新型H3N3亞型禽流感病毒對雞致病性與傳播性研究

孫洪磊 佟 琪 余海莉 韓琪祺 李 涵 常昊宇 屈亞錦 徐 杰 劉思當 劉金華*

(1.中國農業大學 動物醫學院/農業農村部禽流感等家禽重大疾病防控重點實驗室,北京 100193;2.山東農業大學 動物科技學院,山東 泰安 271018)

禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)屬于正粘病毒科A型流感病毒屬,病毒基因組由8個單股負鏈RNA片段組成。當兩種流感病毒共感染同一宿主細胞時,可能發生病毒基因片段的交換,又稱基因重排,產生出新亞型或新基因型病毒,新型流感病毒對養禽業或人健康可能造成嚴重威脅。因此,及時發現新型流感病毒,開展病原流行病學調查及生物學特性研究,具有重要的現實意義。

H9N2亞型AIV是雞群中最常見的病毒,具有多個進化譜系,其中BJ/94譜系H9N2病毒是我國雞群中優勢流行的病毒譜系[1-2]。2010年之后,BJ/94譜系的G57基因型H9N2病毒在我國雞群中形成優勢流行[3],該基因型病毒不僅對雞的致病性增強,更為重要的是其可以作為基因供體為其他亞型流感病毒提供內部基因,產生出H7N9、H10N3、H10N8和H5N6等多種新型病毒[4]。2022年,我國雞群中出現新型H3N8 AIV,這種病毒是由水禽源H3基因、北美野鳥源N8基因以及H9N2病毒內部基因三源重排形成[5]。該新型病毒可在雞呼吸系統高水平復制,造成嚴重的病理損傷,并且由于雞群普遍缺乏針對H3亞型AIV的特異性抗體,這種新型病毒迅速在我國雞群中流行擴散[6-8],對養雞業造成了較大經濟損失。不同亞型低致病性AIV在我國雞群中的共流行,有可能進一步發生基因重排而產生新型病毒,所以,開展我國雞群AIV的病原學監測是科學防控禽流感的重要環節。

多年來,本研究團隊高度關注新型流感病毒的出現與流行演化相關研究。臨床調查發現,自2022年12月,在我國華東、華北、東北等地區發生產蛋下降的雞群中檢測出新型H3N3亞型AIV,經病毒全基因序列分析顯示,該病毒為H3N8病毒與H10N3病毒重排產生。為揭示新型H3N3病毒對雞的致病性與傳播性特征,本研究將分離毒株進行了SPF雞回歸試驗,并評價了病毒在SPF雞群間的空氣傳播性,以期為該病的科學防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 新型H3N3亞型病毒分離和鑒定

1.1.1病料采集及處理

2022—2023年對我國家禽養殖大省家禽養殖場開展AIV監測。對臨床表現呼吸道癥狀、產蛋下降等典型流感發病特征的發病雞采集口咽拭子,死亡雞剖檢取氣管、肺臟等組織樣品,置于含1 mL無菌PBS(含抗生素)的離心管中,低溫運送至中國農業大學農業農村部禽流感等家禽重大疾病防控重點實驗室進行病毒分離與鑒定。

1.1.2新型H3N3亞型病毒核酸鑒定

取口咽拭子重懸液或組織樣品研磨液200 μL,RNA提取試劑盒提取核酸,實時熒光定量RT-PCR方法分別檢測A型流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)和傳染性支氣管炎病毒(IBV)。

1.1.3新型H3N3亞型病毒分離鑒定

實時熒光定量RT-PCR檢測流感病毒核酸陽性樣品接種9日齡SPF雞胚,35 ℃孵育48 h,4 ℃過夜收取尿囊液,通過血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗檢測流感病毒的HA亞型;提取尿囊液RNA,以流感病毒通用引物unit12反轉錄為cDNA,霍夫曼引物進行病毒全基因組測序[9]。

1.1.4新型H3N3亞型病毒基因遺傳進化分析

將毒株全基因序列在GISAID數據庫進行Blast序列比對,將各基因片段參考相關序列,使用FastTree 2.1.11軟件繪制最大似然法基因進化樹,Shimodaira-Hasegawa (SH)方法計算分支支持值,設置1 000次重復。

