利用二代測序技術(shù)對柔嫩艾美耳球蟲T-DNA整合位點(diǎn)的分析及鑒定

郝振凱 湯新明 張媛媛 謝福杰 陳君敏 索靜霞 索 勛 劉賢勇*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院/獸醫(yī)公共衛(wèi)生安全全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193; 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193; 3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物學(xué)院, 北京 100193)

柔嫩艾美耳球蟲T-DNA整合位點(diǎn)即轉(zhuǎn)基因球蟲基因組染色體中轉(zhuǎn)染載體基因插入的位置,目前球蟲轉(zhuǎn)基因操作主要以限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的整合(Restriction enzyme-mediated integration, REMI)方法為主,該方法將外源基因片段隨機(jī)插入到球蟲基因組染色體上,可將柔嫩艾美耳球蟲轉(zhuǎn)染效率提高100倍以上[1]。但基于REMI方法獲得的轉(zhuǎn)基因球蟲其外源基因片段在球蟲基因上會隨機(jī)整合,這使得后期深入開展轉(zhuǎn)基因球蟲表型相關(guān)研究時必須鑒定T-DNA的整合位點(diǎn),以排除外源基因插入位點(diǎn)導(dǎo)致的轉(zhuǎn)基因球蟲表型的差異。目前常用于獲取球蟲轉(zhuǎn)基因整合位點(diǎn)信息的方法主要是基于轉(zhuǎn)染載體序列的染色體步移技術(shù)(Genome-walking)和質(zhì)粒拯救(Plasmid rescue)等[2-3],雖然這些方法已經(jīng)廣泛用于插入位點(diǎn)的鑒定和側(cè)翼序列的獲取,但這些方法除了操作步驟繁瑣、耗時較長等缺點(diǎn)外,還存在不確定、成功率低等問題。因此,建立一種適用于轉(zhuǎn)基因球蟲的、高效、簡單的T-DNA整合位點(diǎn)的方法就尤為重要。

隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展,全基因組重測序技術(shù)日漸成熟,測序成本的大幅度下降,測序周期的縮短以及測序數(shù)據(jù)質(zhì)量的大幅度提高,使得重測序技術(shù)的應(yīng)用越來越廣泛。Siddique等[4]利用二代測序成功地鑒定了轉(zhuǎn)基因玉米的T-DNA插入位點(diǎn)信息,徐紀(jì)明等[5]采用二代測序的方法成功地鑒定了3個樣品的4個外源基因整個位點(diǎn)側(cè)翼序列信息,因此,基于二代測序鑒定T-DNA插入位點(diǎn)的方法已被證明了其高效性和特異性。近期柔嫩艾美耳球蟲染色體級別的精細(xì)基因組的發(fā)表[6],使得利用二代測序技術(shù)鑒定轉(zhuǎn)基因柔嫩艾美耳球蟲的外源基因整合位點(diǎn)成為可能。為了探討利用全基因組重測序技術(shù)是否能適用于轉(zhuǎn)基因球蟲外源基因的整合位點(diǎn)進(jìn)行鑒定分析,本研究對實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的一個轉(zhuǎn)基因柔嫩艾美耳球蟲蟲株EtM2e進(jìn)行了重測序分析,成功地鑒定了EtM2e蟲株T-DNA的插入位點(diǎn)信息。基于二代測序鑒定轉(zhuǎn)基因球蟲T-DNA出入位點(diǎn)方法的建立,極大地提高了插入位點(diǎn)側(cè)翼序列分析的準(zhǔn)確性和鑒定地成功率,為球蟲外源基因整合位點(diǎn)的鑒定提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 轉(zhuǎn)基因柔嫩艾美耳球蟲EtM2e蟲株

轉(zhuǎn)基因柔嫩艾美耳球蟲EtM2e表達(dá)了H5N1亞型禽流感病毒M2蛋白胞外區(qū)段結(jié)構(gòu)域(M2e),是利用REMI隨機(jī)插入基因組構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白的蟲株[7]。轉(zhuǎn)染載體如下圖1所示,轉(zhuǎn)基因球蟲后代經(jīng)單孢子囊分離獲得單克隆群體為EtM2e蟲株,經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)該蟲株卵囊發(fā)光率為95%以上,保存于本實(shí)驗(yàn)室。

