蘭花花器官及成花基因調(diào)控研究進(jìn)展

史梅容 舒文波 邱明萱 李林宴，，孫振元* 巨關(guān)升 李振堅(jiān)

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)研究所/國(guó)家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100091;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝林學(xué)學(xué)院/園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430070)

蘭花是蘭科(Orchidaceae)植物的總稱,有5個(gè)亞科(杓蘭亞科(Subfam.Cypripedioideae)、擬蘭亞科(Subfam.Apostasioideae)、樹蘭亞科(Subfam.Epidendroideae)、香莢蘭亞科(Subfam.Vanilloideae)和蘭亞科(Subfam.Orchidoideae))、800多個(gè)屬和28 000多個(gè)種,具有地生、腐生和附生3種生活型,是植物最大的開花家族之一,位列中國(guó)十大名花之一[1]。其中,蘭屬(CymbidiumSw.)、蝴蝶蘭屬(PhalaenopsisBlume)、文心蘭屬(Oncidiumhybridum)、卡特蘭屬(CattleyaLindl)、兜蘭屬(PaphiopedilumPfitz)、萬(wàn)代蘭屬(Vandacoerulescens)和石斛蘭屬(Dendrobium)已成為7 大商品化蘭花[2]。目前,蘭花商品化應(yīng)用的主要瓶頸是花器官的形成和花期的調(diào)控。所以,對(duì)蘭花花器官調(diào)控和開花過(guò)程進(jìn)行研究,對(duì)蘭花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展尤為重要。蘭花花器官有其獨(dú)特性,而開花過(guò)程可分為成花和花發(fā)育2個(gè)階段,每個(gè)階段都由相應(yīng)的基因調(diào)控[3]。雖然分子遺傳方法已使人們對(duì)模式植物(如擬南芥(Arabidopsisthaliana)和水稻(OryzasativaL.))中的花器官形成以及成花機(jī)制有所了解[4],但目前對(duì)蘭花成花的整體認(rèn)識(shí)仍不甚透徹。本研究重點(diǎn)研究了蘭花花器官調(diào)控以及成花的分子調(diào)控機(jī)制,并解析了蘭花成花轉(zhuǎn)錄組、基因組和已功能驗(yàn)證的相關(guān)基因,以期為蘭花開花研究提供重要的基礎(chǔ)信息,開辟新的研究策略和途徑。

1 蘭花花器官調(diào)控的分子機(jī)制

1.1 蘭花花器官特征

與其他開花植物相比,單子葉蘭花進(jìn)化出了壯觀的花形態(tài)特征,以適應(yīng)其特殊的授粉和適應(yīng)性繁殖策略[1]。長(zhǎng)期進(jìn)化中,蘭科植物形成了獨(dú)有的花被結(jié)構(gòu):由3個(gè)萼片(Sepal)、2個(gè)花瓣(Petal)、1個(gè)由花瓣特化成的唇瓣(Lip)以及合蕊柱(Gynostemium)組成(圖1(a))[1]。成花是植物的重要特征之一,其表達(dá)模式可以分為ABC或ABCDE模型,ABCDE 模型解釋了五類花同源異型基因的相互作用,以確定每個(gè)花器官的特性(圖1(b))[1]。蘭花與其他植物在ABCDE表達(dá)模式的基因相似,A和E類基因一起決定萼片,A、B和E類基因決定花瓣,B、C和E類基因共同決定雄蕊,而D和E類基因決定心皮[1,5]。

(a)蘭花花結(jié)構(gòu)側(cè)視圖(左)與俯視圖(右)的比較。(b)擬南芥花發(fā)育的ABCDE模型。AP1,無(wú)瓣花1;AP2,無(wú)瓣花2;AP3,無(wú)瓣花3;PI,雌蕊;AG,無(wú)性生殖;STK,種子儲(chǔ)備;SEP,SEPALLATA。(a) Comparison of side views (left) and top views (right) of the floral structures of orchid.(b) The ABCDE model of flower development in Arabidopsis.AP1,APETALA1;AP2,APETALA2;AP3,APETALA3;PI,PISTILLATA;AG,AGAMOUS;STK,SEEDSTICK;SEP,SEPALLATA.

