高效毛細管電泳法檢測淡水魚肉中阿莫西林和氨芐西林殘留方法的建立

孫雪峰　王方雨

摘 要：為建立一種基于高效毛細管電泳技術、可同時高效檢測淡水魚肉中阿莫西林和氨芐西林殘留的高通量檢測方法，選用鰱魚作為淡水魚的代表，以空白魚肉為試材，使用二極管陣列檢測器進行檢測。結果表明：樣品經乙腈提取、旋轉蒸發儀濃縮、固相萃取柱萃取后，在pH 7.85的30 mmol/L硼砂溶液緩沖體系中，檢測波長210 nm、檢測電壓20 kV、檢測溫度25 ℃的電泳條件下，阿莫西林和氨芐西林在20 min內能夠實現基線分離；在0.02～10.00 μg/mL質量濃度范圍內，阿莫西林和氨芐西林的峰面積與質量濃度之間呈線性相關，相關系數（R2）均大于0.990；阿莫西林在淡水魚肉中的加標回收率為78.90%～85.72%，日內變異系數小于8.01%，氨芐西林在淡水魚肉中的加標回收率為75.36%～86.34%，日內變異系數小于8.06%。

關鍵詞：高效毛細管電泳；阿莫西林；氨芐西林；殘留

Establishment of a High Performance Capillary Electrophoresis Method for the Determination of

Amoxicillin and Ampicillin Residues in Freshwater Fish

SUN Xuefeng， WANG Fangyu*

（Key Laboratory of Animal Immunology， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450000， China）

Abstract： This study established a high-throughput method for the simultaneous and efficient detection of amoxicillin and ampicillin residues in silver carp as a representative of freshwater fish using high performance capillary electrophoresis （HPCE） with a diode array detector. Samples were extracted with acetonitrile， concentrated by rotary evaporation and cleaned up using a solid phase extraction （SPE） column. The capillary column was washed with 30 mmol/L borax buffer solution at pH 7.85. The detection wavelength， voltage and temperature were set at 210 nm， 20 kV and 25 ℃， respectively. Baseline separation of amoxicillin and ampicillin was accomplished within 20 min. The peak area of amoxicillin and ampicillin showed a linear correlation with their concentrations in the range of 0.02–10.00 μg/mL， with correlation coefficients （R2） greater than 0.990. The recoveries of amoxicillin and ampicillin spiked in freshwater fish were 78.90%–85.72% and

75.36%-86.34%， respectively， with within-day coefficient of variation （CV） less than 8.01% and 8.06%， respectively.

Keywords： high performance capillary electrophoresis; amoxicillin; ampicillin; residue

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20221109-149

中圖分類號：TS251.7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2023）06-0029-05

引文格式：

孫雪峰， 王方雨. 高效毛細管電泳法檢測淡水魚肉中阿莫西林和氨芐西林殘留方法的建立[J]. 肉類研究， 2023， 37（6）： 25-33. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20221109-149.? ? http：//www.rlyj.net.cn

SUN Xuefeng， WANG Fangyu. Establishment of a high performance capillary electrophoresis method for the determination of amoxicillin and ampicillin residues in freshwater fish[J]. Meat Research， 2023， 37（6）： 25-33. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20221109-149.? ? http：//www.rlyj.net.cn

隨著經濟的發展、收入的增加及飲食健康意識的逐步增強，消費者對蛋白質的需求也越來越大，水產品作為谷類和牛乳以外的主要蛋白質來源，其占人類需求總蛋白質和動物蛋白質的比例分別達到6.5%和16.4%。

2018年據聯合國糧食及農業組織統計，水產養殖已成為全球食品方面增長最快的蛋白質提供源，平均以每年8%的速率持續增長。據統計，2021年，我國水產品總產量達到6 463 萬t，其中人工養殖水產品產量高達5 388 萬t，人工養殖水產品總產量遠超天然生產水產品產量，也是全球唯一的人工養殖水產品產量超過天然生產水產品產量的國家[1]。隨著人工養殖水產品產量的增加，水產品的安全問題逐漸凸顯。我國作為水產養殖大國有多種養殖模式，但人工養殖的整體特點是生產密度高，該模式導致獸藥殘留成為影響動物源性水產品質量安全的關鍵。