Et.His4,柔嫩艾美耳球蟲組蛋白4的5′調(diào)控區(qū)序列;M2e,H5N1亞型禽流感病毒M2蛋白胞外區(qū)段結(jié)構(gòu)域;EYFP,增強(qiáng)型黃色熒光蛋白序列;Et.Actin,柔嫩艾美耳球蟲肌動蛋白3′調(diào)控區(qū)序列;T-Vector Skeleton,T載體骨架包括K+抗性序列和T載體復(fù)制相關(guān)序列;圖片標(biāo)尺為50 μm,嵌套圖標(biāo)尺為5 μm。 Et.His4, sequence of the 5′ regulatory region of E. tenella histone 4; M2e, structural domain of the extracellular segment of the M2 protein of H5N1 subtype avian influenza virus; EYFP, enhanced yellow fluorescent protein sequence; Et.Actin, sequence of the 3′ regulatory region of E. tenella actin; T-Vector Skeleton, T vector backbone including K+ resistance sequences and T vector replication-related sequences; Scale bar, 50 μm and 5 μm (in embedded images)

1.2 EtM2e蟲體獲得及基因組DNA提取

取4×105EtM2e孢子化卵囊經(jīng)口接種14日齡的AA無球蟲肉雞。接種后120 h剖檢盲腸,利用0.5%牛磺脫氧膽酸鹽溶液和0.25%胰酶消化盲腸黏膜刮取物,離心后收取裂殖子。

利用CTAB法提取裂殖子的基因組DNA。取65 ℃預(yù)熱CTAB提取液和蛋白酶K重懸裂殖子,顛倒混勻,60 ℃孵育2 h;37 ℃加入RNase,孵育30 min;加入等體積的酚:氯仿:異戊醇(25∶24∶1),輕柔混勻,12 000 r/min室溫離心10 min,轉(zhuǎn)移上清后加入等體積的氯仿:異戊醇(24∶1),顛倒混勻,12 000 r/min室溫離心5 min;取上清,加入1～2倍體積的在-20 ℃預(yù)冷的異丙醇,輕柔混勻,-20 ℃靜置30 min,12 000 r/min離心15 min;沉淀用75%乙醇和0.2 mol/L 醋酸鈉洗滌,12 000 r/min室溫離心10 min,重復(fù)1次;加入適量的水溶解沉淀,測定濃度,保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

使用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和完整性,并用Qubit4.0測定DNA濃度。根據(jù)轉(zhuǎn)基因載體中M2e和EYFP序列設(shè)計引物鑒定轉(zhuǎn)染載體,M2e-F: CGCCTACCAGAAACGAATG; EYFP-R: GTTCACCTTGATGCCGTTC,引物由北京瑞博興科生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 EtM2e蟲體基因組重測序

樣品基因組DNA檢測合格后,用機(jī)械打斷的方法(超聲波)將DNA片段化,然后對片段化的DNA進(jìn)行片段純化、末端修復(fù)、3′端加A、連接測序接頭,再用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇,進(jìn)行PCR擴(kuò)增形成測序文庫。建好的文庫先進(jìn)行文庫質(zhì)檢,質(zhì)檢合格的文庫用Illumina NovaSeq平臺進(jìn)行雙端測序,測序讀長150 bp。為保證后續(xù)分析的準(zhǔn)確,測序深度100×,得到至少6G的下機(jī)數(shù)據(jù),并保證數(shù)據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Q20>90%,全基因組重測序委托上海派森諾生物科技有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Fastp過濾下機(jī)數(shù)據(jù)(Raw data)[8]。過濾指標(biāo)包括:1)去除接頭序列,2)設(shè)置低質(zhì)量值為20(Q20),reads序列中低質(zhì)量堿基含量大于30%則過濾掉,3)去除長度小于50的reads。

利用Bowtie2軟件將質(zhì)控后的測序數(shù)據(jù)與柔嫩艾美耳球蟲參考基因組比對(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_905310635.1)[9],根據(jù)覆蓋深度和覆蓋度評估二代測序的隨機(jī)性;而后將測序數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)基因載體序列進(jìn)行比對分析,去除未比到T-DNA的reads,獲得嵌合體reads(reads的一端比對到T-DNA上,另一端比對到柔嫩參考基因組上的reads)。根據(jù)嵌合體reads的序列,在ToxoDB上進(jìn)行序列比對,得到該T-DNA在基因組上的具體位置,即為可能的插入位點(diǎn)。