1.2 蘭花花器官調(diào)控

對(duì)蘭花中高度特化的花結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,不僅揭示了參與花發(fā)育的基因,還揭示了ABCDE模型調(diào)控的復(fù)雜性[1]。ABCDE基因?qū)儆贛ADS-box轉(zhuǎn)錄因子家族的MIKCC基因,蘭花植物的成花是由MADS-box型轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)。目前,已在擬南芥花同源異型基因和其他物種的同源物中分離到各種蘭花(如蘭花屬、石斛屬、文心蘭屬和蝴蝶蘭屬)的MIKCC基因,一些功能亦得到了驗(yàn)證[4]。

1.2.1A和E類基因

A和E類基因?qū)儆贏P1/AGL9超家族[6]。A功能基因來(lái)自SQUA-like亞群,可分為FUL/AGL8-like和euAP1-like演化支。E功能基因來(lái)自包含AGL9-like和AGL2/3/4-like clades的SEP-like亞群。AGL6是SQUA-like和SEP-like亞群間的AP1/AGL9群[4]。研究發(fā)現(xiàn),蝴蝶蘭玫瑰(PhalaenopsisFormosaRose)的ORAP11和ORAP13基因在花芽早期高度表達(dá)[7],且過(guò)表達(dá)DOAP1的轉(zhuǎn)基因梳唇石斛(DendrobiumChaoPrayaSmile),表現(xiàn)出開花早、花序分生組織過(guò)早轉(zhuǎn)變?yōu)榛ǚ稚M織[1];但臺(tái)灣蝴蝶蘭(Phal.aphrodite)的PaAP1-1和PaAP1-2基因則在雌蕊和花粉發(fā)育中發(fā)揮作用,而PaAGL6-1基因在唇瓣表達(dá),PaAGL6-2在所有花器官中表達(dá)[8]。蝴蝶蘭雜種Athens的PhaMADS1和PhaMADS2基因在授粉前的子房中高表達(dá),而PhaMADS4、PhaMADS5和PhaMADS7皆在萼片、花瓣和唇瓣中表達(dá)[9];但石斛蘭(D.MadameTong-In)中的DOMADS2僅在花發(fā)育后期的花柱上表達(dá);文心蘭(OncidiumGower Ramsey)OMADS6、OMADS7和OMADS11基因在除雄蕊外的所有花器宮中均有表達(dá)[6],過(guò)表達(dá)OMADS6產(chǎn)生心皮狀萼片和雄蕊狀花瓣[1];黃花文心蘭的AP1同源基因OMADS10在成熟花的唇瓣和心皮中表達(dá),但過(guò)表達(dá)文心蘭OMADS1基因?qū)е禄ㄆ谔崆癧10];木石斛(D.crumenatumSw)的DcOAP2基因在所有花器官中都有表達(dá)[11];小扇葉蘭(Erycinapusilla)的AP1-like基因EpMADS10、EpMADS11和EpMADS12在所有花器官中皆弱表達(dá)[4]。另外,小蘭嶼蝴蝶蘭的PeSEP基因在所有花器官中都有表達(dá)[12],但石斛蘭(D.MadameTong-In)中DOMADS1和DOMADS3基因以及鴿石斛(D.crumenatum)中的DcOSEP1基因在花轉(zhuǎn)變過(guò)程中不斷被激活,并持續(xù)到成熟的花階段[13],且沉默蝴蝶蘭PeSEP3導(dǎo)致花被片轉(zhuǎn)化為葉狀組織[1]。

