大百合花序分化及生理生化特征

魏 鈺 董知洋 張 蕾 李雯琪 張啟翔 高亦珂*

(1.北京林業大學 園林學院/城鄉生態環境北京實驗室,北京 100083; 2.北京市植物園管理處/北京市花卉工程技術中心,北京 100093)

球根花卉是指具有由地下莖或根變態形成膨大部分的多年生草本花卉,其特點是種類豐富、花型獨特以及養護簡便,因而在園林園藝上得到廣泛應用。大百合(Cardiocrinumgiganteum(Wall.) Makino)是百合科大百合屬多年生球根花卉,其植株高大挺拔,花朵潔白雅致,具有極高的觀賞價值,享有“百合王子”的美譽[1];其鱗莖可供食用,果實可入藥,具有一定經濟價值[2]。大百合屬為東亞特有屬,在百合科的親緣關系方面具有重要的分類學地位,被認為是百合科最原始的類群[3],具有較高的科研價值。由于大百合分布在山地林下潮濕地帶,長期處于野生狀態,其價值未能得到足夠的認知和重視。大百合在自然條件下從生長到開花發育周期長且花期較短,在園林應用中受到局限,因此需要對其成花機理和開花特性進行探究。進行大百合休眠解除與花序分化特征的研究,是開展大百合成花機制研究與花期調控的理論與實踐基礎。

花是被子植物特有的生殖器官,其形態和結構具有豐富的多樣性[4]。植物花器官的發育一般包括3個過程:成花誘導、花原基形成以及花器官形成與發育[5]。成花誘導是指植物從營養生長向生殖生長轉化的過程,由遺傳因子與多種環境信號共同促使植物的莖端分生組織轉化為花序分生組織;花原基形成階段,植物生長素不斷通過極性運輸積累到花序分生組織區域,形成花分生組織和花原基;花器官形成與發育階段,在成花特征基因的作用下,花原基發育成完整的花器官[6]。植物的成花機制是一個復雜的調控體系,除遺傳因子外,還受多種環境信號和內源途徑調控,包括光周期、溫度、春化及赤霉素等[7-9]。光是調節植物開花的主要環境因子之一,特別是光周期變化能夠誘導植物進入繁殖階段,例如短日照植物菊花,在長日照條件下會抑制開花[10]。環境溫度會直接影響開花,總體來說較高的環境溫度會促進開花,低溫則會延遲開花[11]。中國水仙在高溫環境下促進開花[12],而麝香百合和郁金香的開花則分別受到高溫和低溫的誘導[13]。內源激素在花發育過程中也起著重要作用,其中赤霉素不僅能促進植物器官生長,而且能誘導發育階段的轉變[14],這點在擬南芥中尤為明顯[15],但是赤霉素的作用在不同植物中具有一定差異性[16]。球根花卉由于特殊的形態結構與生活習性,相比其它植物,其在花序(芽)分化過程中的生理特性和養分運輸等方面有一定的特異性,主要特點是花序(芽)分化大都在地上部分休眠期完成,待外部環境合適后便可生長開花,但是不同的球根花卉花芽分化的特征差異較大。如郁金香花芽分化在夏季休眠期就已經完成[17];百合由于品種眾多,花芽分化進程從9月到次年5月不等,且對低溫需求的時間也不相同[18-20]。

大百合是一種極具開發潛力的球根花卉,其花序被認為是從有限花序到無限花序的過渡類型。目前,對大百合的研究主要集中在種質資源、親緣關系、引種栽培以及繁殖技術等方面[21-25],尚未見到關于大百合花序分化過程的形態學及生理變化方面的報道。基于前人對其它植物花序分化的研究,本研究通過觀察大百合鱗莖在北京地區自然越冬狀態下花序和花芽分化及發育過程的形態特征,同時分析鱗莖內幾種主要內源激素、可溶性糖和可溶性蛋白含量的變化規律,旨在探明大百合花序發育過程中莖端分生組織結構變化,解析大百合花序發育過程中內源激素、可溶性糖和可溶性蛋白含量的變化規律,以期為大百合開花機制研究以及花期調控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試材及取樣

供試材料大百合(C.giganteum)采自于湖南省邵陽市東安縣(26°26′ N,111°0′ E),選取正常、無病蟲害且周徑在24 cm以上的鱗莖為研究材料。2020年9月將鱗莖露地栽植于北京植物園(39°59′ N,116°12′ E),行間距80 cm×80 cm,鱗莖覆土2 cm,常規管理。12月上旬澆凍水后,地表覆3 cm厚松針保墑。9月上旬開始每隔2周(發育后期每隔1周)取樣,每次取3個鱗莖,共取樣22次合計66個鱗莖,用以觀測大百合花序分化進程至花芽分化完成。

