急性髓系白血病患者獨立生長因子1B表達與各亞型診斷及臨床治療結局的關系

張志敏,劉鑫艷,張永梅,潘志蘭,林鳳茹,趙曉君

(1.石家莊市人民醫院血液內科,河北 石家莊 050000;2.石家莊市中醫院內科,河北 石家莊 050011;3.河北醫科大學第二醫院血液內科,河北 石家莊 050004)

急性髓系白血病(Acute myeloidleukemia,AML)屬于常見的血液系統惡性腫瘤,發病率逐年升高,患者臨床預后不佳,非依賴性生長因子1B(Growth factor-independent 1B,GFI1B)基因最早在鼠類細胞檢出,人類GFI1B基因在胎兒和成人的不同器官中表達水平不相同,主要在人類骨髓和胎兒肝臟中表達水平最高,因此GFI1B基因在造血系統的前體細胞中表達較活躍[1]。有學者報道2006年Ahmet等首次發現GFI1B作為一種癌基因可以加快腫瘤細胞的增殖速度,由于該因子主要表達在成人紅細胞系和巨核細胞系,因此在紅白血病(Acute erythroid leukemia,AML-M6)和急性巨核細胞白血病(Acute megakaryocytic leukaemia,AML-M7)中表達水平明顯增高,而且在不同類型白血病患者中表達不一,但是目前在本地區的研究報道較為少見[2]。本研究通過了解AML患者GFI1B的表達與各亞型診斷及臨床治療結局的關系,目的是為了急性髓系白血病患者臨床診斷、治療、預后評估以及微小殘留病變監測提供重要的理論依據,現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取石家莊市人民醫院2009年8月至2015年12月血液科收治的AML患者60例(ALL組),急性淋巴細胞白血病患者26例(ALL組),慢性粒細胞白血病患者18例(CML組)、骨髓增生異常綜合征患者24例(MDS組)以及健康志愿者10例(對照組)。病例納入標準:①納入對象的年齡范圍18～65歲;②AML、ALL、CML及MDS患者的診斷標準參考人民衛生出版社《內科學》[3]中血液疾病的診斷標準,均為初治患者;③患者經血常規、骨髓象檢查確診;④患者均在我院接受化療,并接受全周期的隨訪觀察;⑤研究方案符合我院醫學倫理專家組要求。排除標準:①伴有其他類型或部位惡性腫瘤患者;②嚴重的基礎性疾病(肝功能障礙、腎功能障礙、心功能障礙);③艾滋病病毒(HIV)感染患者;④精神疾病患者;⑤妊娠及哺乳期婦女;⑥伴有其他影響本研究結果的因素者。五組年齡、體重指數(BMI)、性別構成、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、心跳率(HR)值比較,差異無統計學意義(均P>0.05),具有可比性。見表1。

表1 五組一般資料比較

1.2 研究方法

1.2.1 RQ-PCR檢測方法:分析AML、ALL、CML、MDS以及正常人群GFI1B基因表達水平,采用定量聚合酶鏈反應(RQ-PCR)法測定。測定方法:Trizol提取細胞總RNA,將新鮮骨髓液加入4 ml Ficoll淋巴細胞分離液,離心后分離單個核細胞,0.9%氯化鈉溶液洗滌3次后采取硫氰酸胍-苯酚-氯仿迪奧細胞總RNA提取。采用隨機引物法合成cDNA,逆轉錄體系20 μl包括細胞總RNA1 μg、隨機引物500 ng、RNasin 25 U,逆轉錄反應緩沖液4 μl在37 ℃條件下反應60 min,94 ℃反應5 min,1 ℃反應2 min后終止。摻入熒光染料進行 PCR擴增,GFI1B正義引物:5’-TCTGGCCTCCTGCCCTTAC-3’,GFI1B反義引物:5’-CCGGCTCT-CGTTTGAGGTT-3’,GFI1B探針序列:5’-FAM-CCGGTGCCCAGAGACCAGGC-TAMRA-3’,GFI1B擴增片段長度:117 bp。進行RQ-PCR反應,擴增條件:93 ℃反應3 min,93 ℃ 30 s,55 ℃反應45 s,進行40個循環,熒光定量RCR儀讀取結果。