利用mosdepth軟件分析載體序列與球蟲同源區(qū)段即5′調(diào)控區(qū)和3′調(diào)控區(qū)序列[10],以及載體特有序列的測序深度并以此估計載體拷貝數(shù)。

1.5 T-DNA整合位點(diǎn)的PCR驗(yàn)證

根據(jù)數(shù)據(jù)分析得到的T-DNA插入位點(diǎn)的基因組序列信息,以及測序的轉(zhuǎn)基因載體序列信息,使用Primer 3 PLUS設(shè)計軟件,使引物一端在參考基因組上,另一端在T-DNA上。5′端驗(yàn)證引物,F1: ATGCCATTTCTTTTGCTGCT, R1: CATTCGTTTCTGGTAGGCG; 3′端驗(yàn)證引物,F2: ATGTTACCTTTGTCACCGTCAGT,R2: GAGTAGCAGCTCTTCTTTGCAGT。對EtM2e基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證,確認(rèn)T-DNA的插入位點(diǎn)。引物由北京瑞博興科生物技術(shù)有限公司合成。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因EtM2e蟲株的鑒定及基因組提取

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,CTAB法提取的球蟲裂殖子基因組DNA結(jié)構(gòu)較為完整,未發(fā)生降解,總體符合重測序要求(圖2);以提取的DNA為模板,通過轉(zhuǎn)染載體鑒定引物PCR擴(kuò)增條帶大小為542 bp(圖2),經(jīng)Sanger測序驗(yàn)證擴(kuò)增序列與轉(zhuǎn)染載體序列一致。

(a)CTAB法提取基因組的凝膠電泳,M,DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000;(b)M2e序列的PCR擴(kuò)增,M,DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000 Plus。 (b) DNA integrity test by CTAB. M, DL 15 000 DNA marker; (b) PCR amplification of M2e, M, DL 2 000 Plus DNA marker.

2.2 T-DNA插入位點(diǎn)分析

采用Illumina測序平臺雙端2×150 bp測序,下機(jī)數(shù)據(jù)共7.5 Gb,Q20為94.7%,Q30為87.6%;經(jīng)Fastp過濾后,得到數(shù)據(jù)7.2 Gb,Q20為96.1%,Q30為89.2%,得到比對reads數(shù)為23 992 361 ds,平均測序深度為80×,reads全基因覆蓋結(jié)果如下圖3所示,可以看到在整個染色體上分布較為均勻,測序的隨機(jī)性比較好,因此該數(shù)據(jù)可以進(jìn)行后續(xù)分析。

HG994961.1～HG994975.1,柔嫩艾美耳球蟲細(xì)胞核基因組染色體編號;HG994976.1,線粒體基因組編號;HG994977.1,頂質(zhì)體基因組編號。 HG994961.1-HG994975.1, E. tenella nuclear genome chromosome number; HG994976.1, mitochondrial genome number; HG994977.1, apicoplast genome number.

使用Bowtie2軟件對質(zhì)控后的數(shù)據(jù)比對至T-DNA載體序列得到比對reads數(shù)為3 106和3 036,平均測序深度為140×,通過嵌合體reads序列分析得到1個候選T-DNA插入位點(diǎn)(圖4),位于HG994969.1: 2 704 213～2 705 255處。使用mosdepth軟件分析載體各個元件的平均測序深度(圖5),結(jié)果顯示,T載體骨架特有序列—卡那抗性基因的平均測序深度為67×,T-DNA特有序列—EYFP基因的平均測序深度為85×,而T-DNA與球蟲同源序列His4基因的5′調(diào)控區(qū)序列的平均測序深度為154×,Actin基因的3′調(diào)控區(qū)序列的平均測序深度為164×,這表明T-DNA中與載體同源序列的測序深度大約是載體特有序列的2倍,進(jìn)一步說明了該載體是以單拷貝的形式整合到球蟲基因組上。

大寫字母為載體序列(綠色),小寫字母為插入位點(diǎn)序列(灰色)。 (a) 3′端嵌合體reads序列;(b)5′端嵌合體reads序列。 Upper case letters are vector sequences (green), lower case letters are insertion site sequences (grey). (a) Sequences of 3′ chimeric reads; (b) Sequences of 5′ chimeric reads.

