參豉糖蛋白提取工藝優化及纖溶活性研究

宋吉鵬 孫銀玲 丁純潔 鄭宏宇 趙娢 孫丹丹 陳麗艷

摘要 ［目的］對參豉中糖蛋白的提取工藝進行考察，并對其纖溶活性進行評價。［方法］以糖蛋白提取率為指標，通過單因素法考察緩沖液、提取溫度、料液比、提取時間和提取次數對其的影響，并運用響應面法分析優化參豉糖蛋白的提取工藝，采用蒽酮-硫酸法測定糖蛋白中多糖含量，SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳確定糖蛋白的分子量，利用瓊脂糖纖維蛋白平板法測定纖溶活性。［結果］緩沖液、提取時間和料液比對糖蛋白提取率影響較大；響應面法優化獲得參豉糖蛋白的最佳提取工藝條件為Tris-Base-NaCl緩沖溶液（pH=8.04）、料液比1∶10（g∶mL），于4 ℃提取6 h，參豉糖蛋白提取率為4.85%，其中多糖含量為12.34%；SDS-PAGE、Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳結果顯示，參豉糖蛋白分子量為4.1～27.0 kD；與豆豉糖蛋白相比，參豉糖蛋白纖溶活性提高了40.6%。［結論］經驗證利用響應面法分析測得參豉糖蛋白與模型預測值接近，可用于參豉糖蛋白的提取，且參豉糖蛋白具有較高的纖溶活性，為其進一步開發利用提供依據。

關鍵詞 參豉；糖蛋白；提取工藝；優化；響應面法；蛋白質分子量；纖溶活性

中圖分類號 R 284? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2023）12-0147-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.12.034

Study on Extraction Process Optimization and Fibrinolytic Activity of Glycoprotein from Ginseng-douchi

SONG Ji-peng，SUN Yin-ling，DING Chun-jie et al

（Heilongjiang Academy of Traditional Chinese Medicine， Harbin，Heilongjiang 150036）

Abstract ［Objective］ The extraction process of glycoprotein in ginseng-douchi was investigated，and its fibrinolytic activity was evaluated.［Method］Taking the glycoprotein extraction rate as an index， the effects of buffers， extraction temperature， solid-liquid ratio， extraction time and extraction times were investigated by one-way method， and optimize the extraction process of ginseng-douchi glycoprotein by the response surface method.The polysaccharide content in glycoproteins was determined by anthraconone-sulfuric acid method，the molecular weight of glycoproteins was determined by SDS-PAGE and Tricine-SDS-PAGE gel electrophoresis， and its fibrinolytic activity was determined by agarose fibrin plate method.［Result］ The buffers， extraction time and solid-liquid ratio had a greater impact on glycoprotein extraction rate. The optimal extraction process conditions for obtaining ginseng-douchi glycoprotein were optimized by the response surface method：Tris Base NaCl buffer solution （pH=8.04）， solid-liquid ratio 1∶10 （g∶mL）， and extracted at 4 ℃ for 6 hours，the extraction rate of ginseng-douchi glycoprotein was 4.85%， and the polysaccharide content in ginseng glycoprotein was 12.34%. SDS-PAGE and Tricine-SDS-PAGE gel electrophoresis results showed that the molecular weight of ginseng-douchi glycoprotein was 4.1-27.0 kD; compared with ginseng-douchi glycoprotein， the fibrinolytic activity of ginseng-douchi glycoprotein increased by 40.6%.［Conclusion］ After verification， the ginseng-douchi glycoprotein measured by the response surface method is close to the predicted value of the model， which can be used for the extraction of ginseng-douchi glycoprotein， and ginseng-douchi glycoprotein has a high fibrinolytic activity， which provides a basis for its application.