阿莫西林和氨芐西林作為2 種常見易得的β-內酰胺類抗生素在水產養殖過程中疾病預防與臨床治療上使用非常廣泛。截至到2019年，除了美國、加拿大和澳大利亞對動物源水產品肉中阿莫西林、氨芐西林的最大殘留限量（maxium residue limit，MRL）未作規定外，中國、國際食品法典委員會、歐盟、海灣阿拉伯國家合作委員會、韓國、智利和新西蘭等國家、地區和國際組織對動物源性水產品中的阿莫西林、氨芐西林等β-內酰胺類藥物的MRL均進行了限定，雖然各個國家、地區和國際組織對動物源性水產品的具體種類或組織部位要求不盡相同，但是阿莫西林的MRL和氨芐西林的MRL一致，均為50 μg/kg[2]。

目前，獸藥殘留的檢測方法主要有高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[3-4]、氣相色譜-質譜聯用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[5-6]、LC-MS法[7-10]、毛細管法[11-14]等。農業部和出入境檢驗檢疫部門針對阿莫西林和氨芐西林的殘留現行的檢測方法主要有GC-MS、HPLC、放射受體分析法、免疫膠體金法和酶聯免疫法等。本研究建立了一種高效毛細管電泳分離法，使用二極管陣列檢測器同時對淡水魚肉中阿莫西林和氨芐西林的殘留進行檢測，為淡水魚肉中阿莫西林和氨芐西林的獸藥殘留檢測提供一種新的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淡水鰱魚肌肉組織（10 份） 浙江海洋水產養殖研究所。

阿莫西林標準品（純度87.0%）、氨芐西林標準品（純度85.6%） 中國獸醫藥品監察所；氫氧化鈉、四硼酸鈉、磷酸二氫鈉（均為分析純）、乙腈（色譜純）? ?國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

7100毛細管電泳儀（配備二極管陣列檢測器） 美國安捷倫科技公司；Heraeus Multifuge×1R高速冷凍離心機 熱電實驗設備有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀 上海亞榮生化有限公司；Scientz-48 L組織研磨器、冷凍型高通量組織研磨器 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

1.3.1.1 標準儲備液

分別稱取阿莫西林標準品114.94 mg、氨芐西林標準品116.82 mg，用水溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中，置于4 ℃冰箱保存，備用。

1.3.1.2 緩沖溶液

30 mmol/L四硼酸鈉緩沖溶液：稱取適量的十水四硼酸鈉，按照30 mmol/L的濃度，加水溶解，并用20 mmol/L稀鹽酸溶液調節pH值為7.85，用0.22 μm水系濾膜過濾，備用。用前超聲波脫氣5～10 min。

1.3.2 毛細管預處理

開機用1 mol/L NaOH沖洗5 min，等待5 min，超純水沖洗5 min，30 mmol/L四硼酸鈉緩沖溶液沖洗5 min，20 kV預電泳20 min；2 次運行之間采用0.1 mol/L NaOH、超純水和30 mmol/L四硼酸鈉緩沖溶液分別沖洗毛細管各5 min，以保證良好的重現性。

1.3.3 樣品的采集和處理

選用鰱魚作為淡水魚的代表，進行實驗。稱取空白勻漿魚肉組織1.000 g于5 mL潔凈離心管中，加入混合標準溶液1.00 mL，漩渦振蕩后4 ℃冰箱放置30 min，加入pH 7.85的0.01 mmol/L磷酸二氫鈉溶液1.00 mL，渦旋振蕩提取后，放入冷凍離心機中，5 500 r/min離心20 min。移取上清液至另一個5 mL潔凈離心管中，加入乙腈1 mL，渦旋振蕩，放入冷凍離心機中5 500 r/min離心20 min。取上清液50 ℃旋轉蒸發干燥后，再用2.0 mL超純水溶解，得樣品提取液。