1.2 試驗方法

1.2.1花序發育解剖觀察

樣品制備:剝去鱗莖外層的鱗片及小鱗葉,切取頂芽生長點4～5 mm后置于3D數碼顯微鏡(Leica M205 C,德國)觀察拍照;用FAA固定液固定后置于4 ℃冰箱保存。用掃描電鏡(Hitachi S-4800FESEM,日本)觀察大百合花序發育過程并拍照。

1.2.2內源激素及營養物質含量的測定

頂芽取樣觀察的同時取大百合中層鱗片(3～4層),將不同球莖的鱗片混合,分別秤取1.5 g樣品用于內源激素含量測定,稱取2.0 g樣品用于可溶性蛋白含量測定,稱取1.0 g樣品用于可溶性糖含量測定。每組樣品均設置3個重復,放入液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存。

本研究采用選擇性反應/多反應監測技術(SRM/MRM)質譜分析法[26],對大百合鱗莖內源激素進行定量測定。取標準品,用同位素內標法建立標準曲線;樣品液氮研磨后取100 mg,經乙腈溶液提取、過濾、洗脫和吹干,定容至200 μL。采用Waters I-Class LC超高效液相色譜系統進行分離,5500 QTRAP質譜儀(AB SCIEX,美國)在正/負離子模式下進行質譜分析。通過繪制標準曲線計算樣品各內源激素含量。采用蒽酮比色法[27]測定可溶性糖含量,采用考馬斯亮藍法[28]測定可溶性蛋白含量。

1.2.3數據分析

采用Microsoft Excel 2010軟件進行數據分析并制圖,采用SPSS Statistics 22.0軟件進行數據誤差分析(P<0.01,P<0.05)及相關系數分析。

2 結果與分析

2.1 大百合花序分化進程及其形態特征

大百合花序發育時間較長,從11月上中旬開始分化,到翌年4月上旬花芽全部分化完成,前后歷時近5個月。按花序及花芽發育過程的形態特征,大百合花序分化過程可分為以下6個階段(圖1):

(a)花序未分化期(Ⅰ期),×70;(b)花序原基分化初期(Ⅱ期),×70;(c)苞片原基分化期(Ⅲ期),×45;(d)小花原基分化期(Ⅳ期),×35;(e)花被片原基分化期(Ⅴ期),×30;(f)花芽分化完成期(Ⅵ期),×30。下同。GC:生長錐;LP:葉原基;BL:苞片原基;IP:花序原基; SFP:小花原基;PE:花瓣原基;ST:雄蕊原基;PI:雌蕊原基。 (a) Undifferentiation period (stage Ⅰ), ×70; (b) Start of inflorescence primordium differentiation period (stageⅡ), ×70; (c) Bract primordium differentiation period (stage Ⅲ), ×45; (d) Floret primordium differentiation period (stage Ⅳ), ×35; (e) Perianth differentiation period (stage Ⅴ), ×30; (f) Flower bud differentiation completed period (stage Ⅵ), ×30. The same below. GC: Growth cone; LP: Leaf primordium; BP: Bract primordium; IP: Inflorescence primordium; SFP: Small flower primordium; PE: Petal primordium; ST: Stamen primordium; PI: Pistil primordium.

Ⅰ期:花序未分化期(圖1(a))。10月底之前,大百合處于花序未分化期,即營養生長期。此階段大百合莖端呈扁圓型,莖端周圍有2～3片葉原基。由于頂端細胞沒有邊緣細胞活躍,因此葉原基伸長向內彎曲,同時能夠對頂端生長點起到保護作用。

Ⅱ期:花序原基分化初期(圖1(b))。10月底至11月中旬,大百合莖尖分生組織形態發生了顯著變化,生長點隆起,由未分化時的圓盤形變成半球形,且生長點周邊分化出多個苞片原基,這些改變標志著大百合莖端分生組織由營養生長轉為生殖生長。

Ⅲ期:苞片原基分化期(圖1(c))。11月中旬至翌年1月下旬,大百合的半球形花序原基不斷發育,葉狀苞片原基數量不斷增加直至分化完成,最初形成的苞片原基逐漸遠離花序軸,發育成為總狀花序下部的苞片;近軸端逐漸被后出現的苞片原基所占據,數量為10～20個不等;此時可見小花原基的雛形。從花序原基分化初期到此階段歷經時間逾60 d,此時為北京地區最冷的時期,由于土壤結冰造成低溫脅迫,植株的生理活動降至最低,花序發育緩慢。

