生姜枯萎病致病菌的鑒定與生物藥劑篩選

范天宇 朱書興 繆才凌 楊秋華 李鑫 孫向成 黃科

摘要 ［目的］探明生姜幼苗枯萎病致病菌與生物藥劑篩選。［方法］通過形態學鑒定與ITS系統發育樹分析，并進行回接與生物防治試驗。［結果］菌株zj1在PDA培養基上菌落圓形、乳白色，分生孢子鐮刀狀；基于ITS構建的進化樹，菌株zj1鑒定為Fusarium graminearum；致病菌回接生姜幼苗后，引發生姜葉片失綠，與田間原發病癥一致。F.graminearum在10～30 ℃均能生長，在 25～30 ℃生長效果較好；殺菌劑春雷霉素與農用鏈霉素對致病菌均有毒力，EC50分別為15.08與343.32 mg/L，盆栽試驗結果相對防效為55.78%與51.23%。［結論］引起重慶榮昌生姜枯萎病的致病菌是禾谷鐮刀菌，有效成分6%春雷霉素和72%農用鏈霉素均能對禾谷鐮刀菌有很好的防治效果。

關鍵詞 生姜；枯萎病；禾谷鐮刀桿菌；生物藥劑

中圖分類號 S 436.32? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2023）12-0124-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.12.029

Identification and Biological Control of the Pathogens of Leaves Yellows in Ginger

FAN Tian-yu1，2，ZHU? Shu-xing1，2，MIAO? Cai-ling1，2 et al

（1.College of Biology and Food Engineering，Chongqing Three Gorge University， Chongqing 404120;2.College of Landscape Architecture and Life Science（Institute of Special Plants），Chongqing University of Arts & Sciences，Chongqing 402160）

Abstract ［Objective］To explore pathogens of Fusarium wilt of ginger seedlings and screen biological agents.［Method］Morphological identification and ITS multi-gene phylogenetic analysis were used to identify the species of pathogens.Furthermore，pathogens inoculation and prevention tests were also performed.［Result］The morphological results showed the colony of pathogens was round，milky white on PDA medium and the macroconidiums were sickle shape.The strain of zj1 was identified as Fusarium graminearum based on the evolutionary tree constructed by its ITS gene sequences.The leaves were chlorisis，which was similar with symptoms in filed after ginger seedlings inoculated by pathogen spores suspension.On top of that，F.graminearum proliferated from 10 to 30 ℃and the best proliferation temperature was both on 25 and 30 ℃.Both kasugamycin and streptomycin biocides had virulence effect on F.graminearum and the value of EC50 was 15.08 and 343.32 mg/L，respectively.Meanwhile the relative controlling effect of kasugamycin and streptomycin arrived 55.78% and 51.23%.respectively in greenhouse pot test.［Conclusion］F.graminearum was the cause agent of ginger Fusarium wilt in Rongchang.Effective ingredients of 6% Kasugamycin and 72%? streptomycin biocides were effective prevention on F.graminearum.

Key words Ginger;Fusarium wilt;F.graminearum;Biological agents

基金項目 重慶市人力資源和社會保障局項目“基于“魯中大姜” 新品種應用的鄉村振興實用人才培訓”（2021-388-4）。

作者簡介 范天宇（1994—），女，四川達州人，碩士研究生，研究方向：食品加工。 *通信作者，副教授，博士，從事經濟植物栽培與病害綠色防控研究。

收稿日期 2022-12-09

生姜（Zingiber officinale Roscoe）是藥食同源植物。生姜無性繁殖過程中易累積大量細菌、真菌、蟲卵等致病微生物，導致生姜在儲藏、生產過程中易發生腐爛、細菌性枯萎、葉斑等病癥［1-2］。生姜枯萎病的主要致病菌是鐮刀桿菌（Fusarium spp），其病癥是生姜葉緣發黃、卷曲，并逐漸擴展到整個葉片［3-4］。鐮刀桿菌通過種傳（seed-born）和土傳（soil-born）在宿根中不斷累積，在生姜繁殖時發生病癥，新生幼芽黃萎、無活力甚至壞死［5-6］。鐮刀桿菌（Fusarium spp.）是重要的植物病原菌，寄主范圍廣，還能引起其他寄主發生萎蔫、根腐、穗腐、莖腐等病害［7-8］。

長江上游的四川東部、重慶等地是生姜主要栽培區，在調查該區域生姜病害時發現生姜出芽后，葉緣發黃、卷曲，植株缺乏活力，發育遲緩，隨著病癥加深，整葉失綠、黃化，病癥嚴重的葉片枯萎，植株頂端枯死，給當地姜農造成嚴重損失。為查明重慶生姜葉黃病的致病原因，筆者從病癥植株中分離、鑒定潛在的致病菌，并通過回接試驗檢測其致病力，然后篩選常用的生物藥劑，旨在為生姜枯萎病的綠色防控提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株的分離與純化