1.2.2B類基因

蘭花B類基因包含DEFICIENS(DEF)/APETALA3(AP3)-like和GLOBOSA(GLO)/PISTILLATA(PI)-like基因,且所有花器官都可檢測(cè)到B類基因[1]。對(duì)蘭科植物的B類基因進(jìn)行調(diào)查,發(fā)現(xiàn)11個(gè)物種具有4個(gè)AP3和2個(gè)PI同源基因[14]。臺(tái)灣蝴蝶蘭的PaAP3-1、PaAP3-2、PaAP3-3和PaAP3-4基因在萼片、花瓣和唇瓣/柱中表達(dá)[8];石斛的DcOAP3A和DcOPI基因在所有花器官中積累[13];意大利蘭(Orchisitalica)的OrcPI和OrcPI2基因在未成熟花芽的所有花器官中均表達(dá),而狐尾蘭(Rhynchostylisgigantea)中的RgPI在所有花器官表達(dá)[15];蝴蝶蘭雜種PhPI10基因僅在唇瓣表達(dá)[16];小蘭嶼蝴蝶蘭(Phal.equestris)的PeMADS4基因決定蝴蝶蘭的唇形[17];文心蘭的OMADS5基因負(fù)向調(diào)控唇瓣結(jié)構(gòu)[18];而春蘭(Cymbidiumgoeringii)花被的形成是通過(guò)A、B和E類基因的共表達(dá)[19]。

1.2.3C和D類基因

C和D類基因是由被子植物基因復(fù)制和多樣化事件產(chǎn)生的[1]。C和D類基因都屬于MADS-box基因的AG亞家族,在ABCDE模型中,C類基因?qū)τ谛廴锖托钠さ陌l(fā)育非常重要,而D類基因則是胚珠發(fā)育所必需[4]。小蘭嶼蝴蝶蘭的PeMADS1基因參與蕊柱的發(fā)育[20];蝴蝶蘭和雅典蝴蝶蘭(Phal.Athens)的C類和D類基因中的PhIAG1和PhIAG2,在唇瓣、蕊柱和胚珠中均有表達(dá),但PhaMADS8、PhaMADS9和PhaMADS10在蕊柱和子房中均有特異性表達(dá);木石斛(D.crumenatumSw)和球花石斛(D.thyrsiflorum)的DcOAG1表達(dá)于所有花器宮,DcOAG2僅在子房表達(dá),但DthyrAG1和DthyrAG2在授粉后的花序和胚珠中均有表達(dá)[13,21],且梳唇石斛C類基因DOAG1和D類基因DOEG2都參與了蕊柱的形成[22]。黃花文心蘭的OMADS4基因在雄蕊和心皮中表達(dá),但OMADS2基因的表達(dá)僅限于心皮的柱頭腔和子房[23];蘭屬CeMADS1基因只在柱中表達(dá),而CeMADS2基因在所有花器官中部有[24];桃紅蝴蝶蘭PeMADS1和PeMADS7與柱和胚珠發(fā)育有關(guān)[1]。

2 蘭花成花轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制

大多數(shù)蘭花需要數(shù)年時(shí)間才能完成幼年階段[4]。成花是由被稱為開花時(shí)間的基因啟動(dòng),該基因調(diào)節(jié)著營(yíng)養(yǎng)分生組織向花分生組織的轉(zhuǎn)化。然后,花分生組織相關(guān)基因調(diào)節(jié)花的形成。一旦成花開始,控制花中螺旋形成的基因就會(huì)表達(dá)。雖然在被子植物中出現(xiàn)了花形態(tài)的極端變異,但可以區(qū)分出4種相對(duì)簡(jiǎn)單的花器官,即萼片、花瓣、雄蕊和心皮[4]。在此,本研究從分子遺傳學(xué)的角度,綜述近年來(lái)蘭花成花和花發(fā)育的研究。

2.1 蘭花成花信號(hào)