Ⅳ期:小花原基分化期(圖1(d))。1月下旬至2月下旬,大百合花序原基分化基本完成,每個苞片原基的內腋處明顯可見半球形的小花原基。先分化出來的小花原基位于遠軸端,進一步發育為花序下部的小花;近軸端小花原基出現晚,發育為花序上部的小花,完成總狀花序發育。大百合小花原基分化期近30 d,此時隨地表氣溫回升,植株內部形態變化明顯較前期活躍,但是未觀察到鱗莖外部有形態變化。

Ⅴ期:花被片原基分化期(圖1(e))。2月下旬至3月中旬,小花原基開始進行花器官外層-花被片的分化。位于花序中部的小花原基花被片分化略早于頂端和外側的小花原基,說明其不同部位花被片的分化順序存在差異。此階段花器官發育速度較前幾個階段快,僅20 d左右。

Ⅵ期:花芽分化完成期(圖1(f))。3月中旬至4月上旬,每朵小花的雄蕊原基和雌蕊原基先后分化完成,標志著大百合整個花序及花芽分化完成。此時可以觀察到鱗莖已發芽并伸出地面約2 cm。

解剖觀察結果顯示大百合花序分化規律為:1)先進行花序結構分化,然后是小花原基及花器官分化,前后共歷時約150 d;2)大百合為有限總狀花序,在分化Ⅳ期,可以看到花序頂端分生組織逐步縮小形成一個球形器官(不發育成小花原基),占據了花序頂端位置,起到“封頂”作用,從而導致花序發育的終止,轉為小花原基分化階段;3)小花原基的起始是由花序基部到頂部,從莖端分生組織外圍到分生組織中央,具有時序性;花序基部的小花原基雖然先分化出來,但是到了分化Ⅴ期,可以明顯看出花序中上部的小花早于基部小花進行花器官分化,而最后所有小花基本同步完成花器官的分化。大百合花序分化過程中不同位置小花的發育存在漸趨同步的特點。

2.2 大百合花序分化過程中內源激素的動態變化

2.2.1大百合花序分化過程中內源激素的含量變化

對大百合花序和花芽分化過程中6種內源激素含量變化進行分析,結果見圖2。

吲哚-3-乙酸(IAA)是生長素類中最主要的一種植物激素,其主要作用是促進細胞分裂、伸長和分化,也影響營養器官和生殖器官的生長發育[29],IAA與花芽分化的關系一直存在爭議。如圖2(a)所示,大百合IAA含量在未分化階段最低,在花序和花芽分化過程中含量明顯增加,在原基分化初期和花芽分化完成期呈現雙峰的特征,特別是在花芽分化完成期達到峰值;在分化過程中間階段差異不顯著。在大百合花序未分化時,植株處于休眠狀態,因此IAA含量較低;花序分化開始后IAA含量顯著升高,推測在花序形成及花器官分化階段需要大量IAA參與形態建成。

赤霉素(GAs)是調節植物生長發育的重要激素,生理作用主要包括促進莖的伸長、花粉發育、側枝生長、種子發芽及果實生長等[30],其在植物體內的運輸沒有極性,對不同植物的作用也具有一定的差異[13]。在眾多已發現的赤霉素類激素中有生物活性的主要為GA1、GA3、GA4和GA7,作用各不相同。4類赤霉素在大百合花序分化過程中含量的變化總體趨勢是一致的:均為先低后高,在花芽分化完成時均達到最高(圖2(b))。含量上,GA3最高,GA7最低,說明GA3是起主要作用的赤霉素類激素。

玉米素核苷(ZR)是最活躍和普遍以天然形式存在的細胞分裂素,在結構上有順式玉米素核苷(cZR)和反式玉米素核苷(tZR)2種異構體,其主要作用是促進細胞分裂和膨大等,保證植株生長發育[31]。在大百合花序分化各個階段2種異構體的總體變化趨勢一致,即在花序未分化時含量較低,隨著花序分化進程含量逐漸增加,到小花原基分化期達到頂峰,之后又呈現下降趨勢(圖2(c))。

乙烯是氣體激素,在合成部位起作用,不被運轉;但是其前體1-氨基環丙烷羧酸(ACC)在植物體內能夠被運輸,因此有學者認為ACC才是激素[29]。在有氧條件下,ACC含量多少決定了生成乙烯的含量。大百合花序發育過程中ACC含量的變化如圖2(d)所示,在花序分化初期,ACC含量最高且與其它階段差異極顯著;隨著花序發育,ACC含量呈下降趨勢,在雄蕊和雌蕊分化期含量最低,且與其它階段差異極顯著。