取MCX固相萃取柱，先用3 mL超純水淋洗活化，取樣品提取液，以1 滴/s的流速過柱，用3 mL超純水淋洗，收集洗液，再用3 mL體積分數80%乙腈水溶液進行洗脫，收集洗脫液；將收集的洗液和洗脫液50 ℃水浴蒸干，用1 mL超純水溶解，過0.22 μm微孔濾膜，4 ℃保存備用。

1.3.4 高效毛細管電泳法檢測波長和電泳條件的選擇

檢測波長的選擇：分別取配制好的質量濃度10.00 μg/mL阿莫西林標準溶液、10.00 μg/mL氨芐西林標準溶液、10.00 μg/mL阿莫西林和氨芐西林混合標準溶液，于波長190～220 nm下進行紫外掃描，依照毛細管電泳波長選擇的原則，在基質不干擾的情況下取最大靈敏度時的波長。

電泳條件的選擇：在確定的檢測波長下，根據文獻[15-18]報道，以及阿莫西林和氨芐西林毛細管電泳圖譜基線的平穩度、藥物分離度、峰形的好壞等對電泳條件進行篩選，包括緩沖體系、緩沖體系的pH值、電壓和分離溫度的選擇。

1.3.5 標準曲線的繪制

按實驗方法對0.02、0.10、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 μg/mL的2 種藥物混合標準溶液進行測定。每個質量濃度重復測定3 次取平均值，以峰面積（y）對質量濃度（x，μg/mL）作線性回歸曲線。

1.3.6 靈敏度測定

取空白魚肉樣品，設7 個平行，按照1.3.4節選定檢測波長和設定電泳條件進行檢測，以連續測定空白樣品溶液響應值的3 倍標準偏差所對應的峰面積代入藥物標準曲線回歸方程計算出的藥物含量作為檢測限；以連續測定空白溶液響應值的10 倍標準偏差所對應的峰面積代入相應標準曲線回歸方程計算出的藥物含量作為定量限。

1.3.7 準確度與精密度測定

將不同質量濃度的標準工作液按樣品處理方法添加到空白勻漿魚肉組織，使組織中各個藥物的加標量分別為20、40、100、200 μg/kg，進行添加回收實驗，每個加標量做5 個平行，根據峰面積計算藥物含量，從而求得加標回收率和日內變異系數。

1.4 數據處理

利用Microsoft Office Excel（2010版）軟件對實驗數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 高效毛細管電泳法檢測波長和電泳條件的選擇

2.1.1 高效毛細管電泳法檢測波長的選擇

依照毛細管電泳波長選擇的原則，在基質不干擾的情況下取最大靈敏度時的波長，故選擇210 nm為檢測波長，所得毛細管電泳圖如圖1～3所示。

2.1.2 高效毛細管電泳法電泳條件的選擇

緩沖體系的選擇：考察15、20、25、30、35 mmol/L的四硼酸鈉緩沖液，硼酸鹽濃度較低時，各藥物出現前沿峰，且基線不能分離；隨著硼酸鹽濃度的增加，藥物的遷移時間延長，峰形較好，且基線分離，最終選用30 mmol/L四硼酸鈉緩沖液作為檢測的緩沖體系。

緩沖體系pH值的選擇：用稀鹽酸溶液將30 mmol/L四硼酸鈉緩沖溶液的pH值分別調至6.6、7.0、7.4、7.85、8.2、8.4，pH值較低時，分離效果好，但出鋒時間較長，最長達40 min；pH值較高時，出鋒時間縮短，最終選擇緩沖溶液的pH值為7.85，阿莫西林和氨芐西林的峰形較好，基線分離，且出峰時間在10 min以內。

電壓的選擇：考察16、18、20、22、24 kV等電壓對阿莫西林和氨芐西林分離度的影響，峰高隨著電壓的增大而增高，但電壓過高會導致基線不穩，且峰形變差。因此，選擇電壓為20 kV，阿莫西林和氨芐西林的響應值達25 mAU，基線穩定，峰形較好。

