玉米基質下枯草芽孢桿菌與乳酸桿菌共發酵代謝特征研究

曹運成，魯 平，李宜諾，代孟麗，鄭云嬌，馮 凡

（宿州學院生物與食品工程學院，安徽 宿州 234000）

發酵工藝是現代生物工程中的一項以舊改新的技術。利用不同微生物之間的互相影響，應用多種微生物之間的高效發酵功能，為社會提供更多高質量食品或將微生物直接應用于工農業生產中[1]。迄今為止，人類對發酵工藝的研究腳步從未停止，孜孜不倦地致力于提高微生物和一些食物殘留物的利用率，不斷增加各種產品的生產效率，使發酵產品的工藝更加簡單、更加節約能源等， 并尋求更好的方法將發酵這種方法應用到更廣泛的領域[2]。發酵技術的一個重要應用是防止有機物的腐爛，另一個重要應用是使口味平淡的食品原料發生感官、物理和營養方面的變化，改善風味和口感，它在人類的飲食文化歷史中有著重要的作用。近年來，我國發酵食品工業化水平逐年提高，白酒、酸奶等產品的工業化生產發展迅速，其他產品（如腐乳、發酵腸等）工業化程度相對較低。因此，提高我國傳統發酵食品工業化水平，參與國際競爭很有必要。枯草芽抱桿菌屬一類廣泛分布在自然環境中的需氧型革蘭氏陽性好氧菌。單個細胞長1.4~3.0 μm，菌落表面為粗糙的、不透明的微黃色，具有耐酸、耐鹽易保存等特點[3]。由于枯草芽孢桿菌需靠氧氣生長繁殖，所以會出現低氧環境，從而阻礙有害微生物的生長，并促進其他厭氧有益菌（如乳酸菌） 繁殖[4]。乳酸桿菌是一類桿狀厭氧型革蘭氏陽性菌，可發酵葡萄糖并產生大量乳酸，最適生存pH 值為5.5~6.0，在自然界中廣泛存在[5]。枯草芽孢桿菌與乳酸菌共發酵將使發酵工藝更加簡單、更加節約時間。兩者均為不嚴格的好氧、厭氧菌，雖有矛盾，但可共存。枯草芽孢桿菌利用液體和發酵罐中的氧為乳酸菌的發酵提供缺氧環境，而同步發酵的乳酸菌能及時利用掉枯草芽孢桿菌糖化作用產生的還原糖，從而促進發酵，為進一步開展益生菌的共發酵食品開發奠定研究基礎[4-5]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料：玉米粉。

試驗菌株：枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌。

試驗試劑：葡萄糖標準品（AR），中國藥品生化制品檢定所提供；福林試劑（AR）、碳酸鈉（AR）、硝酸鋁（AR）、無水乙醇（AR）、亞硝酸鈉（AR）、蛋白胨（BR）、牛肉膏（BR）、七水硫酸錳（AR）、氫氧化鈉（AR），國藥集團化學試劑有限公司提供；氯化鈉（AR）、七水硫酸鎂（AR），無錫市亞泰聯合化工有限公司提供；酵母粉（BR），濟南杰輝商貿有限公司提供；吐溫-80（BC），上海國藥試劑集團提供；葡萄糖（AR），北京奧秘佳得醫藥科技有限公司提供；乙酸鈉（AR），東莞市勛源化工有限公司提供；檸檬酸氫二胺（AR），鄭州美孚化工產品有限公司提供；磷酸氫二鉀（GR），鄭州天之昊化工產品有限公司提供。

1.2 儀器與設備

紫外分光光度計，南京新飛達光電科學技術公司產品；恒溫培養箱，聯鯨精密儀器公司產品；pH計，杭州美控自動化技術公司產品；離心機，力康發展公司產品；電子天平，上海贊維衡器公司產品；高壓蒸汽滅菌鍋，盛科信德科技公司產品；層流潔凈工作臺，安泰空氣技術公司產品；恒溫水浴鍋，常州市億能實驗儀器廠產品；恒溫振蕩搖床，常州梅香儀器公司產品；全自動氨基酸分析儀，陽奇特爾科技公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液的制備

（1） DNS 試劑。酒石酸鉀鈉18.2 g，溶于50 mL蒸餾水加熱，再依次加入3,5 -二硝基水楊酸0.03 g，氫氧化鈉2.1 g，苯酚0.5 g，攪拌溶解，冷卻后蒸餾水定容至100 mL，裝入棕色瓶中避光保存[6]。

（2） 0.9%生理鹽水。電子天平稱量1.8 g 固體氯化鈉，將其充分溶解在200 mL 蒸餾水中，于121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。

