基于SNP和表型性狀的秈稻種質(zhì)資源遺傳多樣性研究

賀喬喬 周希希 王業(yè)文 李培江 王勝寶 張 羽*

(1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院/陜西省資源生物重點(diǎn)實驗室,陜西 漢中 723000; 2.陜西省水稻研究所,陜西 漢中 723000)

水稻(OryzasativaL.)是全球主要的糧食作物,也是植物遺傳育種和基因組學(xué)研究的模式生物,在種間、種內(nèi)都具有豐富的遺傳多樣性。種質(zhì)資源評價可以為加強(qiáng)種質(zhì)資源的管理、保護(hù)與利用奠定基礎(chǔ)。由于不同水稻材料在每個農(nóng)藝性狀上表現(xiàn)出豐富的表型多樣性,胡標(biāo)林等[1]以14個表型性狀對1 579份全球水稻種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性和優(yōu)良稻種的分析與評價,結(jié)果表明株高、抽穗期、倒伏性、淀粉含量、穎殼色和糙米色性狀可作為種質(zhì)資源綜合評價的指標(biāo)。張曉麗等[2]采用統(tǒng)計數(shù)據(jù)和主成分分析法,對4個東南亞國家的298份水稻種質(zhì)資源進(jìn)行表型多樣性分析,結(jié)果表明有效穗數(shù)的變異系數(shù)最大,株高、莖稈長和穗粒數(shù)次之,結(jié)實率的變異系數(shù)最小。23個表型性狀中前8個主成分在總變異中的累計貢獻(xiàn)率達(dá)67.99%。張雯雯等[3]用18個農(nóng)藝性狀對56份云南省滇西北地區(qū)的粳稻資源的表型多樣性進(jìn)行分析,結(jié)果表明數(shù)量性狀的多樣性指數(shù)(1.68～2.06)明顯高于質(zhì)量性狀(0.60～1.16)。湯翠鳳等[4]用17個農(nóng)藝性狀的多樣性指數(shù)對云南省1 189份水稻地方品種進(jìn)行了表型多樣性鑒定。

隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展,分子標(biāo)記技術(shù)在生物學(xué)各個領(lǐng)域的應(yīng)用已日趨成熟。特別是高通量測序技術(shù)的發(fā)展是獲得第三代分子標(biāo)記SNP(single nucleotide polymorphism)的有效途徑,SNP具有在基因組分布密度高、多態(tài)性高、遺傳穩(wěn)定和檢測方法眾多等特點(diǎn)[5],能最大化利用DNA序列的變化。簡化基因組測序(reduced-representation genome sequencing,RRGS)是基于高通量測序技術(shù)發(fā)展起來的利用酶切降低基因組復(fù)雜程度的測序技術(shù),主要分為限制性酶切位點(diǎn)DNA測序RAD-seq、基于測序的基因分型技術(shù)GBS(genotyping-by-sequencing)和特異性位點(diǎn)擴(kuò)增片段測序SLAF-seq[6]。GBS技術(shù)的關(guān)鍵是運(yùn)用了甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶,如NlaIII、MseI等Ⅱ型酶,回避了基因組主要的重復(fù)區(qū)域[7],簡化基因組測序,具有不參考基因組便可進(jìn)行大量SNP開發(fā)的優(yōu)勢,其在構(gòu)建遺傳圖譜、遺傳多樣性、QTLs(quantitative trait locus)作圖、群體遺傳學(xué)等研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。劉傳光等[8]報道,水稻亞種間及亞種內(nèi)品種間SNPs都很豐富,在用傳統(tǒng)的分子標(biāo)記方法難以找到親緣關(guān)系近的材料間多態(tài)性位點(diǎn)時,用SNPs技術(shù)也能找到數(shù)量可觀的多態(tài)性位點(diǎn)。水稻中平均SNP的發(fā)生頻率為0.65%左右。王悅星等[9]報道分布在秈稻12條染色體上的SNPs和單倍型(haplotype)的多態(tài)性及分布密度都不同。侯青青等[10]介紹了在水稻中利用SNP芯片分型和重測序SNP分型技術(shù)進(jìn)行水稻重要性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法。李梓榕等[11]開發(fā)了一種快速篩選SNP構(gòu)建DNA指紋圖譜的方法,利用12個SNP標(biāo)記即可對117份水稻種質(zhì)進(jìn)行鑒定。Singh等[12]利用SSR(simple sequence repeat)和SNP兩種標(biāo)記方法比較了375個印度水稻品種的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)的差異,結(jié)果表明SNP標(biāo)記具有更高的群體分辨率,但SSR對多樣性分析更有效。Courtois等[13]利用25對SSR和70個SNPs標(biāo)記對250份粳稻核心品種進(jìn)行了表型和結(jié)構(gòu)分析,結(jié)果表明SSR和SNP產(chǎn)生的距離矩陣相關(guān)性很強(qiáng)。Travis等[14]利用定制的384-SNP芯片對孟加拉的511份水稻品種的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,將511個品種劃分為4個群。Choudhury等[15]利用水稻的12條染色體上的36個非連鎖SNP標(biāo)記,對6 984份來自印度東北部水稻材料的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,把6 984份水稻材料劃分為3個亞群。Parida等[16]探索了水稻的抗逆性狀與SNPs的相關(guān)性,在384個SNP標(biāo)記中成功驗證了362個標(biāo)記,為鑒定和定位性狀相關(guān)基因組區(qū)域提供了線索。目前,運(yùn)用基因組學(xué)和表型組學(xué)對秦巴地區(qū)秈稻種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究鮮見報道。本研究利用SNP分子標(biāo)記和15個表型性狀對秦巴地區(qū)198份秈稻種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析,旨在探究秈稻表型性狀的遺傳多樣性信息,以期為挖掘秈稻優(yōu)異種質(zhì)資源和分子輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

