炎性細胞因子對肺血管內皮細胞與肺成纖維細胞三維立體培養基質金屬蛋白酶2的影響

李超然,閆 蕾,王 惠,王學鍔,蘆 莎,謝琳霞,王 青,朱運奎,于 軍,Ronald F Ertl(美國)

(1.西安國際醫學中心醫院呼吸與危重癥醫學三科,陜西 西安 710100;2.西安國際醫學中心醫院臨床實驗中心,陜西 西安 710100;3.美國內布拉斯加州大學醫學中心重癥醫學部,內布拉斯加州 奧馬哈 72662)

新型冠狀病毒(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)感染引起的重癥型肺炎,發病機理是機體免疫系統在病毒入侵后被激活,釋放多種炎性細胞因子,引發細胞因子風暴(Cytokine storm),造成內皮細胞、上皮細胞及細胞間質損傷,毛細血管滲漏,繼而發生肺水腫,呼吸衰竭[1-6]。在諸多的細胞因子中,目前已知白細胞介素-6(Interleukin6,IL-6),腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α),白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β),γ干擾素(γInterferon,INFγ) 等是最主要的炎性介質[1-5]。中性粒細胞彈性蛋白酶(Neutrophil elastase,NE)也參與了肺損傷[ 7]。但細胞因子損傷機制仍不完全清楚。肺泡間質是維持肺泡結構完整和功能正常的重要成分,因此細胞因子損傷肺組織的可能機理脂之一,是通過誘導基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase system,MMPs)直接參與肺泡組織細胞外基質降解[8-11],從而損傷肺泡組織。MMPs在TNF-α,IL-1β等炎癥因子刺激下大量產生,直接作用于肺間質,降解基質,破壞血管內皮和肺泡上皮的完整性,通透性增加,血管內液體滲出至組織間隙以及肺泡內,造成肺泡和間質水腫,這是ARDS的病理基礎[12-14]。臨床觀察到,重癥COVID-19肺部感染后,常繼發肺纖維化,其原因為修復過程中組織不適當的重塑所致。在組織修復重塑過程中,MMPs作用至關重要[13]。本研究旨在建立肺血管內皮細胞(Human pulmonary mircovascular endothelia cells,HPMEC )-肺成纖維細胞(Human fetal lung fibroblasts,HFL)-Ⅰ型膠原組成的三維立體(Three dimentional culture,3D)培養模型,模擬肺泡血管內皮和間質層結構,以IL-6、IL-1β、TNF-α和中性粒細胞彈性蛋白酶(Neutrophil ealtase, NE)分別進行刺激后,觀察組織細胞MMP2分泌變化,觀察哪些細胞因子可以誘導MMP2產生,從而探討細胞因子誘導MMPs肺損傷機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 細胞培養液DMEM和 DMEM/F12購自gibco(中國上海公司);鼠尾Type I Collagen 購自Discovery Lab ware公司; TNF-α 購自Gibco(中國上海公司);IL-6,IL-1β,購自Thermofisher (中國上海公司);NE購自 Bivision USA(中國上海公司)。HFL購自BNCC(中國上海細胞),HPMEC購自BNCC(中國上海細胞)。得到原代培養細胞后進行傳代培養,用第4～8代細胞進行三維立體培養。所有細胞培養材料購自NEST(西安博達公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 HFL和HPMEC三維立體混合培養模型:培養細胞用胰酶消化后移除含血清培養基,加入無血清培養基DMEM/F12,細胞稀釋成為5×105/ml細胞懸液8 ml,在冰盒低溫條件下進行操作。依次按比例1∶20∶5加入0.1mol/L NaOH 0.08 ml,5%Ⅰ型膠原1.52 ml,5×DMEM 0.4 ml, 混勻,最終使DMEM為×1濃度,pH為7.4,最后加入含HFL的無血清DMEM細胞混懸液8 ml,使膠原濃度為0.75 g/ml,使細胞濃度為4×105/ml?；靹蚝笠悦靠?.5 ml含HFL的膠原溶液分配至24孔培養板內,放置于37 ℃培養箱內30 min,三維立體半固體膠原形成。于膠原孔上面內加入含HPMEC的無血清DMEM混懸液(細胞濃度為4×105/ml)1 ml。待內皮細胞完全貼附于立體膠原上面后,培養液中加入不同細胞因子(TNF-α 20 ng/ml,IL-1β10 ng/ml,IL-6 20 ng/ml,或NE 2 ng/ml),放置在37 ℃培養箱內(5% CO2)進行培養。每天觀察細胞在膠原內生長狀況,3 d后,收集培養上清液,備明膠酶譜檢測用。

