簡單芽孢桿菌P10 菌株對馬鈴薯晚疫病菌的防控作用

張翠綿，賈楠，彭杰麗，馬佳，胡棟，王旭，王占武

（河北省農林科學院農業資源環境研究所/河北省肥料技術創新中心，河北 石家莊 050051）

馬鈴薯糧菜兼用，已成為我國第三大種植作物。近年來，馬鈴薯的種植面積和產量均呈逐年增加趨勢[1，2]，其深加工產品和副產品廣泛應用于造紙、醫藥、化工等多個領域，具有較高的經濟價值。由致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的馬鈴薯晚疫病已成為世界第一大作物病害，防治困難[3]。生產上除選用抗病品種外，主要采用化學防治[4]。而不合理使用化學農藥易造成農藥殘留和環境污染，長期使用還會產生抗藥性，導致防效降低[5，6]。利用植物益生菌進行生物防治可以有效克服化學防治的上述缺點，已受到我國學者的高度重視[7]。前人利用芽孢桿菌（Bacillus spp.）及其代謝產物進行馬鈴薯晚疫病（potato late blight）防控已有較多研究。李雙東等[8]研究發現，枯草芽孢桿菌（Botrytis cinerea）EB-28 對盆栽馬鈴薯晚疫病的防效為74.22%。和鳳美等[9]發現，解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens） B9601 對早期的馬鈴薯晚疫病具有較好防效。張笑宇等[10]研究報道，地衣芽孢桿菌（B.licheniformis） 對馬鈴薯晚疫病也具有較好防效。王翠翠等[11]報道，拮抗細菌S34-1 對馬鈴薯晚疫病菌菌絲生長具有較強的抑制作用。年洪娟等[12]發現，熒光假單胞桿菌（Pseudomonas fluorescens） 對疫霉屬（Phytophthora）等引起的植物病害具有較強的防控作用。但截至目前，利用簡單芽孢桿菌（B.simplex）防控馬鈴薯晚疫病的研究鮮有報道。簡單芽孢桿菌P10 菌株由河北省農林科學院資源環境研究所微生物工程研究室分離鑒定，前期研究表明，該菌株功能多樣、作用廣譜，可顯著提高小麥和玉米的耐鹽性，并具有促生、溶磷、固氮等特性，對鐮刀菌、絲核菌和腐霉菌等均具有抑制作用[13]。為了從理論上明確P10 菌株菌劑的防病機制，利用P10 菌株進行馬鈴薯晚疫病防治研究，旨為該菌株進一步的應用研究和生防產品開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 參試馬鈴薯品種為冀張薯12 號。在聚乙烯塑料盆（32 cm×27 cm）內裝土2 kg，調節土壤含水量至2%，然后點種馬鈴薯塊種1 粒/盆，在日光溫室內培養至出苗后30 d，備用。

1.1.2 菌株 簡單芽孢桿菌P10 菌株由河北省農林科學院資源環境研究所微生物工程研究室分離鑒定，并提供；馬鈴薯晚疫病菌菌株由河北省農林科學院植物保護研究所提供。

P10 菌株發酵菌液和無菌濾液的制備。挑取已活化的P10 菌株，接入事先置入三角瓶的液體培養基（裝液量100 mL/瓶）中，在30 ℃下180 r/min 振蕩培養24 h；按照5%的接種量將種子液接到滅菌的細菌培養液中，在30 ℃下180 r/min 振蕩培養24 h，制成P10 菌株發酵菌液。將發酵液在4 ℃下5 000 r/min 離心20 min，沉淀（菌體）經無菌水重懸浮，并稀釋至與原發酵液等體積的菌液，制成P10 活菌體；上清液于無菌條件下經0.22 μm 微孔濾膜過濾，得到無菌濾液，保存備用。

馬鈴薯晚疫病菌孢子囊懸液的制備。參照宋風平等[14]方法進行制備。用接種環在已長好的馬鈴薯晚疫病菌落上輕刮，并用細菌液體培養基多次沖洗，吸出孢子囊懸液，調至濃度為104個/mL，備用。

1.1.3 培養基 P10 菌株培養基為PDA 培養基，成分為馬鈴薯200.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L 和瓊脂18.0 g/L，pH值自然。馬鈴薯晚疫病菌培養基為RTA 培養基，成分為黑麥60.0 g/L、蔗糖15.0 g/L、胡蘿卜汁60.0 mL/L和瓊脂18.0 g/L。發酵培養液為NB 培養基，成分為牛肉浸膏3.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L 和氯化鈉5.0 g/L，pH值自然。