Key words Ginseng-douchi; Glycoprotein; Extraction process;Optimization;Response surface methodology; Protein molecular weight;Fibrinolytic activity

基金項目 國家自然科學基金項目（U20A20400）；現代農業產業技術體系建設專項（CARS-21）；黑龍江省財政專項（CZKYF-2021A002）；黑龍江省衛生健康委課題（20211313050162）。

作者簡介 宋吉鵬（1997—），男，山東青島人，碩士研究生，研究方向：中藥生物工程。

收稿日期 2022-09-29；修回日期 2022-11-23

參豉是依據《圣濟總錄》中記載的阿膠飲方，以人參和黃豆作為發酵基質，采用枯草芽孢桿菌發酵制成的新型豆豉。前期已對參豉發酵前后人參皂苷和異黃酮糖苷類成分的生物轉化進行了研究，并發現黃豆加入人參發酵后纖溶活性明顯升高，且具有降低血脂水平、調節脂質紊亂的作用［1-3］。此外，人參和黃豆中分別含有約12%和30%的蛋白質［4-5］，而蛋白質在發酵過程中易被微生物分泌的蛋白酶降解為多肽而表現更好的生理活性。研究表明，80%以上蛋白質為糖蛋白，糖蛋白是一種由多肽鏈和低聚糖鏈共價結合而成的生物大分子，具有抗凝、溶栓、降低膽固醇、抗氧化等生物活性［6］，經預試驗發現參豉糖蛋白具有較高的纖溶活性，可能為其益氣活血作用的藥效物質基礎之一。因此該研究對參豉糖蛋白的提取工藝進行優化，并對其分子量及纖溶活性進行考察，為其進一步開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1

試材。黃豆購于和糧農業有限公司，經黑龍江省中醫藥科學院王偉明研究員鑒定為豆科植物大豆［Glycine max（L.）Merr.］的干燥成熟種子；人參（5年生）購自吉林省百濟堂參業有限公司，經黑龍江省中醫藥科學院王偉明研究員鑒定為五加科植物人參（Panax Ginseng C.A.Mey.）的干燥根。

1.1.2 試劑。Tris-Base，Biosharp公司；Tris-HCl、PBS，北京中杉金橋；瓊脂糖、蛋白非預染Marker，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；纖維蛋白原，北京博奧拓達科技有限公司；凝血酶，中國食品藥品檢定研究院；BCA蛋白質定量試劑盒、小分子量蛋白凝膠制備試劑盒、高靈敏快速考馬斯亮藍染色試劑盒、SDS-PAGE變性丙烯酰胺凝膠制備試劑盒、小分子蛋白凝膠制備試劑盒、2X Tricine上樣緩沖液、蛋白非預染Marker，上海生工生物工程股份有限公司。

1.1.3 儀器與設備。FD-1D-80+型真空冷凍干燥機，北京博醫康公司；042BR10580型電泳儀，Bio-Rad公司；BSA224S-CW型電子天平，北京奧利多斯科學儀器有限公司；S210-K型pH計，美國梅特勒-托利多公司；603BR1415型凝膠成像系統，Bio-Rad公司；M200型酶聯免疫檢測儀，瑞士Tecan公司；MF3型菌落分析儀，杭州迅數科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 參豉的制備。參照孫銀玲等［7］關于參豉的制備方法，人參和黃豆的質量比為1∶10，以人參水提液浸泡黃豆，待提取液吸收殆盡，滅菌后作為發酵基質，接種枯草芽孢桿菌菌液，于28 ℃發酵96 h，即得參豉樣品，經冷凍干燥、粉碎為粗粉，采用石油醚脫脂后進行后續試驗。

1.2.2 蛋白標準曲線的繪制。采用水合茚三酮（bicinchoninic acid，BCA）法［8］測定糖蛋白的濃度，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）為標準品，倍比稀釋分別得到1 600、800、400、200、100、50、25 μg/mL的BSA系列標準溶液。按試劑盒說明操作，于562 nm波長下測定吸光度。以吸光度為縱坐標、蛋白質濃度為橫坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程為y=0.000 5x+0.096 1（R2=0.995 9）。