枯萎病癥生姜葉片采集自榮昌區盤龍鎮生姜主栽培區。病癥樣品用清水沖洗，去除表面污漬，在病、健交界處剪取2～3 mm長的病組織，然后用無菌水沖洗2 min，重復3次，用0.6% NaClO浸泡3 min，用無菌水沖洗5 min，重復3次，經無菌濾紙吸干，移至PDA固體培養基（100 g馬鈴薯濾液， 葡萄糖 10 g， 瓊脂粉 12 g），25 ℃培養5 d，每天觀察并記錄菌落形態。純化菌落編號并在PDA平板連續培養3代，純化菌株儲藏于終濃度15 %的甘油中-80 ℃保存。

1.2 菌株的致病性鑒定

生姜種植于40 cm×40 cm 營養缽中，發育60 d 后，植株高度約31 cm，約8 片真葉。生姜發育過程中使用有效成分43%的福菌·肟菌酯（氟吡菌酰胺21.5%，肟菌酯21.5%）1 500倍稀釋噴霧，接種前15 d，停止用藥。純化菌株置于PDA培養基，25 ℃培養7 d，制備濃度為105 CFU/mL的孢子懸液，噴霧接種于盆栽生姜葉片。噴霧后，每天觀察生姜發育情況，每間隔5 d 統計植株發病率與病情指數。病株分級標準參考文獻［6］執行。0級為健康植株，葉片無病癥；1級為葉片10%以下區域出現黃化；2級為葉片25 %以下區域出現黃化；3級為葉片50 %以下區域出現黃化；4級為葉片75 %以下區域出現黃化；5級為葉片75%以上區域出現黃枯、壞死。病情指數 =（各級病葉數×相對級別葉數）/（檢查總葉片數×5）×100。

1.3 菌株ITS序列分析

提取病原菌總DNA并以其為模板，真菌通用引物ITSl （5′-TCCGTAGGTAACCTGCGG-3′）;ITS4 （ 5′-TCCTCCGCTTAT- TGATATGC-3′）為引物，利用PCR擴增技術擴增病原菌ITS核酸片段，引物由上海生物有限公司合成。PCR擴增反應體系：總體積為25 μL，引物ITS1/ITS4 0.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L） 2.5 μL，10×PCR Buffer（含MgCl2 25 mmol/L） 2.5 μL，DNA模板1.0 μL，TaqDNA酶（5 U/μL）0.5 μL，ddH2O 17.5 μL，擴增條件以標準PCR擴增條件為準。利用軟件對擴增后的ITS序列，在美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI，http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行同源性分析，用ClustalX1.83與MEGA5［9］軟件采用Neighbor-Jonining［10］法構建系統發育樹以更直觀地表示其同源關系。尖孢鐮刀桿菌（F.oxysporum，MH911386.1）作為外群。

1.4 溫度對F.graminearum生長特性的影響

取活化后長勢較好的菌株，用直徑8 mm的打孔器將菌落接種到PDA平板培養基中央，每個平板接1塊菌餅，并設置3個重復。分別放置于（10±1）、（15±1）、（20±1）、（25±1）、（30±1）℃的培養箱中培養。每天用垂直十字交叉法測量菌落直徑，最后取平均值［11］。在培養箱中培養后測量得出的菌落直徑減去菌餅的直徑即為菌落的直徑，菌落直徑再除以天數即是菌絲每天的生長速度。菌落生長速率=（菌落直徑-菌餅直徑）/天數［12］。

1.5 殺菌劑對菌絲生長的抑制試驗

選擇田間常用的6%春雷霉素和72%農用鏈霉素（華北制藥股份有限公司），并采用菌絲生長速率測定法［13-14］檢測2種生物殺菌劑對致病菌菌絲的生長抑制率。在50 ℃的PDA培養基中加入春雷霉素或農用鏈霉素，以不加藥劑的平板作為對照，并在PDA培養基中加入60 μg/mL的氨芐青霉素抑制細菌生長。春雷素的濃度分別為6、12、18、24 mg/L；農用鏈霉素的濃度分別為33.6、100.8、168.0、235.2 mg/L。用直徑8 mm的打孔器將菌落接種到不同濃度的春雷霉素和農用鏈霉素的PDA培養基上，25 ℃培養，每次試驗重復3次。2 d 后，得到不同大小的菌落，用十字交叉法測量菌落生長直徑，并計算抑菌率，抑菌率=（空白對照菌絲-8）-（藥劑菌絲-8）/（空白對照菌絲-8）。將抑菌率換算成抑制概率值，將抑制概率值作為因變量（y），藥劑質量濃度轉換為10為底的對數值為自變量（x），做回歸直線，求出毒力回歸方程和相關系數，并運用最小二乘法計算EC50［15-16］。

1.6 盆栽防效試驗

生姜宿根50 g種植于36? cm×40 cm 營養袋60 d后，植株發育高度約32 cm，萌發7～8葉。 制備105 CFU/mL 的孢子懸液侵染生姜幼苗，對照組用無菌清水噴霧。噴霧5 d后，使用濃度為18 mg/L的春雷霉素與340 mg/ L的農用鏈霉素素每間隔7 d 用藥一次，連續用藥3次，在最后1次用藥14 d后調查發病情況，計算相對防治效果=（對照病情指數-處理病情指數）/對照病情指數×100%［17-18］。