1.2 新型H3N3亞型病毒對雞致病性和傳播性試驗

1.2.1試驗設計

1)SPF雞致病性試驗:每組4周齡SPF雞8只,將病毒以106EID50/0.2 mL劑量滴鼻感染,每日觀察臨床癥狀。感染后4 d剖檢3只接種雞,觀察剖檢變化,并取臟器進行病理組織學檢測和病毒滴度測定。感染雞于接種后1～14 d每天采集口咽拭子、泄殖腔拭子,進行病毒滴度測定。第14天采集雞血,HI試驗檢測血清轉陽情況。

2)SPF雞空氣傳播性試驗:每組4周齡SPF雞10只,將病毒以106EID50/0.2 mL的劑量滴鼻感染5只雞,24 h后將5只雞放入隔壁籠飼養,兩籠間隔30 cm,空氣氣流由攻毒組雞向空氣傳播組雞方向流動。每日觀察臨床癥狀,攻毒組、空氣傳播組雞于接種后1～16 d每天采集口咽拭子、泄殖腔拭子,進行病毒滴度測定。第21天采集雞血,HI試驗檢測血清轉陽情況。

1.2.2組織病理切片及免疫組化

取致病性試驗中剖檢的SPF雞鼻甲、氣管、肺臟等組織置于4%多聚甲醛溶液中固定,制作石蠟切片,進行HE染色和免疫組化染色。免疫組化一抗為A型流感病毒NP抗體。

1.2.3病毒載量測定

口咽拭子、泄殖腔拭子加入1 mL含抗生素的無菌PBS,渦旋振蕩后低速離心,取上清液進行10倍梯度稀釋備用。取致病性試驗中攻毒后4 d的SPF雞鼻甲、氣管、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、腦、十二指腸、胸腺、法氏囊和哈德氏腺,按照0.1 g/mL加入無菌PBS(含抗生素),組織勻漿機中充分研磨,低速離心,取上清液進行10倍梯度倍比稀釋,將樣品以0.2 mL/胚接種10日齡SPF雞胚,每個稀釋度接種3枚雞胚,接種后于35 ℃孵育48 h,4 ℃過夜后收取雞胚尿囊液測定血凝效價,按Reed-Muench法計算病毒滴度。

1.2.4統計分析

采用GraphPad Prism 9進行數據整理和作圖,數據間顯著性檢驗用SPSS Statistics 26.0進行分析。

2 結果與分析

2.1 新型H3N3亞型禽流感病毒的流行病學調查

自2022年12月,陸續在我國華東、華北、東北等地區商品蛋雞、肉種雞、蛋種雞等產蛋雞群發生以呼吸道癥狀、產蛋急性下降為典型發病特征的傳染性疾病。該病傳播迅速,同一養殖場內不同棟舍雞群一周以內均可發病。雞群發病率高,死亡率低,約死亡1%～5%,主要引起產蛋率急性下降。發病雞典型癥狀為眼結膜腫脹、張口呼吸,有呼吸啰音,產蛋率一周內急劇下降10%～40%,蛋殼質量差。剖檢可見眼瞼腫脹出血,鼻腔內有大量膿性分泌物,口腔黏膜潮紅,腭裂內有大量黏液,氣管彌漫性出血(圖1(a)),黏膜層附著大量黏液(圖1(b)),肺臟淤血實變(圖1(c))、細支氣管內有黃色纖維素性滲出(圖1(d)),卵泡充血、出血、液化、破裂,形成卵黃性腹膜炎(圖1(e)和(f)),輸卵管黏膜充血,有分泌物滲出。病程持續時間超過1個月,產蛋率恢復較慢,后期死淘比例與飼養管理及控制繼發感染密切相關。

(a)氣管彌漫性出血;(b) 氣管黏膜層附著大量黏液;(c) 肺臟淤血、實變;(d) 黃色干酪樣滲出物堵塞細支氣管;(e)(f) 卵泡充血、液化變形。(a) Trachea mucosa membrane bleeding;(b) Mucus in tracheal;(c) Pulmonary congestion;(d) Bronchioles blocked by exudate;(e) (f) Follicles congestion and rupture.