1.1.4 儀器或設備 試驗用到的儀器或設備有PYXDHS 型電熱恒溫培養箱（上海一恒科技有限公司）、YX280A 型高壓蒸汽滅菌器（上海三申醫療儀器有限公司）、HCB-1300v 型垂直層流潔凈工作臺（青島海爾特種電器有限公司）、Primo Star 正直生物顯微鏡（上海無陌光學儀器有限公司）、ZWY-2102C 恒溫培養振蕩器（上海智誠分析儀器制造公司） 和三角瓶（規格250 mL）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 P10 菌株對馬鈴薯晚疫病致病疫霉的抑制效果

1.2.1.1 對致病疫霉菌絲生長的影響。采用平皿對峙培養法[15]，測定P10 菌株活菌體對致病疫霉（P.infestans）的抑制活性；采用打孔法[16]，測定P10 菌株發酵菌液和無菌濾液對致病疫霉的抑制活性。20 ℃暗培養5 d，觀察P10 菌株的抑菌作用，測量抑菌圈寬度。以只接病原菌的平皿為對照（CK）。每處理均3 次重復。計算抑菌率：

抑菌率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%

1.2.1.2 對致病疫霉菌絲體形態的影響。測量抑菌圈寬度后，挑取距P10 菌株活菌體、發酵菌液和無菌濾液最近處的致病疫霉菌落邊緣的菌絲以及對照菌落邊緣的菌絲，在顯微鏡10×40 倍視野下觀察菌絲形態的變化。

1.2.2 P10 菌株對馬鈴薯晚疫病的防治效果

1.2.2.1 對離體葉片侵染的抑制作用。選擇出苗后20 d、長勢一致的盆栽薯苗，參照胡同樂等[17]方法，設噴清水（處理Ⅰ，CK）、噴P10 菌株發酵菌液（處理Ⅱ）、噴P10 菌株無菌濾液（處理Ⅲ）3 個處理，噴施量均為25 mL/株，每處理均5 次重復。24 h 后，采集各處理相同部位的葉片，噴濃度為104個/mL 的馬鈴薯晚疫病菌孢子囊懸液后置于鋪有滅菌濕濾紙的平皿中，20 ℃培養，3 d 后統計發病葉片數量，并參照GB/T 17980.30—2000[18]進行病情分級。計算病情指數和防病效果：

病情指數=［Σ（病級數×該病級的葉片數）/（調查總葉片數×最高病級數）］×100

防病效果=（對照病情指數-處理病情指數）/對照病情指數×100%

1.2.2.2 對盆栽馬鈴薯晚疫病的防治效果。參照王文麗等[19]方法，在溫室（溫度20 ℃左右、空氣相對濕度90%）內進行試驗。選取苗齡30 d、生長健壯的盆栽馬鈴薯苗，調查葉片數后進行試驗處理。P10 菌株病害預防處理4 個，分別是接種病菌前12 h 噴1 次P10菌株發酵菌液，接種病菌前12 h 噴1 次P10 菌株無菌濾液，接種病菌前12 h 和接種病菌后12 h 各噴1 次P10 菌株發酵菌液，接種病菌前12 h 和接種病菌后12 h 各噴1 次P10 菌株無菌濾液；P10 菌株病害治療處理2 個，分別是接種病菌后12 h 噴1 次P10 菌株發酵菌液，接種病菌后12 h 噴1 次P10 菌株無菌濾液；以噴清水為對照（CK）。P10 菌株發酵菌液、無菌濾液和清水的噴施量均為25 mL/株；馬鈴薯晚疫病菌孢子囊懸液的噴施量為10 mL/株。處理后第5 天時統計發病葉片數，計算發病率、病情指數和防病效果。

1.3 數據處理與分析

采用Microsoft Excel、DPS 9.5 軟件對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 P10 菌株對馬鈴薯晚疫病致病疫霉的抑制效果

2.1.1 對致病疫霉菌絲生長的影響 P10 菌株發酵菌液對致病疫霉菌絲生長的抑制作用最強，抑菌帶寬度為6.11 mm 且顯著＞其他處理，抑菌率達到77.8%；活菌體對致病疫霉菌絲生長的抑制作用次之，抑菌率為66.7%；無菌濾液對致病疫霉菌絲生長的抑制作用最弱，抑菌帶寬度為2.13 cm 且顯著＜其他處理，抑菌率為44.4%（表1 和圖1）。

圖1 P10 菌株不同處理下馬鈴薯晚疫病致病疫霉菌絲的生長狀況Fig.1 Growth status of P. infestans hypha under different treatments with P10 strain

表1 P10 菌株對馬鈴薯晚疫病致病疫霉菌絲生長的抑制效果Table 1 Inhibition effect of P10 strain on the growth ofP. infestans causing potato late blight

2.1.2 對致病疫霉菌絲體形態的影響 顯微鏡下觀察發現，對照致病疫霉的菌絲光滑、粗細一致、內含物分布均勻（圖2a），不正常的菌絲較少；而受P10 菌株抑制的菌絲呈現不同程度的畸變，表現為扭曲變形、粗細不一（圖2b、c、d），局部膨脹（圖2e），內含物分布不均（圖2f）等。