茉莉酸(JA)普遍存在于高等植物中,是一類在植物體內起全局調控作用的生長調節物質,通常分布于植物的幼嫩組織和發育的生殖器官中,通過信號傳導途徑主要調節植物生長發育進程以及植物防御系統[32]。大百合花序分化過程中可以看到JA含量呈明顯下降趨勢,在花序未分化時最高,與其它階段具有極顯著差異;從花序分化初期含量顯著下降,分化過程中各階段含量無顯著差異(圖2(e))。

水楊酸(SA)是植物體內廣泛存在的一種天然酚類化合物,是重要的內源信號分子,其不僅能夠調節植物的生長發育過程,還具有提高植物抗逆性的作用,誘導植物產生抗逆性以抵抗不良因素造成的傷害[33]。在大百合花序分化過程中SA變化如圖2(f)所示:在苞片原基分化期,SA含量最高,與其它時期具有極顯著差異;而其它幾個分化時期之間則無顯著差異。

2.2.2大百合花序分化過程中內源激素的平衡

在大百合花序分化過程中,3種內源激素比值變化詳見圖3。IAA/GA3與cZR/GA3的動態趨勢基本一致,呈明顯的單峰曲線變化趨勢,均在花序原基分化初期達到一個峰值,而隨后趨于穩定。表明高比值的IAA/GA3、cZR/GA3與大百合的花芽分化密切相關,且有利于大百合從營養生長向生殖生長轉換。IAA/cZR在分化過程中出現了2個峰值,分別是花序原基分化初期和花芽分化完成階段,推測IAA/cZR在花序分化的初期和花芽分化完成期都起到了重要調節作用。

圖3 大百合花序分化過程中3種內源激素比值變化

2.3 大百合花序分化過程中營養物質的動態變化

2.3.1可溶性糖與可溶性蛋白含量變化

糖和蛋白質都是植物體內重要的有機物,是植株生長發育的物質基礎。糖為植物提供能量來源,也是代謝中間體[34];蛋白質是構成細胞和生物體結構的物質,可溶性蛋白是重要的營養物質和滲透調節物質[35]。大百合花序分化過程中可溶性糖與可溶性蛋白含量變化如圖4所示。可溶性糖含量總體呈上升趨勢,僅在花被片分化期略有下降,推測此階段為多個小花的花器官分化期,對可溶性糖的消耗較大;可溶性蛋白含量整體呈下降趨勢,在未分化期最高,在分化過程中花被片分化期較高,推測在花序和花芽分化過程中需要大量的可溶性蛋白供給花器官的形態建成,在花芽分化完成后可溶性蛋白含量則顯著下降。

圖4 大百合花序分化過程中可溶性糖 與可溶性蛋白質量分數變化

作為植物生長發育的能量來源及調控因子,可溶性糖與可溶性蛋白在大百合花序分化過程中含量的變化趨勢是相反的。在未分化期,可溶性糖含量最低,而可溶性蛋白含量最高;在花芽分化完成期,可溶性糖含量達最高,可溶性蛋白含量則為最低,說明二者在大百合花序分化過程中存在一定平衡關系。

2.3.2內源激素與營養物質相關性分析

在大百合花序分化過程中,各內源激素與營養物質含量的相關系數如表1所示,IAA、GAs和ZR含量都與可溶性糖含量呈正相關,與可溶性蛋白含量呈負相關。其中GA3與可溶性糖和可溶性蛋白含量的相關系數均為最高,分析GA3在與營養物質協同作用促進花序分化過程中起著積極作用。ACC和JA則與之相反,二者與可溶性糖含量呈負相關,與可溶性蛋白含量呈正相關。SA含量與營養物質含量幾乎不相關,推測可能是SA主要參與植株的抗逆性,特別是與低溫脅迫導致的抗寒性有關,與花芽分化關系不大。

表1 大百合花序分化過程中內源激素含量與 營養物質含量的相關系數

3 討論與結論

3.1 大百合花芽分化過程

從營養生長階段到生殖生長階段的轉變,是植物發育變化的關鍵過程,有些植物則是營養生長和開花同時進行,大白合的花序分化發生在地上部分休眠期,與很多鱗莖植物如百合和番紅花等相似[20,36]。本研究明確了大百合花序分化的進程,根據其形態特點劃分為6個階段:花序未分化期、花序原基分化初期、苞片原基分化期、小花原基分化期、花被片分化期和花芽分化完成期。研究發現大百合花序分化過程中不同位置小花的發育存在漸趨同步的特點,即小花發育早期由于發育時序不同,小花原基大小存在差異,但是到了花芽分化完成期小花的大小基本達到一致。這個現象在與其近源的百合、郁金香和豹子花等物種的研究中未見報道,相關分子機制有待進一步研究。