2.2 新型H3N3亞型病毒分離鑒定及基因遺傳進化分析

H3N3亞型病毒最早檢出時間為2022年12月,在華東地區發生產蛋下降的商品蛋雞群中檢出,隨后陸續在華北、東北等多個地區發病蛋雞檢測出。根據病毒分離時間、地點,選擇代表性毒株進行全基因測序,基因進化分析結果顯示:H3N3病毒的HA基因屬于歐亞禽分支,與2022年我國雞群中流行的H3N8病毒處于同一進化分支,與同分支H3N8病毒基因相似性為96.9%～99.3%(圖2);N3屬于歐亞禽分支,與我國華東地區雞群中流行的H10N3病毒處于同一進化分支,與同分支H10N3病毒基因相似性為96.9%～99.0%(圖2)。測序毒株的6個內部基因均來源于我國雞群中流行的G57基因型H9N2亞型病毒。所有H3N3病毒的HA裂解位點均為PEKQTR/GLF,無多堿性裂解位點插入。此研究表明,新型H3N8病毒在雞群流行中與H10N3、G57基因型H9N2病毒發生了基因重排,產生出新型H3N3亞型病毒。

本研究測序毒株標記為紅色,H3N8病毒標記為藍色,H10N3病毒標記為綠色,用于雞致病性和傳播性試驗的毒株標記星號。The H3N3 viruses isolated in the present study are indicated in red.H3N8 viruses are indicated in blue.H10N3 viruses are indicated in green.The viruses used in chicken experiment are marked with asterisk.

2.3 新型 H3N3病毒對SPF雞致病性

本研究選擇A/chicken/Eastern China/F1225/2022(EC/F1225)和A/chicken/Northern China/F2341/2023(NC/F2341)2株H3N3病毒進行SPF雞致病性試驗。結果顯示:在14 d試驗期內2株H3N3病毒感染雞均未出現死亡,表明H3N3病毒為低致病性AIV。但2株病毒感染雞均表現出明顯的臨床癥狀,如炸毛、縮頸、采食量下降等,部分雞出現眼睛腫脹、流淚、出血病變(圖3(a)和(b))。攻毒后4 d,每組取3只感染雞進行剖檢,可見雞眼結膜紅腫、哈德氏腺出血,鼻甲內有黏液滲出,氣管黏膜潮紅,有出血點及黏液分泌物(圖3(c)),肺臟淤血、出血,并有局灶性實變(圖3(d)),腎臟腫大,胸腺出血(圖3(e))、盲腸扁桃體腫脹出血(圖3(f))。病理組織學觀察可見眼結膜上皮細胞壞死脫落,黏膜下層血管充血,大量炎性細胞浸潤;鼻甲黏膜上皮細胞脫落,黏膜下層淋巴小結增生,大量炎性細胞浸潤,毛細血管擴張充血(圖4(a));氣管黏膜上皮細胞纖毛壞死脫落,黏膜下層炎性細胞浸潤,血管充血(圖4(c));肺臟充血、出血,大量炎性細胞浸潤,導致部分肺房實變(圖4(e))。免疫組化病原原位檢測可見鼻甲黏膜下層細胞(圖4(b))、氣管纖毛上皮細胞(圖4(d))和肺臟終末細支氣管上皮細胞(圖4(f))有大量流感病毒抗原陽性信號。

(a)(b)眼瞼腫脹;(c)氣管出血;(d)肺臟淤血,局灶性實變;(e)胸腺出血;(f)盲腸扁桃體腫脹、出血。(a) (b) Eyelid swelling;(c) Trachea mucosa membrane bleeding;(d) Pulmonary congestion;(e) Thymic hemorrhage;(f) Cecal tonsil hemorrhage.

