煙草花葉病毒實時熒光定量PCR檢測體系的構建

吳彥輝 蒲團衛 張生杰 牛龍龍 白靜科 李成軍 李建華

摘要 ［目的］防止隱癥攜帶煙草花葉病毒（TMV）的煙苗移栽到大田造成產量損失。［方法］根據TMV的外殼蛋白（coat protein，CP）基因保守序列設計引物及探針，通過繪制標準曲線、重復性、特異性及靈敏性分析，建立了一種TMV的TaqMan-qPCR檢測方法。［結果］該方法特異性好，與其他常見的煙草病毒無交叉反應；靈敏度高，檢測下限可達到4.53×101 copies/μL，比常規RT-PCR檢測靈敏度提高了10倍；建立的標準曲線斜率為-3.299，決定系數（R2）為0.993 3，擴增效率為100.97%，且循環閾值（Ct）與質粒標準品濃度之間線性關系良好，重復性試驗結果可靠。［結論］利用建立的TaqMan-qPCR檢測方法與常規RT-PCR檢測方法同時檢測煙苗樣品，檢測結果一致，進一步驗證了熒光定量PCR方法的可靠性。

關鍵詞 煙草花葉病毒；實時熒光定量PCR；TaqMan探針法

中圖分類號 S 435.72? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2023）12-0171-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.12.039

Establishment of Real-time PCR Detection Method of Tobacco Mosaic Virus

WU Yan-hui， PU Tuan-wei， ZHANG Sheng-jie et al

（Xuchang Branch of Henan Provincial Tobacco Company， Xuchang， Henan 461000）

Abstract ［Objective］To prevent the yield loss caused by tobacco seedlings with cryptic disease which carrying tobacco mosaic virus （TMV） transplanting to fields.［Method］ A TaqMan-qPCR method for detection TMV was established in the study. Firstly， primers and probe were designed based on the conused sequence of TMV coat protein gene， then a standard curve was prepared using a recombinant plasmid containing the target gene fragment. ［Result］ This method had good specificity and no cross reactivity with other common tobacco viruses.The detection limit was 4.53×101 copies/μL which displaying a higher sensitivity than the conventional RT-PCR with 10 times. The slope of standard curve was -3.299， and the correlation coefficient was 0.993 3 with the efficiency 100.97%. The linear relationship between the cycling threshold （Ct） and the concentration of plasmid standard was good， and the repeatability test results were reliable.［Conclusion］TaqMan-qPCR method and conventional RT-PCR method were used to detect tobacco seedlings samples respectively， and both of the results were consistent which revealed the reliability of TaqMan-qPCR method.

Key words Tobacco mosaic virus;Real-time qPCR;TaqMan probe

基金項目 許昌市煙草公司科技項目（2021411000240104）。

作者簡介 吳彥輝（1989—），男，河南新鄉人，農藝師，碩士，從事煙草農業技術研究與推廣工作。

*通信作者，高級農藝師，從事煙草農業技術研究與推廣工作。

收稿日期 2022-08-15

煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）是煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）的代表種，作為一種模式材料，在植物病毒的基礎研究和應用研究上都占有重要的地位［1］。煙草是我國的重要經濟作物，TMV是煙草生產中的一類主要病害，長期危害煙葉的產量、質量和種植效益。TMV主要通過機械摩擦傳播［2］，隨著煙草生產上集約化漂浮育苗的大力推廣，育苗過程中的苗齡和剪葉次數增加，煙苗TMV的陽性檢出率也提高［3］，漂浮苗帶毒已成為大田煙草花葉病毒病的一個主要初侵染源［4］。監測漂浮育苗過程中的煙苗帶毒情況，從源頭防止TMV的傳播與流行，對煙草病毒病的有效防控具有重要意義。