分離溫度的選擇：考察不同分離溫度（15、20、25、30 ℃）對阿莫西林和氨芐西林分離的影響，結果顯示，藥物的遷移時間隨著分離溫度的升高而縮短，分離溫度過高會影響藥物分離度，降低分離溫度會導致分離時間延長，而增大分離溫度會導致峰形和分離度變差。故選擇分離溫度為25 ℃，遷移時間較短，且峰形和分離度較好。

最終確定高效毛細管電泳法檢測波長和電泳條件為：在pH 7.85的30 mmol/L四硼酸鈉溶液緩沖體系中，檢測波長210 nm，運行電壓20 kV，溫度25 ℃，壓力進樣5 kPa、5 s。

2.2 標準曲線

阿莫西林和氨芐西林2 種抗生素7 個質量濃度的混合標準樣品，在選定的電泳條件下測定，得到阿莫西林回歸方程為y=1.446 1x＋0.346 1（R2=0.997 5），氨芐西林回歸方程為y=1.569 5x＋1.045 9（R2=0.993 9）。結果表明，在0.02～10.00 μg/mL時各藥物的峰面積與質量濃度之間呈線性相關，R2均大于0.990。

2.3 靈敏度

根據7 個空白魚肉樣品的基線噪音平均值，按信噪比（RS/N）=3為檢測限，RS/N=10為定量限，得到阿莫西林檢測限為20 μg/kg，氨芐西林檢測限為30 μg/kg，阿莫西林定量限為30 μg/kg，氨芐西林定量限為40 μg/kg?？瞻佐~肉和添加藥物的空白魚肉毛細管電泳圖譜見圖4～5。在空白魚肉樣品中添加藥物后，因魚肉樣品中成分比較復雜，導致2 種藥物的遷移時間與標準樣品相比也略微后移，但是遷移時間小于1 min，整體不影響檢測結果。

2.4 準確度與精密度

由表1可知：阿莫西林在淡水魚肉中的加標回收率為78.90%～85.72%，日內變異系數小于8.01%；氨芐西林在淡水魚肉中的加標回收率為75.36%～86.34%，日內變異系數小于8.06%。

3 結 論

高效毛細管電泳結合了電泳技術與現代微柱分離技術，已成為化學分析方面新興的一個分支學科，是20世紀90年代以來發展最快的分析方法之一[19-20]。相比HPLC法，它具有以下優點：1）分析時間短，分離效率高；2）檢測樣品用量少，檢測過程中樣品用量僅為HPLC儀的幾百分之一；3）樣品選擇性很大，可以根據樣品的分子性質，如大小、電荷數、手性、疏水性等對樣品進行有效分離。毛細管電泳法已經廣泛應用于藥物含量檢測[21-22]、肉中的非法添加藥物檢測[23-25]、食品質量控制[26-28]、口服液中甜味劑和防腐劑檢測[29]、食品和水中藥物殘留[30]、化妝品[31]、真菌毒素[32]和動物疫病[33]等領域的檢測。

本研究建立一種基于高效毛細管電泳技術、可同時高效檢測淡水魚肉中阿莫西林和氨芐西林殘留的高通量檢測方法，選用鰱魚作為淡水魚的代表，以空白魚肉為試材，使用二極管陣列檢測器進行檢測，在給定的條件下阿莫西林和氨芐西林在20 min內可實現基線分離。此外，該方法的檢測限和定量限也滿足樣品檢測的需求，為淡水魚肉中阿莫西林和氨芐西林殘留的檢測提供了一種新的借鑒模式。

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收稿日期：2022-11-09

基金項目：“十三五”國家重點研發計劃重點專項（2019YFC1605701）

第一作者簡介：孫雪峰（1981—）（ORCID： 0000-0002-7943-6442），女，高級獸醫師，碩士，研究方向為生物技術與食品安全。

E-mail： sunxuefeng2021@126.com

*通信作者簡介：王方雨（1978—）（ORCID： 0000-0002-4791-5916），男，研究員，博士，研究方向為生物技術與食品安全。

E-mail： 13938559288@126.com