1.7 數據分析 采用Excel軟件和Origin2019b軟件對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 病原菌分離鑒定

從葉片失綠、黃化，植株缺乏活力，發育遲緩的植株葉片（圖1A）中分離致病菌（zj1）。致病菌（zj1）在PDA培養基培養后，形成圓形、乳白色菌落（圖1B），菌落背面產生紅色色素，菌絲稀松，絨毛狀，分生孢子鐮刀狀，多數分生孢子3隔，產生球形孢囊（圖1C）。

2.2 ITS序列分析結果

將PCR擴增產物進行純化后進行基因組的測序再用軟件進行比對分析，結果顯示，供試菌株的ITS序列（ 2248417 ）與F.graminearum（MH681145.1）的同源性達99.5%。然后通過MEGA 4.1 軟件中的neighbor joining方法（鄰接法）建立菌株zj1的系統發育樹（圖2），根據菌落形態檢測及ITS序列分析分離、鑒定的菌株zj1為禾谷鐮刀菌屬（F.graminearum）。

2.3 溫度對F.graminearum 生長的影響 將F.graminearum在10、15、20、25、30 ℃時培養，測量菌絲生長速率，F.graminearum在10、15和20 ℃生長相對較慢；在25、30 ℃時生長顯著增加，在檢測的5 d內，菌落在第3天生長速率最快，在30 ℃生長速率1.44 cm/d高于25 ℃的1.31 cm/d（P<0.05）；在第4天和第5天生長速率下降，此時，F.graminearum生長速率差異不顯著（P>0.05）（圖3）。

2.4 回接試驗致病性

將致病菌回接盆栽生姜幼苗，侵染早期5 d后，部分葉片出現黃色斑點，隨著侵染加深，病灶擴展，病癥加深，葉片上形成多個病斑，葉緣卷曲、整個葉片枯黃、部分葉片掉落，接種無菌清水生姜葉片，未見葉片枯黃發病癥狀（圖4A）。在調查40 d內發病率和病情指數均增加；發病率由5 d 的8.5%增加到40 d的97.7%，發病率在10～35 d顯著增加，35～40 d變化不顯著（圖4B）。病情指數由5 d 的5.0增加到40 d的36.5，病情指數在10 ～30 d顯著增加，30～40 d變化不大（圖4C）。對病癥中致病菌進行分離、培養，形態特征鑒定為鐮刀桿菌。

2.5 生物藥劑對F.graminearum的毒力與防效

采用的2種生物殺菌劑對禾谷鐮刀桿菌平板毒力抑制試驗表明，6%春雷霉素和72%農用鏈霉素對F.graminearum均有毒力（表1），6%春雷霉素的EC50為15.08 mg/L。72%農用鏈霉素的EC50為343.32 mg/L。盆栽藥效試驗表明，18 mg/L 6%春雷霉素對盆栽60 d生姜幼苗葉黃病的防效比340 mg/L 72%農用鏈霉素的防效高（P<0.05），分別為55.78%和51.23%。

3 結論與討論

該研究從生姜枯萎病葉片中分離了1株禾谷鐮刀桿菌，禾谷鐮刀桿菌不僅能引起谷類作物如小麥赤霉病、玉米莖腐病，還能產生大量毒素威脅人畜健康［19-21］。因此，研究生姜枯萎病的病原菌及其生物藥劑篩選既可促進生姜安全生產，又可提高食品安全。

溫度對F.graminearum的生長特性研究表明，在10～30 ℃培養條件下，F.graminearum的生長速度隨溫度的升高而加快，25與30 ℃生長速率較快，這與茄病鐮刀桿菌的生長特性一致［22］。而川東與重慶沿江地區生姜幼苗葉黃病的發病時期為4月下旬至5月下旬，此時該區域日間溫度均高于25 ℃，較有利于F.graminearum 在生姜中的繁殖累積。研究表明F.graminearum 在生姜宿根中累積越冬，次年栽培發育的早期，鐮刀菌在生姜體內繁殖侵染，造成植株畸形、黃葉、枯萎［5］。

F.graminearum 噴霧回接生姜幼苗后，5 d 后出現病癥，25 d 后，隨著病癥的加深，發病率和病情指數顯著上升，葉片開始出現枯萎、凋落。這一病癥與生姜細菌性枯萎病快速發病的特點不一致，生姜細菌性枯萎病暴發具有突發、快速的特點［23-24］，與鐮刀菌引發生姜的病癥及發病周期一致［5-6］。

春雷霉素和農用鏈霉素是防控真菌病害的常用生物藥劑，2種殺菌劑對F.graminearum 的菌絲生長均有抑制作用，同時2種殺菌劑在安全用藥范圍內對生姜葉黃病的盆栽防效達50%以上，可作為備選殺菌劑在田間交替使用，替代化學殺菌劑防治生姜枯萎病，達到病害綠色防控的目的，實現生姜的安全生產。

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