急診有機磷中毒患者外周血微小核糖核酸-214、T淋巴細胞和炎癥因子表達與早期腎損傷關系

佘育純,路 勇,王建龍

(國際醫學中心醫院急診科,陜西 西安 710119)

急診有機磷中毒是指有機磷農藥短時大量進入人體后造成一系列損害的中毒性急危重癥,病情進展迅速,患者短時間內可出現膽堿能神經興奮或危象,多表現為嘔吐、多汗、流涎、呼吸急促、心跳減慢、瞳孔縮小等癥狀[1]。有機磷農藥被人體吸收后迅速分布于全身各器官,引起廣泛毒性損害,對呼吸、循環、消化及神經系統產生損傷,腎損傷是急診有機磷中毒的常見并發癥,主要表現為短時間內腎功能急劇下降,且預后較差,是導致患者死亡的重要原因之一,因此早期診斷、積極治療腎損傷,對改善患者預后、提高生存率具有重要意義[2-3]。有文獻指出,微小核糖核酸(microRNA,miR)參與多種中毒后病理損傷及修復過程,其中miR-214在急診有機磷中毒中表達異常[4]。急診有機磷中毒不僅會引起機體多臟器功能損害,還伴隨免疫功能減退,影響腎功能的恢復,而T淋巴細胞是機體免疫系統內最重要的細胞群,對免疫應答起調節作用[5]。炎癥反應在多種急危重癥中起重要作用,有機磷農藥進入機體后通過激活免疫活性細胞進而引發炎癥反應,分泌大量的炎癥介質,研究顯示,促炎-抗炎平衡失調是急診有機磷中毒導致器官損害的病理機制之一,患者腎功能減退后對毒素的清除能力下降,加重組織損傷,C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)可作為中毒程度和組織損傷程度的參考指標,廣泛應用于急性中毒領域,白細胞介素-18(Interleukin 18,IL-18)是一個重要的多效能促炎因子,是導致機體損傷的重要炎性介質[6-7]。目前關于急診有機磷中毒患者miR-214、T淋巴細胞、炎癥因子水平變化及其與腎損傷關系的報道甚少,尚未有公認能反映急診有機磷中毒患者發生早期腎損傷的靈敏指標,基于此,本研究旨在分析急診有機磷中毒患者外周血miR-214、T淋巴細胞和炎癥因子的表達與早期腎損傷的關系,現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月至2022年1月在我院進行診治的80例急診有機磷中毒患者為研究對象,將其作為研究組,根據是否發生早期腎損傷將其分為腎損傷組(n=24)和非腎損傷組(n=56),另選取同期50例健康體檢者作為對照組。研究組中男44例,女36例;年齡22～68歲,平均(43.40±13.68)歲;體重指數18～27 kg/m2,平均(22.17±1.58)kg/m2。對照組中男28例,女22例;年齡20～65歲,平均(42.91±13.39)歲;體重指數18～25 kg/m2,平均(21.16±1.62)kg/m2。兩組一般資料經比較,差異無統計學意義(均P>0.05),組間可進行比較。本研究經醫院倫理委員會批準。病例納入標準:①研究組患者符合《急性有機磷農藥中毒診治臨床專家共識(2016)》[8]中的診斷標準;②無認知功能障礙者;③未進行血液灌流治療者;④未使用過影響免疫功能的藥物者;⑤無慢性腎臟病史者;⑥資料齊全、數據完整者。排除標準:①合并有感染性疾病者;②合并有惡性腫瘤者;③合并有嚴重心、肺、腦疾病者;④近期服用過腎毒性藥物者;⑤進行過器官移植者;⑥合并有泌尿系統疾病者。

1.2 研究方法

1.2.1 收集研究對象一般資料:包括性別、年齡、體重指數、中毒時間、服毒量、miR-214、CD3+、CD8+、CRP、IL-18水平。入院后采集晨起空腹外周血3 ml,按照3000 r/min的速度離心5 min,分離上層血清,置于-20 ℃環境下保存待檢。

1.2.2 miR-214檢測方法:采用TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)提取總RNA,待標本鑒定合格后,行反轉錄,試劑盒由日本TOYOBO公司、大連TaKaRa公司提供。采用實時熒光定量PCR法檢測外周血miR-214水平,PCR反應條件:95 ℃預變性2 min,95 ℃變性2 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,共35個循環。miR-214莖環引物:5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-ACTGCCT-3’,上游引物:5’-TTTGTTGACAGCAG-GCACAGAC-3’,下游引物:5’-TCCAGTGCAGGG-TCCGAGGT-3’,由上海Sangon Biotech公司合成,采用2-ΔΔCt法計算miR-214的相對表達量。