198份秈稻種質(zhì)資源包括,恢復(fù)系材料112個,保持系材料49個,恢保關(guān)系不明的材料37個,于陜西省水稻研究所試驗場(106°59′57″ E,33°7′48″ N),按16.7 cm×20.0 cm分株式設(shè)計移栽(表1)。每個樣品隨機(jī)排列在3個地塊上,地塊之間沒有保護(hù)邊緣行。

表1 供試秈稻信息

1.2 基因型數(shù)據(jù)獲取

采用CTAB法[17]提取198份材料幼嫩葉片的DNA,采用NlaIII和MseI分別酶切的GBS技術(shù)測序,SNP過濾時采用MAF 0.05對基因頻率進(jìn)行篩選,其目的是過濾掉會影響后續(xù)群體結(jié)構(gòu)分析的低質(zhì)量SNP。

1.3 表型的相關(guān)指標(biāo)測定

對198份材料的15個性狀按照《水稻種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[18]進(jìn)行農(nóng)藝、經(jīng)濟(jì)和品質(zhì)性狀調(diào)查,在198個樣本的區(qū)域中各選取6株植株,連續(xù)3年(2017—2019年)觀察記錄,以3年數(shù)據(jù)的平均值作為15個性狀的表型值。15個性狀包括播始?xì)v期、株高、葉長、葉寬、單株有效穗、穗長、穗總粒數(shù)、穗實粒數(shù)、千粒重、糙米率、精米率、整精米率、堊白度、堊白粒率、籽粒長寬比。

1.4 基于表型性狀的遺傳多樣性分析

H’=-∑PilnPi[4]

式中:Pi為分析單元內(nèi)某個性狀第i級的材料數(shù)占總材料數(shù)的百分比。

使用SPSS 22.0軟件對連續(xù)3年的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行Z-Scores標(biāo)準(zhǔn)化后,對15個表型數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳變異、相關(guān)性、主成分分析和歐式距離矩陣分析。使用MEGA 10.0(http:∥www.megasoftware.net/)軟件對15個表型性狀標(biāo)準(zhǔn)化后數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化聚類,一般近緣序列采用最大簡約法(maxuimum parsimony,MP)或除權(quán)配對法(unweighted pair group method arithmetic mean,UPGMA),構(gòu)建進(jìn)化樹。采用NTsys-pc v2.1軟件[20]的PCA(principal component analysis)方法對主成分分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.5 基于SNPs的群體結(jié)構(gòu)分析