1.2.2 化療方法:初始治療患者應用柔紅霉素聯合阿糖胞苷方案,柔紅霉素40 mg/m2,靜脈滴注,第1～3天,阿糖胞苷100 mg/m2,靜脈滴注,第1～7天,治療結束休息14 d,連續治療4個療程觀察療效。復發患者則給予高三尖杉酯堿、阿糖胞苷開展治療,高三尖杉酯堿1 mg/(m2·d),靜脈滴注治療第1～14天,阿糖胞苷10 mg/(m2·d),12 h皮下注射1次,第1～14天。治療14 d休息7 d,連續治療4個療程觀察療效。化療效果評價參考《血液病診斷及療效標準》[4-5]中的標準。完全緩解(CR):患者的白血病細胞浸潤的癥狀和體征完全消失,男性患者的血紅蛋白≥100 g/L或女性患者≥90 g/L,患者的中性粒細胞絕對值≥1.5×109/L,血小板檢測結果≥100×109/L,血象檢測未發現白血病細胞,患者骨髓象檢測,原始細胞≤5%;部分緩解(PR):患者的骨髓中原始細胞 5%～20%,或臨床、血常規檢查中任何一項未達到完全緩解的標準;未緩解(NR):骨髓象、血常規及臨床表現未達上述標準。

2 結 果

2.1 五組GFI1B mRNA表達水平比較 AML組患者的GFI1B mRNA表達水平顯著高于ALL組、CML組、MDS組和對照組,差異具有統計學意義(均P<0.05);CML組患者的GFI1B mRNA表達水平高于ALL組、MDS組和對照組,差異具有統計學意義(均P<0.05);ALL組、MDS組患者的GFI1B mRNA表達水平高于對照組,差異具有統計學意義(均P<0.05)。見表2(圖1、2)。

圖1 五組患者的GFI1B mRNA溶解曲線

表2 五組GFI1B mRNA表達水平比較

2.2 不同FAB分型AML患者GFI1B mRNA表達水平比較 根據FAB分型,M7型AML組患者的GFI1B mRNA表達水平顯著高于其他分型的AML患者,差異具有統計學意義(均P<0.05);M6型AML組患者的GFI1B mRNA表達水平顯著高于其他分型(M1-M5)的AML患者,差異具有統計學意義(均P<0.05);M4型AML組患者的GFI1B mRNA表達水平顯著高于其他分型(M1、M2、M3、M5)的AML患者,差異具有統計學意義(均P<0.05)。見表3(圖2、3)。

圖2 五組患者的GFI1B mRNA表達熒光電泳圖

圖3 M4、M6、M7型AML患者GFI1B mRNA表達的溶解曲線

表3 不同FAB分型的AML患者GFI1B mRNA表達水平比較(×106拷貝/μl cDNA)

2.3 不同化療效果AML患者GFI1B mRNA表達水平比較 根據化療效果,60例接受化療的AML患者中,CR患者32例、PR患者16例、NR患者12例;CR+PR組患者治療前及治療后的GFI1B mRNA表達水平均顯著低于NR組患者,差異具有統計學意義(均P<0.05)。見表4。

表4 不同化療效果AML患者GFI1B mRNA表達水平比較

3 討 論

GFI1B是在人類基因組中發現與GFI1結構相似的核轉錄抑制因子,在胎兒與成人紅細胞系和巨核細胞系中表達,近年來發現同惡性血液病發生、發展關系密切[6]。有學者發現GFI1B基因在急性白血病中表達水平較高,且在AML M6、M7分型患者軀體中表達顯著增高,但是白血病細胞株HEL、K562、CMK、M-07e中表達則不顯著,提示GFI1B異常高表達同血液惡性疾病發生密切相關,同本研究結果基本一致[7]。本研究中對血液病患者開展分層研究發現,AML組患者GFI1B mRNA表達水平最高。研究發現AML發生同造血干細胞異常增殖和成熟障礙有關,是多個基因共同參與AML發病過程,同基因表達與編碼蛋白功能異常相關,GF基因則是調控細胞轉化的重要基因,對細胞轉錄調控產生影響。近年來研究發現GFI1B會加速淋巴細胞瘤進展,同時表達在造血干細胞中影響干細胞自我更新過程產生影響,造成細胞功能完整性受到影響[8]。