圖5 轉(zhuǎn)染載體各元件測序深度

2.3 T-DNA插入位點(diǎn)PCR驗(yàn)證

為確認(rèn)轉(zhuǎn)基因蟲株的T-DNA插入位點(diǎn),分別設(shè)計引物分別對載體兩端序列進(jìn)行驗(yàn)證,凝膠電泳結(jié)果顯示,以轉(zhuǎn)基因蟲株DNA為模板,通過兩對引物均能擴(kuò)增出目標(biāo)大小的條帶,5′端擴(kuò)增條帶1 714 bp;3′端擴(kuò)增條帶975 bp,而野生蟲株DNA沒有擴(kuò)增條帶(圖6),而后利用Sanger測序也驗(yàn)證了PCR擴(kuò)增序列與目標(biāo)序列的一致性。

M, DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000 Plus;+,M2e蟲株DNA;-,野生蟲株DNA。 M, DL 2 000 Plus DNA marker; +, DNA of M2e strain; -, DNA of wild type strain.

3 討 論

本研究利用二代測序技術(shù)分析并鑒定了EtM2e蟲株的T-DNA插入基因組HG994969.1: 2 704 213～2 705 255,同時通過對T-DNA測序深度分析發(fā)現(xiàn)該載體是以單拷貝的形式插入基因組。

T-DNA插入位點(diǎn)的鑒定在球蟲轉(zhuǎn)基因研究方面有著非常重要的意義。目前雞球蟲轉(zhuǎn)基因操作主要以基于限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的整合方法實(shí)現(xiàn)將外源載體基因片段插入基因組,這種基因整合方法的局限性首先會導(dǎo)致T-DNA的隨機(jī)整合,這也將進(jìn)一步造成轉(zhuǎn)基因蟲株群體中個體球蟲表達(dá)量存在顯著差異以及由于整合位點(diǎn)的不穩(wěn)定導(dǎo)致T-DNA的丟失;其次,由于限制性內(nèi)切酶對基因組切割活性的限制,導(dǎo)致存在未整合到基因組的游離型T-DNA,這類T-DNA會嚴(yán)重影響后續(xù)轉(zhuǎn)基因球蟲的篩選。

當(dāng)前獲取球蟲T-DNA插入位點(diǎn)的常用方法是Genome-walking[3],該方法是基于熱不對稱PCR,利用載體的特異性引物在高溫時的特異性擴(kuò)增以及隨機(jī)引物的低溫擴(kuò)增,經(jīng)過連續(xù)3輪擴(kuò)增獲取載體側(cè)翼未知序列。但球蟲轉(zhuǎn)染載體的兩端通常是球蟲基因的啟動子區(qū)和polyA尾區(qū),這使得在實(shí)際操作中通常會有球蟲基因的干擾;同時由于球蟲的傳代過程中是以群體形式存在,且球蟲內(nèi)生性發(fā)育階段較為復(fù)雜,使得載體序列可能存在被蟲體修復(fù)而導(dǎo)致部分缺失的可能性,因此使用該方法時,大多數(shù)轉(zhuǎn)基因蟲株并不能得到理想的結(jié)果。質(zhì)粒拯救也是一種可用于獲取T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的方法,該方法利用T-DNA上不存在的限制性內(nèi)切酶切割基因組,得到DNA片段中包括兩端帶有基因組DNA的轉(zhuǎn)染載體,再通過自身環(huán)化獲得環(huán)形DNA,轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到帶有基因組片段的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒[1]。這種方法的局限性在于轉(zhuǎn)染載體中必須含有T載體的骨架部分用于環(huán)化后質(zhì)粒的復(fù)制和抗性基因的表達(dá),這勢必會增加球蟲轉(zhuǎn)染載體的堿基序列長度,也會在一定程度上降低轉(zhuǎn)染載體整合到基因組上的效率;同時,基因組提取的完整性、質(zhì)粒環(huán)化效率等多種因素制該方法的成功率,因此在轉(zhuǎn)基因球蟲研究中很少采用質(zhì)粒拯救的方法獲取T-DNA側(cè)翼序列。這些問題在一定程度上制約了基于基因過表達(dá)技術(shù)的球蟲功能基因研究以及球蟲活載體疫苗研發(fā)。因此,鑒定T-DNA是否整合到基因組以及整合位點(diǎn)信息對開展轉(zhuǎn)基因球蟲后續(xù)表型研究尤為重要。