長期以來，學者們致力于煙草病毒檢測技術的研究與應用，目前較常用的主要有酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術和高通量測序技術等。其中，酶聯免疫吸附法被應用于多個地方煙草病毒病的檢測［5-11］；PCR技術衍生出多種單重和多重檢測方法［12-16］，被應用于陜西［15］、廣西［16］、云南［17］、畢節［18］ 、河南［19］等地煙草病毒病的種類、分布及侵染情況分析；高通量測序技術因其易于發現新病毒的優點也逐漸被應用于煙草病毒的種類檢測［20-23］。然而，ELISA方法的特異性和靈敏性還有待提高，PCR技術過程煩瑣，難以檢測出低豐度病毒樣品，高通量測序技術也存在成本高、不適用于生產上快速檢測等缺點。

近年來，實時熒光定量PCR技術憑借其特異性強、靈敏度高、可對樣品實時快速定量檢測等優點成為一種重要手段，應用于多種植物病毒的有效檢測［24-32］，趙立群等［32］建立的基于TaqMan探針法實時熒光定量PCR方法能夠檢測到最低拷貝數為2×103 copies/μL的病毒，靈敏度是RT-PCR的100倍，特異性強，靈敏性高。鑒于此，該研究擬建立一種高靈敏性、強特異性的TaqMan-qPCR檢測方法，以適用于苗期TMV隱癥攜毒等低豐度樣品的檢測，為無毒煙苗培育提供快速、有效的監測手段。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試材。

供試材料TMV、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，PVY）、煙草蝕紋病毒（tobacco etch virus，TEV）、煙草脈帶花葉病毒（tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV）及番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus，TSWV）由河南省農業科學院煙草研究所植物保護課題組惠贈。

1.1.2 儀器。

Agilent Technologies Strategene MX3000P實時熒光定量 PCR 儀（美國ABI公司，ABI7500）；Eppendorf D30紫外分光光度計；美國伯樂BIO-RAD Gel Doc XR+凝膠成像分析系統；美國伯樂BIO-RAD T100 PCR儀；盧湘儀TGL-16M型高速冷凍離心機。

1.1.3 試劑。

Trizol（Invirtogen）；反轉錄試劑盒 PrimeScript RT Reagent Kit（Perfect real-time，TaKaRa公司）；Premix Taq酶（TaKaRa Taq Version 2.0，TaKaRa公司）；膠回收試劑盒（TaKaRa Mini BEST Agarose GEL DNA Extraction Kit，TaKaRa公司）；質粒提取試劑盒（TIANprep Mini Plasmid Kit，天根生化科技有限公司）；pMDTM 18-T Vector（TaKaRa公司）；感受態細胞（Trans 5α，北京全式金生物技術有限公司）；引物和探針合成及DNA測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計與合成。

根據NCBI數據庫中TMV的外殼蛋白（coat protein，CP）基因保守序列（AJ239099.1），參照引物和TaqMan探針設計原則，利用Primer Premier 5.0軟件設計熒光定量PCR檢測的引物及探針，并通過NCBI中的Primer-BLAST進行比對，保證所設計引物的特異性。上游引物TMV-F：GTTAGGTTCCCTGACAGTGACTTT；下游引物TMV-R：GTTCGCCTGATTTT-CAACTTCT；探針：FAM-TACAGGTACAATGCGGT-MGB；產物長度為126 bp，引物和探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 煙草總RNA的提取。取0.1 g TMV病毒樣本，參照Trizol試劑說明書提取總RNA，利用分光光度計測定所提RNA的濃度，結合1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，選取OD260/OD280在1.8～2.1的RNA樣本進行后續試驗。

1.2.3 RT-PCR反應及條件。cDNA第一鏈的合成反應參照反轉錄試劑盒說明書進行，所得cDNA置于-20 ℃保存用于后續試驗。PCR反應體系：Premix Taq酶 10 μL，10 μmol/L的上下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7 μL。反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；最后在72 ℃延伸10 min。