（3） 12%Na2CO3。先稱量12 g 的Na2CO3，將其充分溶解在100 mL 蒸餾水后定容至容量瓶中，即可得質量分數為12%的Na2CO3溶液。

（4） 10% Al(NO3)3。準確稱量10 g 的Al(NO3)3，溶解移至100 mL 容量瓶中定容。

（5） 1 mol/L NaOH。準確稱量4 g 氫氧化鈉固體，待完全溶解后，冷卻至室溫后玻璃棒引流定容至100 mL 容量瓶中。

1.3.2 培養基的制備

（1） MRS 液體培養基。蛋白胨5 g，牛肉浸取物（牛肉膏） 5 g，酵母粉2.5 g，葡萄糖10 g，乙酸鈉2.5 g，檸檬酸氫二胺1 g，吐溫-80 0.5 mL，磷酸氫二鉀1 g，七水硫酸鎂0.1 g，七水硫酸鈾0.025 g，蒸餾水500 mL，調節pH 值6.2~6.4；于121 ℃下高壓蒸汽滅菌15 min[7]。

（2） LB 液體培養基。酵母粉1.0 g，胰蛋白胨2 g，氯化鈉2 g，蒸餾水200 mL，調節pH 值7.3 左右，于121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。

（3） 發酵培養基。取玉米粉5 g 于100 mL 蒸餾水中，自然pH 值，搖晃均勻，于115 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。

1.3.3 方法

（1） 菌種活化。于無菌操作臺中，從微生物培養平板中用接種環挑取枯草芽孢桿菌單菌落于LB 液體培養基中37 ℃下以轉速180 r/min 振蕩培養直至菌液光密度為20，將乳酸桿菌接種于MRS 液體培養基中，于37 ℃下以轉速180 r/min 振蕩培養直至菌液光密度為5，備用[8]。

（2） 混菌發酵。分別從2 種活化菌液中用移液槍移取1 mL 的枯草芽孢桿菌菌液和乳酸桿菌菌液于發酵培養基中，于37 ℃下以轉速180 r/min 振蕩培養，每隔24 h 取樣檢測[9]。

（3） 還原糖的檢測。取6 支15 mL 試管分別加入葡萄糖標準液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，每支試管補加蒸餾水至1 mL 后，各試管中添加DNS試劑2 mL，沸水浴2 min，流水冷卻，蒸餾水補至15 mL；于波長540 nm 處測其吸光度，制作標準曲線。

還原糖標準曲線見圖1。

圖1 還原糖標準曲線

發酵液中葡萄糖含量的測定：取適量樣品于離心管中，于4 ℃下以轉速8 000 r/min 離心10 min，取上清液用于還原糖測定。用DNS 比色法[10]測定葡萄糖的含量（與葡萄糖標準曲線的制作的方法一致，將葡萄糖標準液用樣品上清液代替即可），將所測的吸光度代入葡萄糖標準曲線回歸方程中，計算得葡萄糖含量。

（4） pH 值的檢測。取發酵液2 mL 于燒杯中，加入18 mL 的0.9%生理鹽水，充分攪拌溶解，pH儀測其pH 值[11]。

（5） 總酚的測定。取1 支規格為25 mL 的試管，依次加入20 mL 蒸餾水，2 mL 12%Na2CO3溶液，1 mL福林酚溶液，補加1 mL 樣液定容至25 mL，避光1.5 h 后，于波長765 nm 處測其吸光度[12]。總多酚的標曲制作以吸光度為縱坐標，沒食子酸的質量分數為橫坐標。

總酚標準曲線見圖2。

圖2 總酚標準曲線

（6） 總酮的測定。取1 支15 mL 試管，加入0.5 mL的樣品，再加入30%乙醇4.5 mL 和15%NaNO2溶液0.3 mL，反應6 min 后加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL繼續反應6 min 后，加入1 mol/L NaOH 溶液4 mL，用30%的乙醇定容至10 mL，反應15 min 后于波長510 nm 處以蒸餾水為對照，測其吸光度[13]。將數值代入標準曲線回歸方程Y=0.313 9X+0.005 2，相關系數為0.999 2，計算得黃酮質量。

總酮標準曲線見圖3。

圖3 總酮標準曲線

（7） 氨基酸的測定。使用全自動氨基酸分析儀進行分析。其工作機理：樣品中的氨基酸在pH 值較低時攜帶正電荷，在陽離子交換樹脂上均被吸附，但其吸附強度不同，堿性氨基酸結合力最強，其次為中性氨基酸，酸性氨基酸結合力最弱。按照氨基酸分析儀設定的洗脫程序，用不同離子強度、pH 值的緩沖液依次將氨基酸按不同吸附力進行洗脫。分離后的氨基酸與茚三酮試劑在高溫反應器中進行衍生反應，生成可被分光光度計檢測的有色物質，隨后于檢測器中被檢測出來[14]。

（8） 數據的處理。每組試驗作3 個平行組，運用Excel 計算平均值和方差，并運用Origin 8.6 軟件對發酵液數據作圖。

2 結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌與乳酸桿菌共發酵糖化率的變化

枯草芽孢桿菌與乳酸桿菌共發酵糖化率的變化見圖4。

圖4 枯草芽孢桿菌與乳酸桿菌共發酵糖化率的變化

由圖4 可知，發酵周期內糖化率呈上升趨勢，在發酵96 h 前，其糖化率處于持續增長狀態，說明其還原糖含量也在不斷增多。96 h 后糖化率略有下降，發酵120 h 后發酵液中的還原糖含量基本穩定。