近期,馬雪萌等[11]建立了一種基于高通量測序和交錯式熱不對稱PCR(TAIL-PCR)相結(jié)合的鑒定T-DNA插入位點(diǎn)的方法,該方法是對一輪TAIL-PCR產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序分析,成功鑒定了4個轉(zhuǎn)基因株系的T-DNA整合位點(diǎn),這種方法也可以嘗試應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因球蟲外源基因整合位點(diǎn)的鑒定。本研究中以T-DNA序列為模板利用Bowtie2 --local模式進(jìn)行比對,該模式下對reads進(jìn)行局部比對使得reads兩端不匹配模板的序列信息得以保留,從而便于利用嵌合體reads獲取載體的整合位點(diǎn)側(cè)翼序列,分析過程不需要使用全基因組序列信息分析插入位點(diǎn),減少了分析比對的工作量,縮短了分析流程。本研究以T-DNA與宿主同源序列的測序深度和載體特有序列的測序深度估計T-DNA的拷貝數(shù),理想狀態(tài)下T-DNA為單拷貝時,載體與球蟲同源序列的測序深度為載體特有序列測序深度的2倍,但實(shí)際結(jié)果表明,這個比例可能存在一定范圍的浮動,同時載體ORI區(qū)段測序深度異常高,分析發(fā)現(xiàn)該區(qū)段與球蟲宿主存在一定的同源性引起的。因此,使用這種估計拷貝數(shù)方法的前提是確保載體特有序列與球蟲基因組沒有同源區(qū)段。

目前基于CRISPR/Cas9的定點(diǎn)整合技術(shù)成為主流的實(shí)現(xiàn)外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因方法,與隨機(jī)整合相比定點(diǎn)整合轉(zhuǎn)染具有整合位點(diǎn)專一以及T-DNA拷貝數(shù)明確等優(yōu)勢[12]。Zambrowicz等[13]發(fā)現(xiàn)一個被命名為 ROSAβgeo26 的隨機(jī)轉(zhuǎn)基因小鼠品系在所有組織中均能檢測到高水平的β半乳糖苷酶表達(dá),經(jīng)過鑒定發(fā)現(xiàn)外源基因整合在了第6號染色體,Rosa26已被廣泛用于基因安全敲入并能保證轉(zhuǎn)入基因的正常穩(wěn)定表達(dá),基因組安全港(Genomic safe harbor, GSH)的概念也由此普及。此后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了AAVS1、H11、Col1a1和TIGRE等位點(diǎn)作為定點(diǎn)整合的基因組安全港[14-17]。球蟲活載體疫苗具有廣闊的應(yīng)用前景[18],為實(shí)現(xiàn)外源優(yōu)勢抗原持續(xù)表達(dá),需確保轉(zhuǎn)染載體在球蟲基因組上穩(wěn)定存在,為此篩選球蟲基因組的基因安全港成為球蟲活載體疫苗研發(fā)的先決條件之一。本研究發(fā)現(xiàn)插入位點(diǎn)位于ETH2_0942600和ETH2_0942700的3′UTR區(qū)域內(nèi),沒有影響編碼的完整性,因此該整合位點(diǎn)可以作為柔嫩艾美耳球蟲轉(zhuǎn)基因定向插入的靶點(diǎn),具有作為球蟲基因組安全港的潛力。

4 結(jié) 論

本研究提供了一種簡單、高效的基于二代測序獲取球蟲T-DNA整合位點(diǎn)的方法,并鑒定分析了EtM2e蟲株T-DNA的插入位點(diǎn),該位點(diǎn)位于基因間區(qū),可作為一個潛在的柔嫩艾美耳球蟲基因安全港為后續(xù)轉(zhuǎn)基因研究提供一個定點(diǎn)整合位點(diǎn)利用該方法可以快速鑒定T-DNA整合位點(diǎn)和估計拷貝數(shù),為球蟲外源基因整合位點(diǎn)的鑒定提供借鑒。