中國(guó)野生蘭科植物約有208個(gè)屬1 761個(gè)種,包括特有種601種。中國(guó)蘭花主要分布在熱帶、亞熱帶以及長(zhǎng)江流域以南地區(qū)(包括華東、華南和西南)。世界蘭科有5大觀賞屬,中國(guó)有兜蘭屬、蝴蝶蘭屬、蘭屬和石斛屬4個(gè)屬,且2019年觀賞蘭花年產(chǎn)值占花卉總產(chǎn)值20%(中國(guó)花卉協(xié)會(huì)蘭花分會(huì)內(nèi)部資料)。蘭科植物花的同源異型突變頻率較高,這使其在花的形態(tài)、大小和顏色等特征上有著高度的差異[19,25]。2021年國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄(第二批)共列入國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生蘭科植物29種和8類。為保存豐富的蘭花資源,中國(guó)花卉協(xié)會(huì)批準(zhǔn)建設(shè)了10個(gè)國(guó)家級(jí)蘭花資源庫(kù)。其中,廣東農(nóng)科院環(huán)藝所已收集保存各類蘭花資源1 365份[26];福建農(nóng)林大學(xué)森林蘭苑保存瀕危蘭科植物1 200種及人工種質(zhì)資源3 000多份(中國(guó)花卉協(xié)會(huì)蘭花分會(huì)內(nèi)部資料)。這表明,蘭花存在多樣的棲息地。

蘭花多樣的生境表明蘭花可能已經(jīng)進(jìn)化出不同的開花策略,以應(yīng)對(duì)各種環(huán)境和發(fā)育條件(圖2)[1]。例如蘭花中都有明顯的全基因組復(fù)制(WGD)事件,可能與蘭花的多樣性有關(guān)。樹蘭亞科(Subfam.Epidendroideae)中的各種蘭花對(duì)不同的環(huán)境溫度和光照條件作出響應(yīng),從而誘導(dǎo)開花;低溫促進(jìn)蝴蝶蘭、春蘭和石斛的開花,而高溫促進(jìn)文心蘭屬和幾個(gè)石斛雜交品種的開花;同時(shí)短日照下,有助于五唇蘭(Phalpulcherrima)和米爾頓蘭(Miltoniopsisorchids)的開花,而短日照下扇蘭(Psygmorchispusilla)花峰值的誘導(dǎo)與日照長(zhǎng)度的增加呈正相關(guān)[1]。此外,也有研究表明,植物激素,如細(xì)胞分裂素(CTK)和脫落酸(ABA),對(duì)蘭花的花轉(zhuǎn)變有促進(jìn)作用[1]。相比生長(zhǎng)素抑制花尖的起始,赤霉素(GA3)對(duì)開花沒有影響,但可挽救高溫下花朵發(fā)育障礙[1]。這些結(jié)果表明,蘭花在決定開花時(shí),會(huì)對(duì)常見的外部和內(nèi)部信號(hào)作出反應(yīng)。

開花抑制子和啟動(dòng)子分別顯示在粉色和黃色框中,而環(huán)境和發(fā)育信號(hào)則顯示在基因上方。Flowering repressors and promoters are shown in pink and yellow boxes,respectively,while environmental and developmental signals are indicated above the genes.

2.2 蘭花成花的主要影響因子

在成花過(guò)程中,花期、環(huán)境溫度和光周期是決定蘭花起始和個(gè)體發(fā)育的關(guān)鍵。成花是開花植物生命周期的關(guān)鍵,這種從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變是發(fā)育狀態(tài)和多種環(huán)境累積的響應(yīng)[1]。植物開花由多種遺傳途徑組成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行調(diào)節(jié),包括光周期、春化、赤霉素、年齡、自主和熱感應(yīng)途徑[1]。目前,對(duì)蘭花成花的機(jī)制研究有限,而闡明蘭科植物的開花機(jī)制,將有助于蘭花育種及其商業(yè)化潛力[4]。在成花過(guò)程中,幼年期、環(huán)境溫度和光周期是決定蘭花始花和季節(jié)的關(guān)鍵因素[4]。目前,已發(fā)現(xiàn)6條受內(nèi)外信號(hào)調(diào)控開花的分子遺傳機(jī)制(環(huán)境溫度途徑、光周期途徑、春化途徑、赤霉素途徑、生物鐘途徑和自主途徑)(圖3),保證了不同環(huán)境下蘭花開花。當(dāng)前,在蘭科植物中,石斛屬植物花發(fā)育相關(guān)的研究較為完善[27]。由圖3可知,外部溫度變化、生物鐘和光周期導(dǎo)致石斛晝夜節(jié)律的變化;而后許多信號(hào)通路被激活,包括植物激素中的細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素和赤霉素;一些關(guān)鍵基因,如DnVRN1、DoSOC1、DoAP1、DnCOL和DnFT等,被發(fā)現(xiàn)與花發(fā)育相關(guān)。本研究主要從分子生物學(xué)的角度總結(jié)近年來(lái)蘭花成花的主要進(jìn)展。