1.2.3

參豉糖蛋白樣品濃度的測定。用生理鹽水將糖蛋白提取液稀釋20倍，按照“1.2.2”的方法及波長檢測各樣品的吸光度，根據標準曲線計算樣品中糖蛋白濃度并計算提取率。

糖蛋白提取率=V×C×Dm×1 000×100%

式中，V為樣品溶液的總體積（mL）；C為樣品糖蛋白濃度（mg/mL）；D為稀釋倍數；m為稱取樣品質量（g）。

1.2.4 單因素考察糖蛋白提取率。

1.2.4.1 緩沖液對參豉糖蛋白提取率的影響。配制3種不同pH的緩沖溶液體系：Tris-HCl（25 mmol/L）-NaCl（50 mmol/L）（pH=5.90 mol/L）、PBS（10 mmol/L）（pH=7.30）、Tris-Base（25 mmol/L）-NaCl（50 mmol/L）（pH=8.04）。精密稱取參豉粗粉3份各1 g，分別加入3種緩沖液各10 mL，室溫浸提6 h，每15 min渦旋振搖一次，在室溫條件下于4 200 r/min離心10 min，取上清液再于4 ℃、10 000 r/min離心20 min，取上清液即為參豉糖蛋白粗提液，檢測糖蛋白濃度，計算提取率，確定最佳提取緩沖溶液。

1.2.4.2 提取溫度對參豉糖蛋白提取率的影響。精密稱取參豉粗粉3份各1 g，加入“1.2.4.1”確定的最佳提取緩沖液，其他參數不變，分別于4、25、35、45、60 ℃提取6 h，確定最佳提取溫度。

1.2.4.3 料液比對參豉糖蛋白提取率的影響。在最佳提取緩沖液和提取溫度的條件下，考察料液比1∶5、1∶10、1∶15（g∶mL）對參豉糖蛋白提取率的影響。

1.2.4.4 提取時間對參豉糖蛋白提取率的影響。根據確定的最佳提取緩沖液、提取溫度、料液比，考察提取1、6、18、24 h對參豉糖蛋白提取率的影響。

1.2.4.5 提取次數對參豉糖蛋白提取率的影響。在以上最優參數的條件下，考察提取1和2次對參豉糖蛋白提取率的影響。

1.2.5 響應面法優化參豉糖蛋白提取工藝［9］。結合單因素試驗結果，以對參豉糖蛋白提取率有明顯影響的因素為因變量，包括提取緩沖液、提取時間和料液比，結合因變量水平覆蓋單因素的試驗條件，設計三因素三水平響應面分析試驗（表1），篩選參豉糖蛋白最佳提取工藝。所有數據均為3次重復的平均值，利用Excel 2007進行數據統計分析［10］。

1.2.6

糖蛋白提取液中多糖含量測定［11］。精密稱取105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖標準品10 mg，配制0.1 mg/mL葡萄糖標準品溶液，稀釋為濃度0、0.02、0.03、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的溶液，吸取不同濃度標準品溶液1 mL置于10 mL具塞刻度試管中，加入0.2%蒽酮-硫酸4 mL，搖勻，置于沸水浴中加熱15 min，再于冷水中冷卻至室溫，放置10 min。于627 nm處測定吸光度，以葡萄糖濃度（x）為橫坐標、吸光度（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程y=6.859 5x-0.073 4（R2=0.996 4）。

采用Sevage法［12］脫除糖蛋白提取液中蛋白質，脫蛋白后的提取液中加入95%乙醇，調至溶液乙醇濃度為80%，4 ℃靜置過夜，抽濾，取沉淀，依次加入無水乙醇、丙酮洗滌，抽濾，沉淀，為粗多糖樣品，干燥后測定重量。

精密稱取干燥至恒重的粗多糖樣品10 mg，置于100 mL容量瓶中，加入蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，獲得濃度為0.1 g/L的粗多糖溶液。精密吸取粗多糖溶液1.0 mL測吸光度，由回歸方程計算樣品的多糖濃度和糖蛋白中多糖含量。