左側為HE染色,右側為流感病毒免疫組化染色。(a)(e)放大倍數為200倍,(b)(c)(d)(f)放大倍數為400倍。(a)鼻甲黏膜下層炎性細胞浸潤;(b)鼻甲黏膜下層細胞陽性;(c)氣管上皮細胞壞死脫落;(d)氣管上皮細胞陽性;(e)肺臟實變;(f)肺臟終末細支氣管上皮細胞陽性。Left is HE staining,and right is immunohistochemical (IHC) staining.Magnification of (a) (e) is 200×and (b) (c) (d) (f) is 400×.(a) Infiltration of inflammatory cells in submucosa of turbinate;(b) Extensive influenza viral NP distribution in the turbinate;(c) Necrosis of tracheal epithelial cells;(d) Extensive influenza viral NP distribution in the tracheal;(e) Severe interstitial pneumonia and bronchopneumonia;(f) Extensive influenza viral NP distribution in the lung epithelial cells.

臟器病毒分布及載量檢測結果顯示(圖5),2株H3N3病毒均可在雞的呼吸系統高效復制,其中鼻甲、氣管中的病毒滴度顯著高于肺臟中的病毒滴度(P<0.05),表明H3N3病毒更易在雞的上呼吸道復制。此外,哈德氏腺、胸腺、腦等肺外臟器也可檢測到病毒,說明H3N3病毒對雞具有廣泛的組織嗜性,可引起全身系統性感染。此結果表明,新型H3N3病毒可在雞呼吸系統高水平復制,引起雞呼吸系統嚴重病理損傷。

與X軸平行的虛線代表最低病毒檢出量。Dashed lines parallel to X axis indicate the lower limit of virus detection.

2.5 新型H3N3亞型流感病毒在SPF雞群中的空氣傳播性分析

流感病毒具備在動物群體間的空氣傳播能力是其能夠形成優勢流行的關鍵因素。本研究評價了H3N3亞型AIV在雞群中的空氣傳播能力,同時以2株H3N8病毒A/chicken/Henan/F0316/2022(HN/F0316)和A/chicken/Anhui/FE12/2022(AH/FE12)作為對照。結果顯示,2株H3N3病毒與2株H3N8病毒的排毒情況相似,2種病毒的攻毒組雞口咽拭子和泄殖腔拭子中均可檢測到排毒,口咽的排毒量顯著高于泄殖腔(P<0.05),排毒期最長為7 d,排毒高峰在2～5 d(圖6)。在21 d的試驗周期內,2株 H3N8病毒的空氣傳播組雞既未檢出排毒也沒有發生血清抗體轉陽,表明H3N8病毒不能在雞群中有效空氣傳播。值得注意的是,H3N3病毒EC/F1225在感染后7 d開始發生空氣傳播,第8天,2株H3N3病毒空氣傳播組的雞均出現排毒,排毒時間持續6～8 d,HI抗體檢測結果顯示2株H3N3病毒傳播組雞均為HI抗體陽性。此結果表明新型H3N3亞型病毒主要通過雞口腔排毒,且具備雞群間空氣傳播的能力,這可能導致其在雞群中快速流行擴散。

與X軸平行的虛線代表最低病毒檢出量,攻毒組與空氣傳播組雞樣品由與Y軸平行的虛線分隔。Dashed lines parallel to X axis indicate the lower limit of virus detection,dashed lines parallel to Y axis separate inoculated and airborne contact groups of each virus.

3 討 論

本研究通過對我國雞群疫病監測,發現一種新型H3N3病毒,該病毒為我國雞群中流行的H3N8病毒與H10N3病毒重排產生,內部基因來源于H9N2病毒。H3N3病毒可在雞呼吸系統高水平復制、排毒,引起呼吸系統病變,更為重要的是H3N3病毒具備在雞之間空氣傳播的能力,這種傳播能力的提升有可能促使H3N3病毒在雞群中快速擴散,形成流行。