2.2 P10 菌株對馬鈴薯晚疫病的防治效果

2.2.1 對離體葉片侵染的抑制作用 馬鈴薯離體葉片噴施P10 菌株發酵菌液和無菌濾液24 h 后再接種馬鈴薯晚疫病菌孢子囊懸液，病情指數分別為30.1 和35.6，二者差異顯著，且均顯著＜CK；防治效果分別為57.2%和49.4%（表2）。表明P10 菌株發酵菌液和無菌濾液均對馬鈴薯晚疫病具有一定的防治效果，其中發酵菌液的效果優于無菌濾液。

表2 P10 菌株對晚疫病菌侵染離體葉片的抑制作用Table 2 Inhibition effect of P10 strain on in vitro leavesinfection by P. infestans

2.2.2 對盆栽馬鈴薯晚疫病的防治效果 在接種晚疫病菌孢子囊懸液前12 h 噴施P10 菌株發酵菌液以及接種病菌前后各噴施1 次P10 菌株發酵菌液的防效較高，分別為73.9%和71.5%；接種病菌后再噴施P10菌株發酵菌液的治療效果為54.8%；接種病菌前噴施P10 菌株無菌濾液以及接種病菌前后各噴施1 次P10菌株無菌濾液的預防和治療效果分別為60.3%和57.9%（表3）。表明P10 菌株發酵菌液的預防效果好于治療效果，發酵菌液的效果優于無菌濾液。

表3 P10 菌株對盆栽馬鈴薯晚疫病的防效Table 3 Control effect of P10 strain against late blight of potted potato

3 結論與討論

3.1 簡單芽孢桿菌及P10 菌株對馬鈴薯晚疫病致病疫霉的抑制作用

目前對馬鈴薯晚疫病的防控，除培育推廣抗病品種、使用殺菌藥劑外，利用有益微生物進行生物防治成為熱點，涉及的生防菌株主要有枯草芽孢桿菌[20]、解淀粉芽孢桿菌[21]、鏈霉菌[22]、地衣芽孢桿菌[10]和哈茨木霉[23]等，而利用簡單芽孢桿菌防控馬鈴薯晚疫病的研究鮮有報道。馬鈴薯晚疫病菌由于既侵染馬鈴薯塊莖，又侵染植株的莖葉，存在先種傳、土傳再氣傳的侵染機制[24]，因此為害重，防治困難。這就對生防菌株提出了更高的要求，生防菌株不僅需要對疫霉菌菌絲、胞囊孢子釋放與萌發具有抑制作用，還需要具有生態位的競爭和誘導植物抗性等多種功能，如在土壤、根際和葉際等生態位上都能發揮作用將會更加理想。簡單芽孢桿菌就具有這方面的潛力。項鵬等[25]利用簡單芽孢桿菌菌株Sneb545 包衣處理大豆種子，通過拮抗和誘導抗性，有效地防控了大豆胞囊線蟲。孫廣正等[26]分離的簡單芽孢桿菌XX6，通過抑菌和促生機制，對小麥根腐病的抑制率達到62.3%。前期試驗發現，P10 菌株生物功能多樣、作用廣譜，不僅能有效防控番茄和黃瓜枯萎病，還能提高小麥和玉米耐鹽性，并顯著促進根系發育[13]。本研究以較難防控的馬鈴薯晚疫病為對象，通過對峙培養試驗發現，P10 菌株的活菌體、發酵菌液和無菌濾液均對馬鈴薯晚疫病致病疫霉的菌絲生長具有較強的抑制作用，其中發酵菌液的抑制效果優于無菌濾液。說明P10 菌株對馬鈴薯晚疫病致病疫霉的抑制存在營養競爭和代謝產物抑菌2 種機制，這為深入研究其代謝產物和抑菌機理指明了方向。

3.2 P10 菌株對馬鈴薯晚疫病的抗病效果

采用離體葉片侵染及溫室盆栽試驗發現，接種晚疫病病菌前噴施P10 菌株發酵菌液或無菌濾液均對馬鈴薯晚疫病具有較好的防控效果，而在接種病菌后再噴施則效果較差，且發酵菌液的效果優于無菌濾液。說明除抑菌產物外，P10 菌株活菌體也發揮了一定的作用，菌株通過生態位、營養競爭和產生抑菌物質等多種機制抑制了病菌的侵染。此外，試驗中還發現，噴施P10 菌株發酵菌液的葉片厚度有所增加，且葉色鮮亮，推測可能是P10 菌株與宿主互作，提高了宿主抗性，存在誘導抗性機制。P10 菌株具有良好的應用潛力，更廣泛地應用和作用機制研究正在進行中。