圖3 石斛屬植物花發(fā)育相關(guān)的環(huán)境因子及基因[27]Fig.3 Environmental factors and genes related to flower development in Dendrobium[27]

2.2.1溫度對(duì)蘭花成花的影響

溫度是蘭花成花的關(guān)鍵因子,溫度水平以及晝夜溫差都會(huì)影響花芽分化與發(fā)育[3]。不同種類蘭花對(duì)環(huán)境溫度的要求不同[28],一些蘭花對(duì)溫度變化的開花反應(yīng)不同。如低溫促進(jìn)金釵石斛[29]、美堇蘭屬(Miltoniopsis)、蝴蝶蘭屬和軛瓣蘭屬(Zygopetalum)開花[4],而文心蘭屬[4]和一些石斛雜交品種[30]開花需高溫環(huán)境。另外,也發(fā)現(xiàn)一些與溫度相關(guān)的開花基因。在感應(yīng)低溫下,黑斑蝴蝶蘭FLOWERINGLOCUST1(PaFT1)基因被上調(diào)[31]。目前,對(duì)蝴蝶蘭低溫誘導(dǎo)花發(fā)育的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究較為完善(圖4),具體為低溫誘導(dǎo)PaFT1表達(dá),與PaFD相互作用,激活誘導(dǎo)成花所需的下游基因[4]。

圖4 低溫條件下臺(tái)灣蝴蝶蘭的開花調(diào)控Fig.4 Flowering regulation of Phal. formosa at low temperature

2.2.2光周期對(duì)蘭花成花的影響

光周期以信號(hào)方式向植物光受體(主要為光敏色素(Phytochromes)、向光素(Phototropin)和隱花色素(Cryptochrome)傳遞生物鐘變化,從而誘導(dǎo) CO 表達(dá),啟動(dòng)開花相關(guān)基因的表達(dá)[3]。研究發(fā)現(xiàn),不同種類的蘭花對(duì)光周期的要求也不同。如五唇蘭(Phal.pulcherrima)9 h光照比12 h光照能更有效地啟動(dòng)開花[32];扇蘭(Psygmorchispusilla)花的形成與白天時(shí)長(zhǎng)的增加呈正相關(guān)[33];美堇蘭在23 ℃短日照(SD)后轉(zhuǎn)移到低溫(11 ℃～14 ℃),有利于開花[30];但光周期對(duì)臺(tái)灣蝴蝶蘭開花沒有顯著影響[4]。另外,也發(fā)現(xiàn)一些與光周期相關(guān)的基因影響開花,如文心蘭中的開花啟動(dòng)子FT(OnFT)的表達(dá)受光周期的調(diào)控[34];霍山石斛DhPEBPs具有與FT/TFL1對(duì)立的調(diào)節(jié)開花的功能[35];鐵皮石斛DoSUTs在主要花器官的發(fā)育中起作用[4];朵麗蝶蘭雜交種的EARLYFLOWERING4-like4(DhEFL4)基因受光周期調(diào)節(jié)[36];蝴蝶蘭CO-like(Phalacol)的異位表達(dá),引起煙草早期開花表型[37]。