1.2.7 糖蛋白分子量的測定。采用SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳測定糖蛋白分子量［13］，20%SDS-PAGE凝膠電泳，120 V條件下恒壓分離；12%Tricine-SDS-PAGE（小分子）凝膠電泳，4 ℃，150 V條件下恒壓分離，分離時要防止小分子蛋白溢出膠外。凝膠采用考馬斯亮藍G-250染色液［14］染色24 h，7%醋酸乙醇溶液脫色至條帶清晰，使用Bio-Rad凝膠成像儀對凝膠進行圖像采集分析。

1.2.8 纖溶活性評價。采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法［15］測定糖蛋白纖溶活性，配制酶活力分別為10、20、40、60、80 IU/mL尿激酶標準溶液，上樣量為10 μL，37 ℃恒溫孵育18 h。利用迅數菌落計數儀測量溶圈直徑，計算溶圈面積。以尿激酶標準溶液溶圈面積（y）為縱坐標、酶活力（x）為橫坐標繪制標準曲線，得到回歸方程y=0.550 3x+180.43（R2=0.985 5）。根據標準曲線回歸方程計算各糖蛋白樣品纖溶活性。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 緩沖液對參豉糖蛋白提取率的影響。從圖1可以看出，在其他提取條件一致的情況下，緩沖液Tris-HCl-NaCl（pH=5.90）、PBS（pH=7.30）和Tris-Base-NaCl（pH=8.04）的糖蛋白提取率分別為（1.39±0.03）%、（1.33±0.05）%和（3.90±0.02）%。Tris-Base-NaCl的糖蛋白提取率顯著高于Tris-HCl-NaCl和PBS這2種緩沖液的提取率（P<0.05）。Tris-Base-NaCl緩沖液的pH為8.04，表明提取的參豉糖蛋白主要為弱酸性糖蛋白。

2.1.2

提取溫度對參豉糖蛋白提取率的影響。從圖2可以看出，提取溫度為4、25、35、45和60 ℃時，參豉糖蛋白提取率分別為4.02%、3.60%、4.20%、3.80%和4.40%，各組間無顯著差異（P>0.05）。雖然60 ℃條件下參豉糖蛋白提取率最高，但經檢測，該溫度下提取的參豉糖蛋白纖溶活性較低，為（1 146.59±33.78）IU/mL，而4 ℃時纖溶活性為（1 575.36±27.66）IU/mL，因此為保證參豉糖蛋白纖溶活性，選擇4 ℃條件下提取糖蛋白為佳。

2.1.3

料液比對參豉糖蛋白提取率的影響。從圖3可以看出，隨著料液比的增加，糖蛋白提取率呈下降趨勢，當料液比為1∶5 時糖蛋白提取率最高，為（5.91±0.12）%，顯著高于其他各料液比的提取率（P＜0.05）；當料液比為1∶15時提取率明顯降低，僅為（0.80±0.02）%，而當料液比低于1∶5 時，緩沖液被參豉粉末吸收殆盡，影響后續糖蛋白的提取，故選用1∶5為最佳提取料液比。

2.1.4

提取時間對參豉糖蛋白提取率的影響。從圖4可以看出，提取時間1 h時糖蛋白提取率為（4.80±0.01）%，明顯低于其他3組（P＜0.05）。提取時間6、18和24 h的糖蛋白提取率無顯著差異（P＞0.05），基于提取成本和提取效率，選擇6 h為最佳提取時間，糖蛋白提取率為（5.91±0.12）%。