1.2.2 明膠酶譜法制備:用明膠溶液制成3%明膠凝膠膜,標本槽內加入25 μl上述標本/緩沖液,在120 V電壓下電泳約3 h,取出凝膠,以2.5% Triton ×100進行脫洗,然后加入含鋅、鈣的孵育液,搖床內37 ℃放置12 h過夜。用考馬斯亮藍進行染色和脫色,取得理想條帶凝膠,照相分析。

2 結 果

2.1 3D培養下HFL和HPMEC的形態變化 三維立體培養條件下,HFL單獨或混合培養條件下,生長在膠原內以三維方向伸開,呈條索狀、網狀(圖1A、C);HPMEC在膠原面上生長,基底部植于膠原基質,上部暴露于培養液,鏡下觀察到HPMEC呈橢圓狀伸展于膠原內,趨于形成環狀,生長良好且有明顯增殖(圖1B、D)。混合3D培養時,可以看到HFL和HPMEC共存的狀態(圖1C、D)。

注:A為三維立體混合培養中HFL位于膠原內,呈條索狀,三維分布呈網狀結構; B為三維立體培養中HPMEC,胞體較短嵌于膠原,呈環狀分布;C為HFL和HPMEC混合三維立體培養中的HFL,通過變焦觀察表面和深部細胞狀態,HFL的基本形態和單獨培養時相似,混合培養時與血管內皮細胞交織共存;D為混合3D培養時的HPMEC呈現良好生長狀態,較起初時細胞密度增加,也呈環狀分布,表層也可看到成纖維細胞,深層則以成纖維細胞為主,血管內皮細胞不向膠原深部生長圖1 HFL、HPMEC單獨或混合3D培養細胞形態

2.2 兩種不同細胞單獨或混合3D培養時MMP2變化 HPMEC與Ⅰ型膠原 3D培養,細胞數為4×105/ml。培養液為無血清DMEM,3 d后收集培養液,制備明膠酶譜檢測MMP2,結果顯示,單獨HPMEC 3D培養時MMP2的分泌量極少(圖2)。HFL與Ⅰ型膠原3D培養,細胞數為4×105/ml。培養液為無血清DMEM,3 d后收集培養液,制備明膠酶譜檢測MMP2。結果顯示,HFL單獨3D培養中,能分泌較多的MMP2(圖3)。HPMEC/HFL以不同細胞濃度組合進行3D混合培養,+表示該細胞為常規數量4×105/ml,1/4、1/2, 2×,4×表示該細胞數量為常規的倍數;培養液為無血清DMEM,3 d后收集培養液,制備明膠酶譜檢測MMP2。結果顯示,HPMEC數量不變,隨著HFL數量的增加,MMP2的分泌量相應增加(圖4)。HFL數量不變,HPMEC數量增加,MMP2的產量沒有明顯變化(圖4)。以上實驗證明,在混合3D培養條件下,MMP2主要由HFL產生,HPMEC只產生極微量MMP2。

注:M為標準分子蛋白標記 ;72 kDa 為MMP2圖2 單獨HPMEC 3D培養時MMP2的表達

注:M為標準分子蛋白標記;72 kDa 為MMP2; 82 kDa 為MMP2 前體圖3 單獨HFL3D培養時MMP2的表達及其細胞因子對MMP2的影響

注:M為分子量蛋白標準;72 kDa為MMP2圖4 HPMEC/HFL混合3D培養不同細胞數時MMP2的表達

2.3 細胞因子對MMP2的影響 單獨HFL 3D培養時,可以產生一定量的MMP2,TNF-α,IL-1β可以誘導HFL產生更多MMP2,條帶明顯增加,但IL-6促進HFL產生MMP2的作用不明顯(圖3)。NE具有較強的誘導MMP2產生的作用,條帶明顯增寬(圖3);如果聯合TNF-α或IL-1β,誘導產生更多MMP2,3種細胞因子與NE聯合均明顯增寬MMP2的條帶(圖3)。但在單獨HPMEC 3D培養時,各種細胞因子均不能誘導產生更多的MMP2(圖2)。HPMEC/HFL(4×105/ml)進行3D混合培養,在無血清DMEM培養液中分別加入TNF-α(10 ng/ml)、IL-1β(5 ng/ml)、NE(2 μmol),然后在3種炎性因子刺激的基礎上再加入IL-6(20 ng/ml),3 d后收集培養液,制備明膠酶譜檢測MMP2,結果顯示,IL-1β、TNF-ɑ、NE 均可誘導MMP2的產生,IL-6則無明顯誘導增強作用(圖5),即使加倍劑量亦不能(圖6)。若先加入TNF-α(10 ng/ml)、IL-1β(5 ng/ml)、IL-6(20 ng/ml),再將NE(2 μmol)加入已有其他炎性細胞因子的培養液中,結果顯示NE加入使MMP2得分泌量顯著增加,且與TNF-ɑ、IL-1β有協同作用(圖7)。試驗證明TNF-α、IL-1β、NE均可誘導HFL產生更多MMP2,尤其NE作用更為明顯,不同炎癥因子聯合作用時效果更佳,IL-6不具備誘導HFL產生MMP2的作用。