2.2.3植物激素對(duì)蘭花成花的影響

植物激素對(duì)蘭花開花也有影響[4]。植物激素對(duì)大花蕙蘭花的形態(tài)發(fā)生和發(fā)育起重要作用[38];蝴蝶蘭花發(fā)育需開花莖尖中維持最佳的GA[39];而6-芐基氨基嘌呤(BA)促進(jìn)了單軸蘭花(蝴蝶蘭)和合生蘭花(石斛蘭)的開花,且與赤霉素(GA)聯(lián)合使用,對(duì)開花也有促進(jìn)作用[40];在蝴蝶蘭和朵麗蝶蘭中,噴施BA可提前3～9 d產(chǎn)生花序[41];ABA 在蘭花的成花過(guò)程中發(fā)揮了抑制作用[42],且NAA也抑制蘭花花芽分化,延遲花期[3]。可見,植物激素對(duì)植物開花有顯著影響,但其效果差異較大。

2.3 蘭花成花功能基因組研究

目前,我國(guó)已經(jīng)開發(fā)出一些蘭花新品種,如通過(guò)野生資源的馴化篩選,中國(guó)已培育出蘭花品種596個(gè)[26];采用多倍體技術(shù),已在大花蕙蘭、石斛蘭和蝴蝶蘭等中獲得了多倍體植株[43];蘭花雜交育種也是獲得新品種的一個(gè)重要手段。從1854 年第一個(gè)在英國(guó)皇家園藝學(xué)會(huì)(Royal Horticultural Society(RHS))國(guó)際蘭花品種登錄委員會(huì)登錄的蘭花雜交種蝦脊蘭(Cal.furcata×Cal.masuca)開始,目前登記的蘭花雜交種已超過(guò)14萬(wàn)個(gè),主要包括石斛蘭、卡特蘭、萬(wàn)代蘭、兜蘭、蝴蝶蘭、蘭屬和文心蘭(表1)[44]。另外,通過(guò)生物技術(shù)也獲得了一些蘭花新品種,如白色文心蘭、黑色蝴蝶蘭和藍(lán)色蝴蝶蘭等。這些不同開花品種的獲得,為我們研究蘭花的開花分子機(jī)制,提供了豐富的材料。

表1 RHS注冊(cè)登錄的蘭科雜交品種Table 1 RHS registered Orchidaceae hybrid

2.3.1蘭花成花轉(zhuǎn)錄組研究

近年來(lái),蘭科多種植物利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù),在花器官、成花和花發(fā)育等轉(zhuǎn)錄組研究方面取得了很大的進(jìn)展。如中國(guó)臺(tái)灣成功大學(xué)熱帶植物研究所建立了OrchidBase3.0,收集到5個(gè)亞科的10種蘭花花器官轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[45],并對(duì)蝴蝶蘭[46]、卡特蘭雜交種KOVA[47]等的花部特征進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析,同時(shí)對(duì)建蘭[25,48-49]等的唇瓣和重瓣進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。在花啟動(dòng)方面,研究人員對(duì)蝴蝶蘭[31]等進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析;在低溫花誘導(dǎo)方面,研究人員對(duì)金釵石斛(D.nobileLindl.)和臺(tái)灣蝴蝶蘭[50-52]等進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析;在春化作用方面,研究人員對(duì)金釵石斛的春化腋芽[53]和石斛春化過(guò)程中的細(xì)胞分裂素(CTK)-赤霉素(GA)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)[51]等進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析;在花發(fā)育方面,對(duì)竹葉蘭(Arundinagraminifolia(D.Don)Hochr)[54]、大花蕙蘭、丹心蘭[55]和鐵皮石斛[5,56]等進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。最近,在大花惠蘭(Cymbidium)和文心蘭(Erycina)轉(zhuǎn)錄組分析中,發(fā)現(xiàn)了許多可能影響開花的基因[4]。