本研究還對AML患者開展分層研究發現,M7型AML組患者的GFI1B mRNA表達水平最高,M6型AML組患者的GFI1B mRNA表達水平顯著高于其他分型(M1-M5)的AML患者。急性巨核細胞白血病(AML-M7)屬于較為少見類型,預后較差,有學者發現GFI1基因能夠對凋亡因子表達進行抑制,影響細胞信號轉導過程,對轉錄激活因子3活性產生增強作用,造成造血祖細胞惡變[9]。還有學者發現GFI1B基因會影響細胞周期依賴激酶表達,導致其抑制物形成增多,讓細胞滯留在G1期無法進行分化,通過和GFI1基因發生作用誘導癌變,有研究發現原發性骨髓纖維化轉化為急性巨核細胞白血病的患者接受化學藥物治療后GFI1B基因表達轉為陰性,側面證實了GFI1B基因對AML-M7診斷、預后評價存在預測價值[10]。急性紅白血病(AML-M6)則屬于異質性血液系統惡性腫瘤,而在骨髓細胞學檢查中由于多系發育異常會給臨床診斷造成困難,患者早期體征與MDS患者病史相似,因此容易混淆,但是GFI1B基因表達陽性可能成為臨床診斷AML-M6的新方法[11-12]。

本研究中發現ALL組、CML組、MDS組GFI1B mRNA表達水平高于對照組,但是在既往研究中發現在CML慢性期患者體內GFI1B mRNA表達同正常人群無差異性,考慮到GFI1B 基因屬于髓系表達重要因子,在慢性病變表達中僅是輕度增加,但是在急性髓變表達水平顯著升高,表明了急性白血病發病過程中GFI1B基因發揮了重要作用[13-15]。MDS屬于起源自造血干細胞中白細胞發生病態形成的疾病,轉變急性白血病風險較高,有研究發現MDS患者中紅細胞系呈輕度增加,但是GFI1B則表達水平未見顯著升高,提示GFI1B表達增加不會誘發MDS,這和本研究結果存在差異[16]。本研究還分析了化療后AML患者中CR+PR組患者治療前及治療后的GFI1B mRNA表達水平均顯著低于NR組患者,說明采取積極的化療可以減輕患者臨床體征,同時降低體內GFI1B mRNA表達水平。有學者發現對原發性骨髓纖維化轉化為急性巨核細胞白血病患者開展積極治療后患者緩解后GFI1B/GFI1基因表達轉為陰性,同本研究結果一致[17-18]。還有研究發現對于沉默的GFI1B基因可以利用轉染導致細胞增殖降低,增加凋亡,提示了臨床對于沉默的GFI1B基因可能成為抗白血病治療新策略[19-20]。

本研究分析了AML患者的GFI1B mRNA表達水平變化,目的是為AML-M6和M7診斷、治療以及微小殘留病變的監測尋找重要的理論依據,也對于臨床開展白血病診斷和治療提供了相應的依據,同時也提示臨床應對患者GFI1B基因開展定期監測以了解患者病情變化狀況。但是由于研究病例數量有限,而且在對白血病治療上未能比較不同化療方案對患者GFI1B基因的影響變化,同時對GFI1B基因影響AML發病的具體機制尚未深入研究,還需要進一步擴大樣本數量、開展隨機對照試驗論證分析。

綜上所述,AML患者的GFI1B mRNA表達水平顯著高于其他類型白血病患者,其中M7、M6型的GFI1B mRNA表達水平最高;GFI1B mRNA表達水平與AML患者化療效果有一定的關系。