注:M為分子量蛋白標準;82 kDa為 MMP2前體;72 kDa為MMP2;54 kDa為MMP2活化部分圖5 不同細胞因子對HPMEC/HFL3D混合培養下MMP2表達的影響

注:M為分子量蛋白標準;72 kDa為MMP2圖6 不同濃度IL-6對HFL/HPMEC混合3D培養下MMP2表達的影響

注:M為分子量蛋白標準; 72 kDa為MMP2;82 kDa為MMP2 前體圖7 NE對HPMEC/HFL混合3D培養時MMP2表達的影響

2.4 NE對HPMEC/HFL混合3D培養時MMP2的影響 HPMEC/HFL混合3D培養,在不同條件下再加入NE,均可使MMP2條帶增寬,與TNF-α 和IL-1β共同刺激下能產生更多MMP2,且活化條帶增加,IL-6不增加MMP2,但NE與IL-6共同作用,MMP2條帶明顯增厚。表明NE可以誘導HFL 產生MMP2,也有促進其活化作用(圖7)。

3 討 論

本研究設計模擬肺泡毛細血管和間質結構,將肺微血管內皮細胞培養于肺成纖維細胞和Ⅰ型膠原三維立體培養膠上,形成微血管內皮細胞、成纖維細胞、基質膠原共同構成的3D模型,在不同細胞因子刺激下,觀察了MMP2的誘導與活化。通過單獨內皮細胞培養、內皮細胞和成纖維細胞呈比例增減的試驗,發現內皮細胞只能生成微量的MMP2,在細胞因子刺激下也不能誘導內皮細胞產生更多的MMP2,這可能與其結構功能相適應。在病理性損傷中,如果內皮附著的基質完好,損傷較輕也容易修復,如果基質部分被降解破壞,證明損傷嚴重,就會出現嚴重的毛細血管滲漏[6]。

本研究表明,在內皮細胞與成纖維細胞混合3D培養模型中,肺成纖維細胞是生成MMP2的主要組織細胞。這與其支撐維持基質結構和重塑功能相關。正常狀態下,成纖維細胞能產生一定量的MMP2,用于維持基質成分的降解更新。當遇到細胞因子風暴后, 在TNF-α,IL-1β等細胞因子刺激下,產生大量的MMP2,同時還會誘導產生過量的其他MMPs,降解更多的基質成分[8-13], 尤其是支撐毛細血管壁的基質膠原成分,進而加重附著在基質的內皮和上皮細胞損傷,發生急性肺損傷、肺泡水腫、急性呼吸窘迫綜合征(ADRS)[12-14]。肺成纖維細胞參與炎性細胞因子肺損傷的作用需要高度重視和進一步研究。