群體結(jié)構(gòu)分析與控制是進(jìn)行基因關(guān)聯(lián)定位的前提,因為復(fù)雜的群體結(jié)構(gòu)會導(dǎo)致基因型和表型的假陽性關(guān)聯(lián)。運(yùn)用TASSEL 5.0(https:∥www.maizegenetics.net/tassel)對198個樣本的SNPs進(jìn)行掃描,進(jìn)行基于Nei’s的遺傳距離(identity-by-state,IBS)計算。采用Structure 2.3.4(http:∥taylor0.biology.ucla.edu/structureHarvesteroybase.org/tools.php)軟件[21]的Bayes聚類算法,模擬群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行估計,設(shè)置隸屬概率閾值為0.60,模擬1到5的種群K,每個K迭代5次,使用10 000個Burning,進(jìn)行100 000次MCMC(markov chain monte carlo)迭代,以獲得最可能的種群數(shù)量的估計。ΔK是根據(jù)K繪制的,根據(jù)Evanno等[22]提出的方法和Structure Harvester(http:∥taylor0.biology.ucla.edu/structureHarvester/)[23]平臺獲得的數(shù)據(jù),確定最佳聚類數(shù),并繪制基于模型的群體遺傳結(jié)構(gòu)圖。使用GENALEX(https:∥biology-assets.anu.edu.au/GenAlEx/Welcome.html)進(jìn)行 Mantel檢驗,Mantel檢驗是對兩個距離矩陣相關(guān)性的統(tǒng)計方法[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型性狀多樣性及聚類分析

由表2可知,15個表型性狀中,堊白度的變異系數(shù)(CV)最大,其CV為140.66%;糙米率CV最小,其CV為3.86%。多樣性指數(shù)最高的表型性狀是穗長和千粒重,其多樣性指數(shù)都是2.08;最低的是堊白度,其多樣性指數(shù)為1.54?；?5個表型性狀的平均變異系數(shù)(CV)和平均多樣性指數(shù)分別為30.33%和1.95。

表2 15個表型性狀的基本統(tǒng)計分析和多樣性

由表3可知,15個表型性狀之間的相關(guān)系數(shù)(r)在-0.55～0.92。株高與播始?xì)v期、穗總粒數(shù)與穗長、穗總粒數(shù)與穗實粒數(shù)、整精米率與精米率、堊白粒率與堊白度之間均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。長寬比與堊白度、堊白粒率與穗實粒數(shù)、堊白度與穗總粒數(shù)、穗長與單株有效穗、葉長與堊白粒率、葉長與堊白度之間均呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

由表4和表5可知,前3個主成分可分別解釋群體變異的29.44%、16.63%、10.59%,對第一主成分貢獻(xiàn)較大的性狀包括穗長(0.76)、株高(0.75)、穗總粒數(shù)(0.70)、播始?xì)v期(0.68)、穗實粒數(shù)(0.67)、葉長(0.64)、堊白粒率(-0.61)和堊白度(-0.60),這8個性狀對第一主成分的貢獻(xiàn)值絕對值都在0.60以上,是秈稻表型性狀變異的主要因素。

表4 15個表型性狀的主成分分析的成分矩陣

表5 15個表型性狀的主成分和成分得分系數(shù)矩陣的特征值和貢獻(xiàn)百分比

2.2 基于表型性狀的聚類分析

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后的15個表型性狀數(shù)據(jù),用UPGMA聚類把198份樣本聚為2個亞組(圖1)。前5個主成分反映了總信息量的73.003%,前2個主成分的累計貢獻(xiàn)率為46.072%(圖2),說明198份材料的親緣關(guān)系較近。

圖1 基于15個表型性狀的UPGMA聚類圖

圖2 基于15個表型性狀的PC聚類

2.3 基因組圖譜構(gòu)建

分別用2種酶切的GBS技術(shù)在198份材料中共識別91 421個SNPs,其中包括85 535個比對到具體染色體上的SNPs和5 886個沒有定位到具體染色體上的SNPs。雜合位點(diǎn)占5.85%,MAF為0.19,1～12號染色體上SNP Tajima’s D依次分別為2.006、1.815、1.182、2.097、2.087、2.271、1.732、2.003、2.057、2.499、2.274、2.064,平均值為2.007(表6)。

表6 12條染色體上SNP的Tajima’s D

2.4 基于SNPs的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

由圖3可知,當(dāng)K=3時,ΔK達(dá)到最大值,表明198份材料被分為3個亞類,分別由9,53,136個樣本組成?；贜ei’s的遺傳距離在0.014(樣本Z 19-37和Z 5)～0.596(樣本Z 19-37和Z 10),平均遺傳距離為0.284。91 421個SNPs構(gòu)成的總變異中,前3個PC可分別解釋群體變異的10.98%、10.47%、4.81%,用前3個主成分聚類198份材料時分組不明顯。

圖3 K=3時,基于貝葉斯算法的遺傳結(jié)構(gòu)