1.2.4 目的基因克隆與鑒定。上述PCR產物瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的條帶，膠回收試劑盒純化回收后連接至pMD18-T Vector，并轉化進入感受態細胞Trans 5α，37 ℃過夜培養后經藍白斑篩選，挑選白色單菌落置于含有氨芐青霉素的LB液體培養基中振蕩培養（37 ℃，220 r/min，15 h）。菌液經質粒提取PCR檢測后，把符合預期大小的質粒樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.2.5 質粒標準品的制備。質粒樣品經測序序列正確后，用分光光度計測定質粒OD260的值，運用公式（1）計算出質粒濃度拷貝數，將其作為TMV質粒標準品使用。

C=A/B×6.02×1014（1）

式中，A代表質粒濃度（ng/μL），B代表質粒DNA分子量，C代表質粒濃度拷貝數（copies/μL）。

1.2.6 標準曲線的建立。將質粒標準品用EASY Dilution按照10倍梯度稀釋，獲得終濃度為4.53×101～4.53×109 copies/μL的9個質粒樣品，以稀釋后的質粒樣品作為模板，在實時熒光定量PCR儀上進行RT-qPCR，每個濃度進行3次重復，儀器自動生成標準曲線。反應體系為20 μL：Probe qPCR Mix（2×）10 μL，10 μmol/L的上下游引物各0.4 μL，探針 0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.2 μL，質粒模板2 μL，ddH2O 6.2 μL。反應條件：預變性95 ℃ 30 s；95 ℃變性5 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，45個循環。

1.2.7 特異性檢測。分別提取TMV、CMV、PVY、TEV、TVBMV、TSWV的RNA后經反轉錄試劑盒合成第一鏈cDNA，以合成的cDNA為模板，利用TMV-F/TMV-R引物進行常規PCR擴增，健康煙草的cDNA為陰性對照。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物切下相應條帶參照膠回收試劑盒進行純化回收，回收后的PCR產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定，測定序列在GenBank數據庫中進行Blast比較分析。

1.2.8 靈敏度檢測。分別以終濃度是4.53×101～4.53×109 copies/μL的9個質粒標準品進行RT-qPCR和常規PCR，比較2種方法的檢測靈敏度。

1.2.9 檢測體系的應用。隨機采集16份煙苗樣品經總RNA提取，RT-qPCR病毒檢測后，根據擴增曲線和 Ct 值確定其帶毒情況，并根據標準曲線計算出病毒感染樣品的攜毒量。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的建立

以10倍梯度稀釋的9個質粒樣品作為模板進行RT-qPCR擴增后，繪制標準曲線，標準曲線斜率為-3.299，決定系數（R2）為0.993 3，擴增效率為100.97%，且在質粒標準品濃度4.53×101～4.53×109 copies/μL，循環閾值（Ct）與質粒標準品濃度之間線性關系良好（圖1）。因此，可根據待檢測樣品的Ct值參照此標準曲線進行樣品含毒量的檢測。

2.2 熒光定量PCR的重復性試驗

分別以10倍梯度稀釋的9個質粒標準品為模板進行擴增，每份標準品設置3次重復，通過計算Ct值的標準偏差與變異系數對試驗重復性進行評價，結果見表1。表1顯示，標準偏差較小，變異系數均小于1%，表明該試驗重復性良好，試驗結果可靠。

2.3 引物的特異性驗證

TMV、CMV、PVY、TEV、TVBMV、TSWV利用TMV-F/TMV-R引物進行常規PCR擴增后，凝膠電泳結果表明，TMV樣品能擴增出約126 bp的條帶，而其他病毒和陰性對照均未擴增出此條帶（圖2）。目的條帶回收測序結果顯示經TMV-F/TMV-R擴增所得序列為TMV的CP基因片段。

2.4 熒光定量PCR的靈敏度試驗

TaqMan探針法熒光定量PCR靈敏度試驗結果表明，該方法能夠最低檢測出4.53×101 copies/μL的病毒樣品（圖3），而常規RT-PCR檢測方法能夠最低檢測出4.53×102 copies/μL的病毒樣品（圖4），顯然TaqMan探針法熒光定量PCR檢測TMV的靈敏度比常規RT-PCR檢測提高了10倍。