采用盲腸結扎壞死誘導的膿毒癥模型中發現,IL-6、IL-10、TNF-α,MCP-1 等細胞因子顯著升高,參與急性肺損傷[15]。細胞因子風暴在各種急性嚴重感染所致的膿毒癥病理過程中,參與組織損傷、引起器官功能障礙和衰竭,是致病的關鍵因子。但是,細胞因子是如何損傷組織和細胞的機理極為復雜,不同細胞因子作用途徑不同,細胞因子之間也有協同或抑制的機制?；|金屬蛋白酶損傷機理是直接降解維持組織結構完整的基質成分,從而造成組織破壞損傷[12]。本研究探討了細胞因子風暴中,哪種細胞因子可誘導MMP2。結果證明TNF-α、IL-1β是誘導MMP2最主要的細胞因子,與以前作者的研究以及文獻報告一致[16],TNF-α、IL-1β可以誘導肺成纖維細胞和支氣管平滑肌細胞產生大量MMP1,2,3,9,導致三維立體培養的膠原大量降解。如果這種情況出現在肺泡,肺泡基質被降解,通透性增加,肺泡會發生嚴重損傷。在臨床,IL-1β和TNF-α并沒有得到高度重視,不是常規檢測因子,也沒有列為重癥肺炎檢測的預警指標。在新冠病毒感染和膿毒癥臨床研究中發現,IL-6是重要的促炎因子,是多效性細胞因子,可能通過促進漿細胞存活、促炎性T淋巴細胞的分化和激活,分泌更多的TNF-α、IL-1β,在MODS病理生理學中發揮多重作用[17]。IL-6可激活T細胞,大量產生更多炎性細胞因子,從而形成炎癥風暴,導致嚴重肺部和其他器官的免疫損傷[3-4]。本研究證明,IL-6不能直接誘導成纖維細胞產生MMP2,其對MMP2的作用可能是通過誘導T細胞產生TNF-α和IL-1β從而誘導MMPS間接損傷肺泡組織。與IL-6不同,炎性細胞因子IL-1β、TNF-α可以直接上調成纖維細胞MMP2表達,導致基底膜膠原和細胞外基質的降解,引發組織通透性滲出、水腫,在這一病理機制中占主導作用。

繼發于新冠病毒感染的肺纖維化發病率高達44.9%[17-18],比特發纖維化的發病率還要高,因為新冠病毒感染人口基數巨大,發生纖維化的絕對數也多,值得高度重視和深入研究。臨床觀察到細胞因子風暴的強弱與新冠肺炎疾病嚴重程度相關,而新冠肺炎病情嚴重程度與繼發纖維化相關,病情越重,纖維化發生率越高,纖維化程度也越嚴重[19-20]。研究也表明,肺纖維化與MMPs活性直接相關[18]。在炎癥期,MMPs主要降解基質。在損傷修復期,MMPs參與組織重塑,如果重塑失控,就會導致纖維化。纖維化的肺組織內膠原沉積增厚,成纖維細胞增值,膠原濃度增加,肺泡組織收縮變小,間隔變厚,彈性變差,影響氣體交換,出現低氧血癥和呼吸衰竭。臨床觀察到,繼發于新冠肺炎的間質性肺纖維化有部分可逆性,說明重塑功能正常時,組織結構可以進行重構,重構過程首先需要把過多、過厚的纖維基質降解,然后重新構建肺泡組織。降解過程主要依賴于基質金屬蛋白酶的產量和活性。所以在肺纖維化病理過程中基質金屬蛋白酶的作用至關重要。基質金屬蛋白酶是一個龐大的家族,約有二十余種不同結構的MMPs,不同MMPs的作用機制基本相同,降解基質成分。但不同MMPs,針對的降解成分有所不同,MMP2主要是降解基質中最重要的成分-膠原,其活性在許多疾病中起重要作用。

本研究建立的HFL與HPMEC在Ⅰ型膠原三維立體培養體外模型,模擬細胞因子損傷時MMP2的產生細胞來源主要是HFL、HPMEC產生的MMP2量很少,對細胞因子誘導反應也不強,表明組織損傷時產生的MMP2主要來自間質細胞?；|組織的成分的合成與降解主要由成纖維細胞分泌的MMPS調控。風暴細胞因子中IL-6的作用通過調控其他炎性介質損傷肺組織,因為它是最早由炎細胞產生的促炎因子。

本研究通過HFL與MPEC 3D培養模型證實,作為細胞因子風暴的重要成分,TNF-α、IL-1β及NE能誘導組織細胞HFL分泌更多的MMP2,在此模型IL-6不誘導HFL分泌MMP2,其損傷機制可能是通過誘導IL-1β、TNF-α參與肺泡組織基質的降解損傷,HPMEC不能被細胞因子誘導產生更多MMP2。MMPs既是急性肺損傷形成的基礎,又是形成肺間質纖維化的關鍵組織蛋白酶。

在新冠病毒感染的重癥患者,繼發肺纖維化發生率明顯高于其他原因引起的肺炎,其機理尚不清除,MMPs可能起關鍵作用[17-20]。因此研究有關MMPs的肺損傷和肺纖維化機制具有重要要義。細胞因子風暴包含了多種炎性細胞產生的多種炎性介質,在它們的共同作用下引起肺損傷和ARDS,網絡型細胞因子調控損傷機理極為復雜,MMPS也受多重因素的調控,本研究只選擇了IL-1β、TNF-α、IL-6、NE等幾種最常見的炎性介質,也只選擇了MMP2一種代表性MMPs,需要進一步擴大深入研究。