2.1.5

提取次數對參豉糖蛋白提取率的影響?？刂品磻獥l件：Tris-Base-NaCl提取緩沖液，提取溫度4 ℃、料液比1∶5、提取時間6 h，考察提取1和2次對糖蛋白提取率的影響。結果表明，提取1、2次的糖蛋白提取率分別為（4.91±0.12）%、（5.05±0.06）%。由于2次糖蛋白總提取率無明顯差異，且溶液體積大導致后續糖蛋白溶液脫鹽、濃縮過程耗時較久，故選擇提取次數為1次。

2.2 響應面試驗

以緩沖液（A）、提取時間（B）、料液比（C）為響應變量，參豉糖蛋白提取率為響應值，采用Design-Expert 13軟件的Box-Behnken設計進行響應面分析，具體試驗設計及結果見表2。

通過對表2的數據進行多元回歸擬合，得到回歸方程：糖蛋白提取率（Y）=4.44-0.003 8A-0.055 0B+0.648 2C+0.042 5AB-0.005 0AC-0.837 6BC-2.400 0A2-0.986 9B2-0.265 5C2。

回歸模型方差及結果見表3，整體模型P=0.001 9＜0.05（顯著），表明試驗方法可靠；方程失擬項P=0.451 9，表明失擬項不顯著，未知因素對試驗影響較?。籖2=0.906 7，說明回歸模型與實測值擬合度較好。各因素的影響程度從大到小依次為C>B>A，即料液比>提取時間>緩沖液。顯著性檢驗結果顯示，A（緩沖液）、B（提取時間）對糖蛋白提取率的影響不顯著（P＞0.05），C（料液比）對糖蛋白提取率的影響顯著（P＜0.05）；在二次項中A2影響極顯著（P＜0.01），B2影響顯著（P＜0.05）。該方程是參豉糖蛋白提取率與提取工藝各參數合適的數學模型，因此可使用該回歸方程進行試驗結果分析。

根據回歸方程，固定三因素中任意一因素，其他兩因素兩兩交互作用影響參豉糖蛋白提取率，得到等高線平面圖及對應響應面圖（圖5～7）。響應面分析圖中曲線趨勢圖及等高線圖可獲得各因素對糖蛋白提取率影響的顯著程度，曲線越陡峭，等高線越密集，說明該因素對糖蛋白提取率的影響越顯著。各因素交互作用顯著程度可通過等高線圖中心橢圓觀察，中心橢圓越接近圓形，交互作用越不顯著。二維等高線圖顯示，參豉糖蛋白提取率隨緩沖液、提取時間和料液比的變化而變化，并生成了相應的三維響應面，從而更好地確定3個變量對相應變量的交互關系［16］。等高線近橢圓形或近圓形，表明A（緩沖液）、B（提取時間）、C（料液比）對糖蛋白提取率存在影響，且料液比的影響作用大于緩沖液和提取時間（PC=0.022 7、PA=0.985 9、PB=0.822 2）。

利用Design-Expert 13.0軟件進行工藝參數的優化分析，得到預測的參豉糖蛋白提取最佳工藝條件為采用Tris-Base-NaCl（pH=8.04）緩沖液，按照料液比1∶10（g∶mL）于4 ℃提取6 h，此時參豉糖蛋白提取率為4.91%。驗證試驗的提取工藝條件，進行3次平行試驗，取平均值，得到參豉糖蛋白提取率為4.85%，與預測值總體吻合，說明模型能較準確預測參豉糖蛋白提取率，優化工藝條件較可靠。

2.3 參豉糖蛋白中多糖含量

測定多糖溶液吸光度后，通過回歸方程計算可得參豉糖蛋白提取液中多糖含量占參豉糖蛋白總量的12.34%，表明提取的參豉糖蛋白中含有少量的多糖。

2.4 SDS-PAGE及Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳分析

由圖8可知，人參糖蛋白分子量大部分為25 kD及以

上，而黃豆糖蛋白濃度較高，糖蛋白分子量在10～180 kD均有分布；在發酵過程中，微生物分泌的酶對人參及黃豆中的

糖蛋白進行降解，使發酵后的豆豉糖蛋白及參豉糖蛋白分子量降低，在Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳中可以觀察到豆豉糖蛋白及參豉糖蛋白條帶，分子量均在66 kD以下，參豉可能由于加入人參共同發酵的原因，其糖蛋白分子量較豆豉糖蛋白分子量更小，分子量均在27 kD以下。