2.5 2種聚類方法的相關(guān)性分析

Mantel檢驗表明,91 421個SNPs和15個表型性狀的遺傳距離矩陣之間的r為0.041(圖4),即相關(guān)性很低,但由于表型是由基因型和環(huán)境共同決定的,表型性狀中的數(shù)量性狀對環(huán)境極為敏感,而在SNP分析中發(fā)現(xiàn)其遺傳距離較近,同一育種單位育成品種遺傳距離較近, 與它們的系譜來源吻合,所以認(rèn)為基于SNPs的聚類比表型性狀聚類更接近系譜分析。

圖4 基于SNPs與15個表型性狀的遺傳距離間的相關(guān)性

3 討 論

水稻大部分表型性狀屬于數(shù)量性狀遺傳,如抽穗期、分蘗數(shù)、株高、每穗粒數(shù)等,這些性狀對環(huán)境條件非常敏感,不同年份、不同地塊的水、肥、氣、熱等因素均影響表型性狀的表現(xiàn)[25]。目前大多數(shù)性狀主要還是靠人工考種,容易引入主觀測量誤差而影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性,除此之外,還可能與選擇性狀的數(shù)目不夠多等因素有關(guān),對表型性狀的準(zhǔn)確記錄是進(jìn)行全基因組基因關(guān)聯(lián)定位等生物學(xué)問題分析的首要條件[26],為了保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,本研究進(jìn)行了3次生物學(xué)重復(fù),然而15個表型性狀產(chǎn)生的遺傳距離矩陣與SNPs標(biāo)記產(chǎn)生的遺傳距離矩陣間的相關(guān)性很低。對于不同遺傳標(biāo)記在群體結(jié)構(gòu)和多樣性的研究中,報道較多的為SSR標(biāo)記與表型聚類的比較研究,張春紅等[27]利用3種遺傳標(biāo)記(食味性狀、農(nóng)藝性狀和SSR)對表現(xiàn)優(yōu)異的60份粳稻材料進(jìn)行了多樣性分析,表明SSR標(biāo)記聚類結(jié)果與系譜分析結(jié)果基本一致,而農(nóng)藝性狀表現(xiàn)與材料來源一致性較好,但與食味優(yōu)良的關(guān)系不明確。趙慶勇等[28]研究發(fā)現(xiàn)SSR標(biāo)記比表型聚類能更準(zhǔn)確的揭示親本之間的遺傳差異。楊旺興等[29]研究秈、粳稻及其雜交后代的遺傳多樣性時發(fā)現(xiàn),在親緣關(guān)系不明晰的材料中,SSR分子聚類分析比表型聚類更準(zhǔn)確。

種質(zhì)資源是作物優(yōu)良基因的載體,是育種的基礎(chǔ),對現(xiàn)有資源的改良與創(chuàng)新利用是未來種質(zhì)資源研究工作中的重中之重[30],而表型性狀的應(yīng)用在生物種質(zhì)資源研究中起著很大的作用,隨著表型組學(xué)中智能化表型測量平臺的應(yīng)用,表型鑒定將更加準(zhǔn)確可靠[31],可為基因資源的發(fā)掘提供必要信息。隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展,特別是GBS技術(shù)在簡化基因組測序方面的普及,越來越多的研究利用此技術(shù)開發(fā)出高密度的SNPs標(biāo)記用于不同作物的資源評價、遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、分子選擇育種等全基因組關(guān)聯(lián)研究領(lǐng)域[5]。SNPs標(biāo)記已成功應(yīng)用于水稻[32]、玉米[33]、小麥[34]、大豆[35]、葡萄[36]等作物中。本研究發(fā)現(xiàn)秦巴地區(qū)的秈稻種質(zhì)資源的SNPs聚類比表型性狀聚類更接近系譜分析,特別是親緣關(guān)系近的材料分析時表現(xiàn)出強(qiáng)大的應(yīng)用潛力,但仍需要進(jìn)一步試驗驗證。

4 結(jié) 論

秦巴地區(qū)198份秈稻種質(zhì)的SNPs構(gòu)成的群體遺傳結(jié)構(gòu)相對簡單,多種聚類分析結(jié)果表明供試的198份材料間只存在較小的遺傳差異,遺傳結(jié)構(gòu)較為單一,而表型性狀變異較豐富,多樣性程度高,特別是穗長和堊白度的多樣性程度高,群體間性狀差異顯著。穗長、株高、穗總粒數(shù)、播始?xì)v期、穗實粒數(shù)、葉長、堊白粒率和堊白度8個性狀可作為秦巴地區(qū)秈稻表型性狀的綜合評定指標(biāo)。