此外,后期物候觀測顯示,同一來源和批次的大百合種球,開花后每個花序的平均花朵數明顯少于取樣時觀察到的小花原基數量,推測在后期生長發育過程中伴隨著花序基部小花退化的情況存在,具體原因還需要持續觀察與探索。

3.2 內源激素與大百合花芽分化的關系

內源激素在植物成花與花形態構建過程中起著重要作用,是植物花序(芽)分化的關鍵誘導因子之一,對莖端分生組織由營養生長向生殖生長轉變具有重要的調控作用。內源激素的含量以及激素間平衡與成花過程密切相關[37]。大百合花序發育過程中,IAA和GAs總體呈上升趨勢,表明高水平IAA和GAs有利于花序以及花器官的分化,這與對石蒜和百合等植物的研究結果一致[38-39]。有研究表明GAs幾乎對每輪花器官發育都有一定的調控作用[30],特別是雄蕊的發育需要更高的GAs含量[40],本研究結果也驗證了這一結論。ZR和SA為先上升后下降的單峰變化,分析二者在分化中期起到較為積極的調控作用;特別是ZR在小花原基分化期達到峰值,推測其對花器官細胞的分裂和增大起到了重要作用。ACC和JA總體呈下降趨勢,在花序未分化期二者含量較高,可能與低溫脅迫導致的抗寒性及休眠有關,花序分化后ACC與JA含量降低推測可能是解除了對花序(芽)發育的抑制作用。

花序(芽)分化過程中形態的變化不僅受到激素含量的影響,同時也與激素之間的平衡有重要關系[41]。大百合花序分化過程中IAA/GA3和cZR/GA3的變化趨勢一致,均在花序分化初期達到峰值,分化過程比較穩定,表明高比值的IAA/GA3與cZR/GA3有利于促進大百合從營養生長向生殖生長轉換;IAA/cZR在花芽分化完成期達到峰值,在花序原基分化初期為次峰值,推測其對植株發育階段的轉變起著重要調節作用。總體看來,細胞分裂素對苞片原基和小花原基等新器官的形成起重要作用,而生長素和赤霉素在花芽分化后期形態建成作用更顯著。

3.3 營養物質與大百合花芽分化的關系

花序(芽)分化過程中需要消耗大量的營養物質。有研究顯示,碳水化合物是完成花形態建成的重要物質基礎[42-43]。可溶性糖是花芽分化過程中可以直接運輸和利用的養分形式,是植物生長發育的能量基礎,糖及其代謝物對植物的成花具有調節作用[34]。大百合花序分化過程中可溶性糖含量總體呈上升趨勢,在小花原基分化期達到一個高峰,說明較高水平的可溶性糖含量可以促進大百合花序和花芽的分化與發育,這與西紅花等球根花卉的花芽發育規律相似[44]。可溶性蛋白是花器官形態建成的重要物質基礎,在花芽分化時需要較大量。大百合花序分化過程中可溶性蛋白始終保持較高的含量,說明其需要大量的蛋白質供給花器官的形態建成。一般情況下,組織細胞代謝活性旺盛則可溶性蛋白的含量會較高,本研究結果顯示可溶性蛋白的含量整體呈下降趨勢,尤其是花芽分化后期,推測可能此階段細胞體積迅速增加的速率大于可溶性蛋白的增加速率而導致這一現象。可溶性糖與可溶性蛋白含量的變化趨勢完全相反,推測在有限的營養物質中,二者通過平衡關系來調控成花的過程。

大百合是東亞特有植物,也是我國具有特色的野生球根花卉之一。本研究明確了大百合花序及花芽分化進程以及形態特征,了解了大百合花序分化過程中內源激素和營養物質的變化規律,為大百合生物學特性及成花機理研究提供了基礎資料,同時可作為大百合花期調控的參考依據。大百合屬于溫度敏感型植物,其花序分化的具體時間及每個發育階段持續的長度與溫度有一定關系,相關規律還需進行深入探究。

感謝中國科學院植物研究所孔宏智研究員、姜闖道研究員和傅學浩博士在研究過程中給予的指導與幫助。