2.3.2蘭花成花基因組研究

蘭花基因組測(cè)序項(xiàng)目和其他先進(jìn)工具(如基因組編輯技術(shù))極大地促進(jìn)了蘭花花發(fā)育的分子生物學(xué)研究。蘭花基因組研究的一個(gè)關(guān)鍵里程碑是2015年蝴蝶蘭的測(cè)序。隨著更經(jīng)濟(jì)有效的測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展,蘭科植物中已有18個(gè)物種先后完成了高質(zhì)量參考基因組測(cè)序與組裝,主要包括蝴蝶蘭、小蘭嶼蝴蝶蘭、鐵皮石斛、深圳擬蘭、白花蝴蝶蘭、香莢蘭、建蘭、霍山石斛、鼓槌石斛、墨蘭、沉香虎頭蘭黃色素花×黃輝大花蕙蘭和金釵石斛等(表2)[57]。這些蘭花基因組序列的發(fā)布,為在全基因組范圍內(nèi)鑒定和比較具有潛在新功能的蘭花基因提供了巨大的機(jī)會(huì)。例如,在蘭花花發(fā)育調(diào)控中起關(guān)鍵作用的MADS-box基因[1],在小蘭嶼蝴蝶蘭和蝴蝶蘭的基因組中分別鑒定出51和56個(gè)。盡管這些蘭花基因組中的MADS-box基因總數(shù)遠(yuǎn)少于擬南芥(107個(gè)基因)和水稻(80個(gè)基因)的基因組,但蘭花中含有更多與花器官形成有關(guān)的MADS-box基因,這種差異意味著增加的MADS-box基因可能與蘭花高度特異多樣性的花形態(tài)特征有關(guān)。擬蘭亞科和其他亞科間MADS-box基因的數(shù)量不同進(jìn)一步支持了這一假設(shè)。

表2 蘭科已完成全基因組測(cè)序的種Table 2 Species of orchidaceae whose whole genome has been sequenced

2.3.3蘭花成花基因功能驗(yàn)證

近來(lái),蘭科基因功能鑒定技術(shù)也取得了飛速發(fā)展。與許多其他作物相似,蘭科首先使用基因槍法[58-59],將外源基因?qū)胩m花基因組;進(jìn)一步利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,將外源基因轉(zhuǎn)入蝴蝶蘭、石斛屬、大花蕙蘭和文心蘭等[60-61],并使用原球莖外植體將蝴蝶蘭的轉(zhuǎn)化過(guò)程縮短到8個(gè)月[60]。另外,建立了高效的墨蘭原生質(zhì)體分離及瞬時(shí)表達(dá)體系[62],將病毒誘導(dǎo)基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技術(shù)應(yīng)用于蘭科植物的基因功能驗(yàn)證[63]。隨著許多蘭花高質(zhì)量基因組序列的完成(表2),CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)已成功應(yīng)用于蝴蝶蘭、鐵皮石斛和霍山石斛[1]。

迄今為止,通過(guò)異源系統(tǒng)或同源系統(tǒng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化技術(shù),發(fā)現(xiàn)蘭花開花的特性高度保守(圖2)。例如,過(guò)表達(dá)FT-like基因(CymbidiumCgFT、DendrobiumDOFT/DnFT、OncidiumOnFT和PhalaenopsisPaFT1)、SOC1-like基因(DendrobiumDOSOC1/DnAGL19)、CO-like基因(CymbidiumCsCOL1/CeCOL和PhalaenopsisPaCOL1)和其他開花相關(guān)的同源基因(DendrobiumDcOAG1/DOAGL24/DOAP1/DOFTIP1、OncidiumOMADS2/OMADS4/OMADS6(OSEP3)/OMADS7(OAGL6-1)/OMADS10(OAP1)/OMADS11和PhalaenopsisPaFD/PeMADS7/PeSEP3)導(dǎo)致早花,而SVP-like基因(CymbidiumCgSVP2和DendrobiumDOSVP)、TFL1-like基因(DendrobiumDOTFL1和OncidiumOnTFL1)和其他基因(CymbidiumCgCOL和DoritaenopsisDhEFL2,3,4)的異位表達(dá),延遲了不同類型轉(zhuǎn)基因植物的開花[1,6,12-13,23,31,34,53,64-68]。有趣的是,與擬南芥中的對(duì)應(yīng)物一樣,蘭花中的FT和TFL1同源物以類似拮抗的方式調(diào)節(jié)開花(圖3)。