2.5 熒光定量PCR的應用

利用建立的TaqMan-qPCR檢測采集的煙苗樣品攜帶TMV情況，結果發現（圖5），樣品1～13擴增曲線較好，樣品14～16未出現擴增峰型，說明16份樣品中有13份攜帶有TMV。常規RT-PCR結果（圖6）顯示，樣品1～13有特異的單一條帶出現，而樣品14～16未擴增出明顯條帶，且樣品5和樣品11～13目的條帶較淺，對應熒光定量Ct值較大（表2）。綜上所述，常規RT-PCR進一步驗證了熒光定量PCR方法的可靠性。

3 討論

病毒病被稱為植物的“癌癥”，尚未找到有效的防治措施，主要通過無毒苗培育、消除傳播媒介等手段進行預防。目前煙草生產上廣泛應用的漂浮育苗技術有利于實現育苗技術的規范化和成苗質量的標準化，在降低土傳病害感染風險、增強煙苗抗逆能力、調節溫濕度、控制水肥等方面具有明顯優勢，能夠最大程度促進煙草生產效率，但其由于集約化程度高、操作頻繁等因素，易造成病害的發生與流行［33］。在漂浮育苗過程中，發生的病毒病以TMV為主［34］，其中剪葉操作是引起TMV傳播的主要途徑［35］，而帶毒煙苗是大田發病的重要病原［36］。大量煙草田間病毒病檢測結果表明，TMV在全國大部分煙區均為主要病毒［5-11］。該研究中采集的無

明顯病毒癥狀的煙苗樣品也能檢測出少量病毒，因此，該研究建立的檢測方法可為防止隱癥攜毒煙苗移栽到大田提供有效監管措施。

多項研究證實實時熒光定量 PCR技術較常規RT-PCR技術在檢測靈敏度方面具有明顯優勢，丁天波等［24］建立的番茄褪綠病毒（tomato chlorosis virus，ToCV）RT-qPCR方法能夠檢測出的ToCV質粒標準品最低濃度為2.7×103 copies/μL，比常規RT-PCR法靈敏100倍；賀振等［25］建立的甘薯潛隱病毒蓮藕分離物（sweet potato latent virus-lotus，SPLV-lotus）實時熒光定量PCR能夠檢測到7×101 copies/μL 的陽性質粒，靈敏度為普通PCR的100倍；王艷嬌等［26］建立的柑橘脈突病毒（citrus vein enation virus，CVEV）實時熒光定量 PCR 能夠檢測到7×101 copies/μL的質粒，靈敏度比常規RT-PCR高100倍；胡加誼等［27］建立的菠蘿凋萎相關病毒-3（pineapple mealybug wilt associated virus-3，PMWa V-3）實時熒光定量PCR的最低檢出限為313 copies/μL，靈敏度是普通RT-PCR的10倍；林銘等［28］建立的番茄黃化曲葉病毒病（tomato yellow leaf curl virus disease，TYLCVD）實時熒光定量PCR能檢測到106倍的稀釋液，比普通PCR法的靈敏度提高了100倍；李玉琦等［37］建立的馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，PVY）RT-qPCR靈敏度為13 fg/μL，靈敏度達常規RT-PCR的1 000倍。該研究建立的TMV的TaqMan-qPCR檢測下限為4.53×101 copies/μL，靈敏度為常規RT-PCR檢測技術的10倍，同樣證實熒光定量PCR技術較常規RT-PCR技術更靈敏，但較其他研究靈敏度尚需提高。

4 結論

該研究建立的煙草普通花葉病毒熒光定量PCR檢測方法無需凝膠電泳和染色，節省了病毒檢測時間，且重復性好、靈敏度高，其檢測下限為4.53×101 copies/μL，比常規RT-PCR檢測靈敏度提高了10倍，更適用于隱癥攜毒煙苗樣品的檢測，可為無毒煙苗移栽提供技術支撐。

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