基因重排是產生新型流感病毒的重要方式,2022年在我國發病雞群中發現了新型H3N8流感病毒,這種新型AIV為水禽源H3Ny病毒、野鳥源HxN8病毒與G57基因型H9N2病毒三源重排組成[5]。由于攜帶了H9N2病毒的6個內部基因,H3N8病毒可在雞呼吸系統有效復制、排毒,并引起感染雞臨床發病[6]。自出現后,H3N8病毒由南向北在雞群中快速流行散播,并與不同地區雞群中流行的H9N2病毒內部基因動態重排,產生出多種基因型病毒[5-8]。本研究中檢測到的H3N3病毒HA基因來源于H3N8病毒,NA基因來源于H10N3病毒,H10N3病毒主要在華東地區雞群中地方性流行[10],推測H3N8病毒在流行過程中與H10N3病毒在雞宿主中發生共感染,重排產生出新型H3N3病毒。由于我國雞群中存在H9N2、H10N3、H10N8和H7N9等多種亞型流感病毒流行,因此病毒之間相互重排產生出新基因型、新亞型病毒的幾率很大,需要高度關注出現的新型病毒。

本研究中檢測出的H3N3病毒多數來源于產蛋期蛋雞,推測可能與產蛋雞生理和體內激素水平變化導致對流感病毒易感性增加有關。致病性結果顯示,雖然新型H3N3病毒不能致死SPF雞,但病毒可引起鼻甲、氣管、肺臟、眼結膜嚴重的病理損傷,造成呼吸系統黏膜完整性的破壞。H3N3病毒感染產蛋雞直接造成的組織損傷以及細菌、支原體等病原繼發感染都會引起劇烈的炎癥反應,出現體溫急劇升高,造成卵泡充血、液化、破裂,最終形成卵黃性腹膜炎,不僅短時間內造成雞群產蛋率急性下降,而且預后恢復時間長,造成較大的經濟損失。應注意的是,H3N3病毒引起雞群的發病表現與H9N2等低致病性AIV類似,尚需對臨床上表現呼吸道癥狀的肉雞、育成期蛋雞持續監測,掌握H3N3病毒在不同品種雞群中的流行和致病情況。

空氣傳播和直接接觸傳播是流感病毒的主要傳播方式。流感病毒在野生水禽宿主間主要通過糞-口途徑直接接觸傳播,不同亞型流感病毒在雞群間的傳播能力差異很大。H5Ny、H7N9亞型高致病性流感病毒雖然對雞致病性強,但其主要通過直接接觸傳播,不能在雞之間有效空氣傳播,因此擴散速度慢[11-12]。多數H9N2病毒可在雞群中有效空氣傳播,這是其能夠在雞群中形成優勢流行的重要原因。研究發現,HA-K363和PA-L672變異是決定H9N2病毒空氣傳播的關鍵因素[13]。本研究中發現,雖然H3N3和H3N8病毒都重組了H9N2病毒的內部基因,均具有PA-L672變異,但其NA基因的差異導致病毒的傳播特性明顯不同,H3N3病毒可在雞群中發生空氣傳播,而H3N8病毒不能在雞群中有效空氣傳播。NA蛋白具有神經氨酸活性,在病毒感染過程中可以切割呼吸道上皮細胞表面的黏蛋白和糖蛋白分子上的唾液酸,促進病毒感染;在病毒出芽釋放過程中切割宿主細胞表面以及新生病毒粒子表面的唾液酸,促進病毒釋放[14]。因此,NA蛋白對于流感病毒的致病性、傳播性、跨種傳播能力具有重要作用。相比于野鳥源的N8蛋白,雞源N3蛋白顯然更適應雞宿主,不同亞型NA蛋白導致病毒傳播性差異的分子機制尚需要深入研究。

總之,鑒于新型H3N3病毒對雞群具有較強的致病性和傳播性,急需開展系統的病原學和血清學監測,掌握病毒的流行區域和感染宿主范圍,研發快速診斷方法和疫苗,制定科學合理的防控措施,及早將這種新型流感病毒控制在流行初期。

4 結 論

本研究發現新型H3N3流感病毒是由雞群中流行的H3N8病毒與H10N3病毒重排產生,內部基因來源于H9N2病毒。新型H3N3流感病毒在我國雞群中已形成流行趨勢并主要引起蛋雞臨床發病,病毒可在雞呼吸系統有效復制,造成嚴重的病理損傷,且可在雞群中有效空氣傳播,有可能成為雞群中新的優勢流行病毒,對我國家禽養殖業威脅較大,需要進一步開展其防控研究。