SDS-PAGE凝膠電泳用于分析相對分子量為20～100 kD的樣品，而Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳，利用三羥甲基氨基甘氨酸（tricine）代替甘氨酸，分離膠中添加甘油，采用Tris-Tricine系統，增加了聚丙烯酰胺的濃度和交聯度，能夠有效分離分子質量小于10 kD的小分子蛋白和多肽［17］。羅浩銘等［18］研究報道人參糖蛋白分子量主要集中在35～75 kD，夏秀芳等［19］研究報道黃豆糖蛋白分子量分布在35 kD以上，且多數大于75 kD，與該研究凝膠電泳結果基本一致。黃豆經枯草芽孢桿菌發酵后，糖蛋白類成分發生降解，其分子量降低，多分布在20～66 kD，參豉糖蛋白的分子量小于豆豉糖蛋白，在4.1～27.0 kD，推測是人參與黃豆共同發酵，在微生物的作用下糖蛋白結構發生改變，從而具有更好的活性。

2.5 不同糖蛋白樣品纖溶活性對比分析

由于參豉是由人參與黃豆共同發酵制成，該研究同法提取人參、黃豆、豆豉（與參豉相同發酵條件，未加人參提取液）及參豉的糖蛋白并對比其纖溶活性，結果如圖9所示。從圖9可以看出，人參糖蛋白、黃豆糖蛋白未見纖溶活性，豆豉糖蛋白、參豉糖蛋白均有明顯的纖溶溶圈，纖溶活性分別為（1 154.28±37.86）和（1 623.04±29.93）IU/mL，參豉糖蛋白纖溶活性較豆豉糖蛋白提高了40.6%，表明發酵后糖蛋白的結構發生變化而具有明顯的纖溶活性。

已有研究表明，人參蛋白有明顯的降血脂作用［20-21］，大豆發酵制成豆豉后蛋白質含量明顯升高，并產生一種具有溶栓作用且安全無毒的豆豉纖溶酶［22-23］。前期研究表明，參豉具有明顯的纖溶活性［2］，但尚不清楚產生纖溶活性的物質基礎。該研究結果初步證實了參豉糖蛋白是其具有纖溶活性的物質基礎之一，且糖蛋白是生物體內重要的生物大分子之一，廣泛存在于動物、植物和某些微生物中，具有廣泛的藥理活性［24］；參豉糖蛋白的纖溶活性較豆豉高，可能是由于糖蛋白的分子量及結構不同而使兩者活性產生差異。

3 結論與討論

該研究以糖蛋白提取率為指標，通過單因素法考察緩沖液、提取溫度、料液比、提取時間和提取次數對其的影響，結合響應面法對參豉糖蛋白的提取工藝進行優化，并對參豉糖蛋白的分子量和纖溶活性進行考察。結果表明，緩沖液、提取時間和料液比對糖蛋白提取率影響較大，響應面法優化獲得參豉糖蛋白的最佳提取工藝條件為Tris-Base-NaCl緩沖溶液（pH=8.04）、料液比1∶10（g∶mL），于4 ℃提取6 h，參豉糖蛋白提取率為4.85%，其中多糖含量為12.34%；SDS-PAGE、Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳結果顯示，參豉糖蛋白分子量為4.1～27.0 kD；與豆豉糖蛋白相比，參豉糖蛋白纖溶活性提高了40.6%。

該研究采用單因素結合響應面法確定了參豉糖蛋白的最佳提取工藝，通過纖溶活性評價證明了參豉糖蛋白是參豉具有纖溶活性的藥效物質基礎之一，并明確了參豉糖蛋白的分子量范圍，為其進一步研究及開發利用提供依據。

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