2.2 枯草芽孢桿菌與乳酸桿菌共發酵pH 值的變化

與發酵液的糖化率相對應，枯草芽孢桿菌與乳酸桿菌共發酵的過程中會有一定量的乳酸積累，通過測定發酵液的pH 值加以研究。

枯草芽孢桿菌與乳酸桿菌聯合發酵的pH 值變化見圖5。

圖5 枯草芽孢桿菌與乳酸桿菌聯合發酵的pH值變化

發酵216 h 過程中，其pH 值呈下降狀態，說明發酵液的酸度不斷增加。48 h 后發酵液pH 值大幅度下降，96 h 后其發酵的pH 值基本穩定在4.5 左右。

2.3 枯草芽孢桿菌與乳酸桿菌共發酵總酚變化

枯草芽孢桿菌與乳酸桿菌混合發酵的總酚變化見圖6。

圖6 枯草芽孢桿菌與乳酸桿菌混合發酵的總酚變化

由圖6 可知，發酵8 d 內發酵液中的總酚質量濃度始終處于上升趨勢。在發酵第2~4 天及最后1 d其總酚的增長幅度最為顯著，在發酵的第4~7 天其總酚質量濃度變化曲線較為平穩。酚類物質質量濃度在不同溫度、不同蔗糖添加量和pH 值條件下也有所不同。此次發酵試驗是在恒溫條件下進行，隨著發酵時間的推移，蔗糖不斷分解為還原糖，蔗糖含量逐漸降低，酚類物質質量濃度也隨之增加，通常在pH 值低于4 時，酚類物質質量濃度較低，由圖5可知其發酵液最低pH 值大于4，因此發酵整體總酚質量濃度處于增長狀態。

2.4 枯草芽孢桿菌與乳酸桿菌共發酵總酮的分析

枯草芽孢桿菌與乳酸桿菌混合發酵的總酮變化見圖7。

圖7 枯草芽孢桿菌與乳酸桿菌混合發酵的總酮變化

由圖7 可知，枯草芽孢桿菌與乳酸桿菌混合發酵過程中，總酮質量濃度的變化趨勢：發酵初始階段黃酮質量濃度明顯升高，之后增加較為緩慢，在120 h 后其總酮質量濃度仍緩慢增加，最后2 d 其總酮質量濃度分別為0.092 8，0.097 8 mg/mL 兩者相差不大，總酮質量濃度基本趨于穩定。由陳玲等人[14]研究可知，在發酵過程中隨著還原糖含量的不斷增加，酒精含量也會不斷增加，因此出現如圖7 這種質量濃度變化是因為隨著發酵時間不斷推移，酒精含量不斷增加；玉米粉中黃酮溶解量不斷增加。其中影響酒精含量的因素有溫度、枯草芽孢桿菌接種量、糖濃度等因素。由于試驗在恒溫環境下進行的，所以可以忽略溫度對發酵液的影響，而枯草芽孢桿菌的接種量越多其發酵速度就越快，糖化率也就越高，從而導致酒精含量增加，使發酵液的總酮質量濃度增加。由于最后恒量玉米粉中的大部分黃酮已被萃取，使其黃酮的萃取趨于穩定。

2.5 枯草芽孢桿菌與乳酸桿菌共發酵氨基酸合成代謝分析

氨基酸峰面積變化圖見圖8。

圖8 氨基酸峰面積變化圖

取發酵樣液2 mL 于離心管中，于4 ℃下以轉速8 000 r/min 離心10 min 取上清液，使用針筒過濾器過濾放入冰箱保存，用于氨基酸的測定。其中要注意發酵液必須過濾以防止損壞機器，還需注意樣液量必須為2 mL，以保證氨基酸檢測儀順利吸取樣液。取發酵過程中具有代表性的3 d 進行分析。

由圖8 可知，精氨酸、甘氨酸、賴氨酸含量在發酵過程中持續下降，胱氨酸、苯基丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、纈氨酸、蛋氨酸含量在不斷升高，其中苯基丙氨酸含量最高。苯基丙氨酸、蛋氨酸、丙氨酸在72~96 h 期間峰面積的增長速度明顯加快，在此階段賴氨酸的峰面積下降速度明顯加快；氨基酸的消耗可能與微生物的生長消耗有關，微生物滋生的越多，其氨基酸的消耗也就越多，這也側面說明枯草芽孢桿菌和乳酸桿菌在此時生長較旺盛。

3 結論

以玉米粉為基質，枯草芽孢桿菌與乳酸菌共同發酵后其糖化率、總酮、總酚含量不斷增加，pH 值不斷下降，基本穩定在4.5 左右，發酵液中除無色氨酸外，其余氨基酸基本含有，除微生物對氨基酸的消耗外，丙氨酸、賴氨酸、苯基丙氨酸、谷氨酸、胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、酪氨酸含量都較高，這2 種菌的共同發酵大大提升了其傳統發酵工藝的速率，也提升了氨基酸的種類與含量，賦予了發酵食品更好的品質，更加值得在發酵工藝中推廣。