腎間質未發現炎性細胞浸潤或結締組織增生。DN組腎小球形狀不規則,系膜基質增多,部分腎小管有萎縮且存在管腔擴張,腎小管周圍有較多炎癥細胞浸潤和組織增生,DN+ATRA組大鼠腎小球和腎小管病變程度較DN組有所好轉。見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織HE染色(×200)

2.3 各組大鼠腎組織PAS染色 對照組腎臟結構清晰,腎小球、腎小管未見明顯病理改變,無炎細胞浸潤。DN組腎小球系膜基質增多著玫紅色,基底膜增厚,伴有部分腎小球硬化,可見炎細胞浸潤。DN+ATRA組大鼠腎小球系膜基質增多、基底膜增厚、炎性細胞浸潤及腎小球硬化情況好于DN組。見圖2。

圖2 各組大鼠腎組織PAS染色(×200)

2.4 MS-PCR檢測各組大鼠腎臟組織TGF-β1基因的DNA甲基化水平 DN組大鼠腎臟組織TGF-β1基因的DNA甲基化水平相較于對照組顯著降低,DN+ATRA組大鼠腎臟組織TGF-β1基因的DNA甲基化水平相較于DN組顯著升高(均P<0.05)。見圖3。

注:M:甲基化引物擴增;U:非甲基化引物擴增圖3 各組大鼠腎臟組織TGF-β1基因的DNA甲基化水平

2.5 RT-PCR檢測各組大鼠腎臟組織TGF-β1 mRNA表達 對照組大鼠腎臟組織TGF-β1 mRNA表達低于DN組,DN+ATRA組大鼠腎臟組織TGF-β1 mRNA表達顯著高于對照組,低于DN組(均P<0.05)。見圖4。

注:與對照組比較,*P<0.05;與DN組比較,#P<0.05圖4 各組大鼠腎臟組織TGF-β1 mRNA表達

2.6 Western blot檢測各組大鼠腎臟組織TGF-β1蛋白表達 對照組大鼠腎臟組織TGF-β1蛋白表達低于DN組,DN+ATRA組大鼠腎臟組織TGF-β1蛋白表達顯著高于對照組,低于DN組(均P<0.05)。見圖5。

注:與對照組比較,*P<0.05,與DN組比較,#P<0.05圖5 各組大鼠腎臟組織TGF-β1 mRNA表達比較

2.7 免疫組織化學檢測各組大鼠腎臟組織TGF-β1蛋白表達 對照組大鼠腎臟組織少量TGF-β1蛋白陽性表達,主要在腎小管上皮細胞,胞漿內或胞膜出現棕黃色顆粒,DN+ATRA組TGF-β1蛋白陽性表達高于對照組,低于DN組(均P<0.05)。見圖6。

圖6 各組大鼠腎臟組織TGF-β1蛋白表達

3 討 論

DN是糖尿病微血管并發癥之一,高血糖是公認引發DN的主要致病因素,DN早期以腎小球肥大、基底膜增厚及系膜擴張為特征,晚期出現腎小球硬化和間質纖維化[8]。在DN中,TGF-β1是腎臟組織纖維化中ECM沉積和EMT的重要誘因,抑制TGF-β1表達有潛在的腎臟保護特性[9]。而ATRA屬于核受體超家族,維甲酸受體RAR、RXR在各種生物過程中發揮關鍵作用,包括發育、繁殖、免疫等,最近研究發現,ATRA對部分腎臟疾病也有治療作用[10-12]。本研究中,與對照組比較,DN組大鼠FBG、BUN、Scr、24 h尿蛋白升高,而ATRA干預后DN大鼠FBG、BUN、Scr、24 h尿蛋白降低,說明ATRA能改善DN大鼠腎功能。HE染色和PAS染色顯示,DN組腎小球形狀不規則,系膜基質增多,部分腎小管有萎縮且存在管腔擴張,腎小管周圍有較多炎癥細胞浸潤和組織增生,ATRA干預后大鼠腎小球和腎小管病變程度有所好轉。說明ATRA能減輕系膜基質積聚,抑制腎小管周圍的炎癥細胞浸潤,具有病變組織修復效果,印證了ATRA對腎損傷的保護作用。李紅艷等[13]研究發現,ATRA能降低血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和人干擾素-Y(IFN-Y)水平,減輕腎臟組織缺血再灌注造成的炎癥細胞浸潤。周添標等[14]通過建立大鼠RIF模型,ATRA灌胃后抑制了腎間質纖維化(RIF)大鼠腎臟組織Ⅳ型膠原(ColⅣ)和纖維鏈接蛋白(FN)表達,并可能通過上調人維甲酸受體α(RARα)表達對阻抑素水平進行調控,延緩RIF進展。

DNA甲基化可調控基因表達,通常情況下,啟動子區DNA甲基化水平增加,可通過多種途徑間接或直接抑制基因轉錄,如:與啟動子的調控位點結合或作用于其他轉錄因子,而啟動子區DNA甲基化水平降低則會導致基因表達的增加[15]。而在DN中,TGF-β1基因表達增加基本已成定論,且有研究稱,DN患者TGF-β1基因表達調控區甲基化水平有所降低[16-18]。因此,本研究通過MSP法檢測腎臟組織TGF-β1基因的DNA甲基化水平,發現DN組大鼠腎臟組織TGF-β1基因的DNA甲基化水平相較于對照組顯著降低,DN+ATRA組大鼠腎臟組織TGF-β1基因的DNA甲基化水平相較于DN組顯著升高。此外,本研究還通過RT-PCR、Western blot、免疫組織化學檢測ATRA對腎臟組織TGF-β1 mRNA和蛋白表達,發現DN+ATRA組大鼠腎臟組織 TGF-β1 mRNA和蛋白表達水平明顯降低。與李國宏等[19]研究較為一致。可見DN發生中相關基因DNA甲基化等表觀遺傳學改變是可以逆轉的,TGF-β1基因的DNA甲基化水平降低,導致mRNA和蛋白高表達,進而參與糖尿病腎病的發生發展。ATRA可能通過抑制某種細胞因子或信號通路發揮作用,降低TGF-β1 mRNA和蛋白表達水平,緩解腎小球的損害,減輕腎小管的損傷,使細胞外基質的沉積減少。許召君等[20]報道了ATRA可通過介導維甲酸誘導基因1(RIG1)甲基化來調節細胞的增殖,并確定RIG1啟動子中存在視黃酸反應元件,同時發現RIG-1缺乏會造成肝臟組織癌變, 并通過促進MMP-9表達加快肝癌的增殖、遷移和侵襲的能力。而MMP-9參與腎臟組織EMT的發生過程,MMP-9還可通過切割腎小管管狀基膜主要成分Ⅳ型膠原和層黏連蛋白破壞管狀細胞膜的完整性,誘導腎小管細胞發生EMT。陳珂等[21]就通過ATRA對大鼠肝星狀細胞(HSC-T6)體外干預實驗探討其作用機制,發現ATRA能夠通過抑制HSC-T6細胞中TGF-β1的下游信號蛋白Smad2/3的表達來影響TGF-β1/Smad信號通路,發揮其抗肝纖維化的作用。

綜上所述,ATRA能通過升高TGF-β1基因的DNA甲基化水平,抑制DN大鼠腎臟組織TGF-β1 mRNA和蛋白表達,改善DN大鼠腎臟組織的纖維化程度,但從何種途徑抑制DN中TGF-β1基因的DNA甲基化水平,還需要進一步研究。