在石斛蘭中,DOFT的下調(diào)或上調(diào)分別延遲或加速開花,而DOTFL1影響蘭花開花的方式則相反[66],且DOFT1和DOTFL1的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在擬南芥中也相似。例如,過(guò)表達(dá)石斛DOFT則上調(diào)了DOsOC1和DOAP1,這與FT對(duì)擬南芥SOC1和APETALA1(AP1)的促進(jìn)作用相似。此外,2種蘭花MADS-box轉(zhuǎn)錄因子DOSOC1和DOAGL24相互作用,并與DOTFL1處的CArG-box基序結(jié)合,這意味著在擬南芥中表現(xiàn)出潛在的調(diào)節(jié)層次[1]。值得注意的是,蘭花開花基因可能已經(jīng)進(jìn)化出與不同蘭花物種獨(dú)特生理特征相關(guān)的其他新調(diào)節(jié)功能。一個(gè)典型的例子是開花期基因參與了假鱗莖的產(chǎn)生。假鱗莖是大多數(shù)附生蘭花基部加厚的莖,作為水、礦物質(zhì)和碳水化合物的儲(chǔ)存器官[1]。在石斛蘭中,假鱗莖的形成恰好發(fā)生在生殖發(fā)育的開始,并為隨后的花序和花發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)[1]。DOFT和DOTFL1對(duì)開花的拮抗作用分別與它們?cè)诖龠M(jìn)和抑制石斛假鱗莖中的相反作用密切相關(guān)[66],這表明這些開花時(shí)間基因可能有助于調(diào)節(jié)蘭花生殖發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)庫(kù)。

3 討論與展望

蘭科植物擁有多變的花朵結(jié)構(gòu)以及花期調(diào)控的重要性,故研究成花的分子機(jī)制意義突出。隨著轉(zhuǎn)錄組、基因組和代謝組等多組學(xué)時(shí)代的到來(lái),成花相關(guān)功能基因的挖掘?qū)⑹俏磥?lái)研究的熱點(diǎn)。盡管最近的一系列發(fā)現(xiàn)有助于我們理解蘭花成花機(jī)理,但由于蘭花營(yíng)養(yǎng)期較長(zhǎng)、遺傳轉(zhuǎn)化效率低下以及蘭花基因組有限等瓶頸,蘭花成花研究依然主要集中在模式植物中。這不可避免地限制了對(duì)蘭花這些特殊花器官和成花特性分子機(jī)制的解析。另外,由于誘導(dǎo)條件不同,不同蘭花的成花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能存在差異。目前,蘭科開花控制的遺傳機(jī)制研究還處于初步階段,主要存在如下問(wèn)題:1)蘭花花器官的基因調(diào)控研究,應(yīng)將花發(fā)育的所有相關(guān)基因的調(diào)控過(guò)程,與花形態(tài)相聯(lián)系進(jìn)行研究;2)成花的關(guān)鍵基因鑒定較少,應(yīng)深入研究基因表達(dá)模式的特異性和保守性。蘭科植物的開花研究已有了一些進(jìn)展。隨著多種蘭花品種高質(zhì)量基因組序列的完成,CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)已成功應(yīng)用于蝴蝶蘭、鐵皮石斛和霍山石斛[1]。因此,亟需在蘭花中建立高效、穩(wěn)定、普遍的遺傳轉(zhuǎn)化體系和基因編輯系統(tǒng)。后續(xù)新的功能基因及復(fù)雜的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的逐步發(fā)現(xiàn),將為蘭科植物花器官高度進(jìn)化的形態(tài)學(xué)發(fā)育提供分子基礎(chǔ),并有助于拓展人們對(duì)于植物開花分子調(diào)控的理解,對(duì)促進(jìn)蘭花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及其重要。