1.2.3 T淋巴細胞檢測方法:采用ESPIL-XL流式細胞儀(美國BECKMAN公司)檢測T淋巴細胞亞群,包括CD3+、CD8+水平。

1.2.4 炎癥因子檢測方法:采用CX7型全自動生化分析儀(美國BECKMAN公司)檢測CRP、IL-18水平,試劑盒由法國Diaclone公司提供。

1.3 觀察指標 ①比較對照組、研究組miR-214、CD3+、CD8+、CRP、IL-18水平。②單因素分析。比較腎損傷組、非腎損傷組性別、年齡、體重指數、中毒時間、服毒量、miR-214、CD3+、CD8+、CRP、IL-18水平。③多因素Logistic回歸分析。采用多因素Logistic回歸分析急診有機磷中毒患者發生早期腎損傷的危險因素。④受試者工作特征曲線(ROC)分析。采用ROC曲線分析miR-214、CD3+、CD8+、CRP、IL-18水平對急診有機磷中毒患者發生早期腎損傷的預測價值。

2 結 果

2.1 兩組miR-214、CD3+、CD8+、CRP、IL-18水平比較 研究組miR-214、CRP、IL-18水平均高于對照組,CD3+、CD8+水平均低于對照組(均P<0.05),見表1。

表1 兩組miR-214、CD3+、CD8+、CRP、IL-18水平比較

2.2 急診有機磷中毒患者發生早期腎損傷的單因素分析 單因素分析結果顯示,腎損傷組miR-214、CRP、IL-18水平均高于非腎損傷組,CD3+、CD8+水平均低于非腎損傷組,差異有統計學意義(均P<0.05);而兩組間性別、年齡、體重指數、中毒時間、服毒量比較差異無統計學意義(均P>0.05),見表2。

表2 急診有機磷中毒患者發生早期腎損傷的單因素分析

2.3 影響急診有機磷中毒患者發生早期腎損傷的變量賦值 將表2中存在差異的因素進行變量賦值,結果見表3。

表3 影響急診有機磷中毒患者發生早期腎損傷的變量賦值

2.4 急診有機磷中毒患者發生早期腎損傷的多因素Logistic回歸分析 多因素Logistic回歸分析結果顯示,miR-214、CD3+、CD8+、CRP、IL-18水平均為影響急診有機磷中毒患者發生早期腎損傷的危險因素(OR=5.094、5.726、5.441、5.479、6.080,均P<0.05),見表4。

表4 急診有機磷中毒患者發生早期腎損傷的多因素Logistic回歸分析

2.5 ROC曲線分析 ROC曲線分析顯示,miR-214、CD3+、CD8+、CRP、IL-18水平在預測急診有機磷中毒患者發生早期腎損傷中具有較高價值(均P<0.05),見表5。

表5 ROC曲線分析

3 討 論

有機磷中毒是急診常見病癥之一,是我國發生率最高的中毒類型,據統計,我國每年發病人數約為5萬～6萬,具有發病快、病情重、病死率高等特點,常因救治不當危及患者生命安全。有機磷農藥經由皮膚或消化道等途徑進入人體后,與乙酰膽堿酯酶相結合致使乙酰膽堿無法正常分解,進而引起乙酰膽堿異常聚集,引發廣泛毒性損害[9]。

除結合乙酰膽堿酯酶導致中毒這一機制外,有機磷農藥分子還可通過干擾細胞能量代謝、抑制免疫系統功能、損傷DNA等多種機制引發全身系統性損害。miR廣泛參與疾病的損傷與修復過程,其在巨噬細胞、自然殺傷細胞等多種細胞的增殖分化過程中起著重要作用,參與多種疾病的發生發展。有研究證實,有機磷農藥分子進入機體后會引發miR異常表達,miR-214可通過靶向調控相應基因表達,發揮介導并干擾正常的核酸合成與代謝、神經遞質的轉運等生物學功能,在物質與能量代謝、細胞活化與增殖、細胞凋亡、內皮功能紊亂、氧化應激、免疫與炎癥反應等方面發揮調控作用,高表達的miR-214可能經由上述調控途徑參與急診有機磷中毒的發生及中毒后多器官功能損害等病理過程,進而影響患者預后[10-11]。有機磷中毒導致各臟器出現一系列病理生理變化后,還會導致T淋巴細胞免疫系統功能減退。T淋巴細胞保證機體免疫功能得以正常維持,當T淋巴細胞亞群發生數量變化時,其功能也發生異常,導致機體免疫功能紊亂,進一步加重病理損害[12]。發生急診有機磷中毒后,患者CD3+、CD8+百分比下降表明成熟T細胞總數減少,使得T細胞免疫儲備量減少,導致無法充分接觸抗原發生免疫應答[13]。免疫學機制表明,外源性毒素進入人體后,除對機體組織細胞產生直接破壞作用外,還會引發自身免疫反應、激活炎性細胞,當炎性細胞被過度激活進而釋放過量的致炎因子時,將會引發全身炎性反應綜合征,造成組織器官損傷,進一步引發多器官功能障礙綜合征,這被諸多學者認為是有機磷中毒致死的主要原因[14]。研究表明,當人體發生應激反應時,血液中CRP濃度迅速升高,參與炎癥反應;IL-18可誘導T淋巴細胞、自然殺傷細胞等產生干擾素-γ,刺激單核細胞產生腫瘤壞死因子-α,調節單核-巨噬細胞表達,促發炎癥反應,導致機體發生炎癥性損傷[15]。本研究結果顯示,研究組miR-214、CRP、IL-18水平均高于對照組,CD3+、CD8+水平均低于對照組,提示miR-214、CRP、IL-18在急診有機磷中毒患者中呈高表達,CD3+、CD8+呈低表達,可作為早期判斷急診有機磷中毒的標志物。

急診有機磷中毒可引發機體多系統損傷,其中消化、呼吸、心血管方面的損傷是臨床關注的重點,但關于腎損傷的研究較少。查閱國內外文獻發現,有機磷中毒是腎損傷發生的主要誘因之一,有機磷農藥進入機體后迅速遍布全身,可直接作用于腎小球和腎小管,還可通過自由基損傷導致腎小管上皮細胞發生壞死,同時,患者中毒后會破壞腎臟毛細血管壁,體內多種血管活性物質異常釋放,血流動力學發生改變,導致腎低血壓灌注,腎小球濾過率急劇下降,引起腎小管缺血性壞死,故早期識別腎損傷對有機磷中毒的搶救具有重要意義[16-17]。本研究結果顯示,腎損傷組miR-214、CRP、IL-18水平均高于非腎損傷組,CD3+、CD8+水平均低于非腎損傷組;多因素Logistic回歸分析結果顯示,miR-214、CD3+、CD8+、CRP、IL-18水平均為影響急診有機磷中毒患者發生早期腎損傷的危險因素;ROC曲線分析顯示,miR-214、CD3+、CD8+、CRP、IL-18在預測急診有機磷中毒患者發生早期腎損傷中具有較高價值,提示急診有機磷中毒會引發腎損傷,miR-214、CD3+、CD8+、CRP、IL-18水平可以預測腎損傷發生風險。對其中原因進行分析發現,王寧等[18]在缺血性急性腎損傷大鼠腎組織中發現高表達的miR-214,其水平高達健康大鼠腎組織中的8倍,且隨著水平升高會導致腎小管細胞凋亡加重,采用miR-214抑制劑后腎小管細胞凋亡可得到相應緩解。腎損傷發生后腎組織的修復和再生依賴促炎、抗炎細胞群的相互平衡作用,因此,腎功能恢復與T淋巴細胞的功能狀態密切相關,T淋巴細胞的新生與凋亡在正常人體中處于動態平衡狀態,以維持正常的免疫功能,但患病后該平衡可能被打破,導致了機體免疫功能低下,對內毒素等抗原的處理能力減弱,加速病情進展,增加感染發生概率,導致多臟器功能衰竭[19]。腎間質纖維化導致腎小球上皮細胞在缺氧損傷過程中釋放出大量炎癥趨化因子,造成機體炎癥狀態,CRP水平在機體發生急性損傷時快速上升,能夠較為敏感地反映組織損傷程度,IL-18是作用最強的中性粒細胞趨化因子之一,其可通過增加炎癥因子表達誘導內皮細胞產生不同種類的活性物質,是導致機體損傷的重要炎性遞質,CRP、IL-18水平上升意味著腎損傷病情進展[20]。

綜上所述,急診有機磷中毒患者miR-214、CRP、IL-18表達量升高、CD3+、CD8+表達量降低有助于疾病的早期判斷,在預測早期腎損傷的發生風險中具有較高的臨床價值,為臨床治療提供了參考,早期應注意毒物的清除,同時也應注意免疫功能的調節與改善,以提高患者的治愈率。但本研究納入樣本量較小,結果可能無法全面反映臨床真實情況,尚需開展大規模、多中心的研究來證實該結論。