一株雜色曲霉的分離篩選鑒定及其果膠酶的性質(zhì)表征

冼瑩瑩

（梧州學(xué)院，廣西 梧州 543002）

0 引言

果膠是半乳糖醛酸以α（1,4） 糖苷鍵連接而成的生物大分子化合物，主要來(lái)自植物[1]。果膠主要存在于植物細(xì)胞的胞間層和細(xì)胞壁中，對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)剛性和組織的柔性起重要作用[2]。果膠酶是一類降解果膠的酶，在果汁的制作中加入果膠酶可以降解果膠，促進(jìn)水果組織的碎化，促進(jìn)細(xì)胞的崩解，釋放細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，增加營(yíng)養(yǎng)促進(jìn)人體吸收，增加果汁的流暢度和均一性等，因而是果汁生產(chǎn)中的關(guān)鍵酶[3]。

現(xiàn)在已有將果膠酶應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模生產(chǎn)不同水果果汁的報(bào)道，然而，目前報(bào)道的果膠酶較少，難以滿足不同的工藝需求。例如，安玉紅等人[4]生產(chǎn)刺梨果汁所用的pH 值和溫度分別為3.5 和45 ℃，唐杰等人[5]研究桑椹和楊梅果汁生產(chǎn)所用的溫度為35~40 ℃，盧薇[6]研究藍(lán)莓果汁生產(chǎn)所用的pH 值和溫度分別為3.02 和60 ℃，郭凱華等人[7]研究制作沙棘果汁所用的溫度為45 ℃，趙世民等人[8]研究制作火龍果果汁所用的溫度為35 ℃，潘嫣麗等人[9]研究制作番茄-西番蓮復(fù)合果汁所用的溫度為50 ℃等。可見水果的品種不同，其酸堿度不同，其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)也有差別，因而需要不同的生產(chǎn)條件，這就要求有更多具備不同性質(zhì)的果膠酶以供選擇。

土壤中含有豐富的微生物資源，采集了不同的土壤樣品，分離其中潛在產(chǎn)果膠酶的微生物，并對(duì)菌株產(chǎn)的果膠酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)表征，以期為果汁工業(yè)的生產(chǎn)提供新的備選方案。

1 材料與方法

1.1 材料

土壤采集自梧州市，香蕉產(chǎn)自梧州市萬(wàn)秀區(qū)夏郢鎮(zhèn)，橘子皮為購(gòu)自藥店的粗制陳皮粉碎后過(guò)60 目篩子。擴(kuò)增真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer，ITS） 使用諾維贊的2×Phanta 系列試劑，用于測(cè)定酶活力的底物果膠購(gòu)自上海源葉公司，其他所用化學(xué)藥品均為分析純。

1.2 菌株分離和篩選

將土壤分散于滅菌水中，置于搖床中10 min 使顆粒分散，以釋放內(nèi)含的微生物。將分散液用滅菌水以10 倍為梯度進(jìn)行系列稀釋，各梯度稀釋液涂布于分離培養(yǎng)基平板上，于30 ℃下培養(yǎng)5 d。平板上生長(zhǎng)的真菌接種至篩選培養(yǎng)基中，在溫度30 ℃和轉(zhuǎn)速200 r/min 的搖床中培養(yǎng)5 d，其培養(yǎng)液以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 離心2 min，得到的上清液即為粗制果膠酶。測(cè)定上清液中的果膠酶活力，獲得能產(chǎn)果膠酶的菌株，而后進(jìn)行物種鑒定。

分離培養(yǎng)基的配方見文獻(xiàn)[10]，所不同的是將文獻(xiàn)中的淀粉換為橘子皮粉；不含凝固劑（瓊脂粉）的分離培養(yǎng)基即為篩選培養(yǎng)基。以分析真菌ITS 序列的方式鑒定物種，操作依照文獻(xiàn)[10]。察氏培養(yǎng)基的配方見文獻(xiàn)[11]，培養(yǎng)溫度為30 ℃。

1.3 果膠酶活力測(cè)定

采用DNS 法測(cè)定果膠酶活力（聚半乳糖醛酸含量為0.5%，若無(wú)說(shuō)明則為50 ℃下反應(yīng)10 min），其試劑配方、反應(yīng)體系和操作均按照文獻(xiàn)[10]。以半乳糖醛酸作為標(biāo)準(zhǔn)物建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，1 個(gè)單位的酶活力定義為：每小時(shí)釋放出相當(dāng)于1 mg 半乳糖醛酸所需要的酶的量。

1.4 酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

首先考查最適pH 值，即為果膠酶在不同的pH 值中（0.5 個(gè)單位為間隔） 的酶活力；再考查最適溫度，即為在最適pH 值下，果膠酶在不同溫度中（5 ℃為間隔） 的酶活力。將最高者設(shè)定為100%，其余pH 值（或溫度） 下的酶活力折算為相對(duì)百分比。

溫度耐受性為將果膠酶置于不同溫度（5 ℃為間隔） 下保溫1 h 后測(cè)定其殘余酶活力。將沒有進(jìn)行處理的原酶液的酶活力設(shè)定為100%，其余溫度下的酶活力折算為相對(duì)百分比。

1.5 香蕉果汁制作

將香蕉去皮，果肉用小刀切碎后放入榨汁機(jī)，加入3 倍體積的水后粉碎半分鐘獲得果漿。在果漿中加入等體積果膠酶后置于50 ℃下過(guò)夜作為處理組，以加水替代果膠酶作為對(duì)照組。處理完畢后將混合物以轉(zhuǎn)速3 000 r/min 離心1 min，所獲得的上清液則為果汁。同時(shí)以DNS 法測(cè)定上清液中的還原性物質(zhì)（以半乳糖醛酸計(jì)）[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物的分離、篩選與鑒定

從7 份土壤樣品中分離得到5 株在分離培養(yǎng)基平板上菌落形態(tài)各不相同的絲狀真菌菌株，然而在液態(tài)培養(yǎng)時(shí)，僅發(fā)現(xiàn)菌株XYYWZSP1 的培養(yǎng)液中有果膠酶活力，其活力為1.67±0.08 U/mL，因而選取該菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

菌株XYYWZSP1 在察氏培養(yǎng)基平板上的菌落形態(tài)見圖1。

圖1 菌株XYYWZSP1 在察氏培養(yǎng)基平板上的菌落形態(tài)

由圖1 可知，該菌株在察氏培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)的新生菌絲為白色，隨著時(shí)間延長(zhǎng)分化出分生孢子導(dǎo)致顏色慢慢變灰。培養(yǎng)5 d 后，圓形菌落的中心區(qū)域?yàn)榛揖G色，中圈區(qū)域?yàn)榛疑鈬律z為白色。該菌的生長(zhǎng)速度不快，生長(zhǎng)5 d 后其菌落直徑僅0.5 cm。未見色素產(chǎn)生。將其內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)搜尋NCBI（BLASTN 命令），結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與多株雜色曲霉（Aspergillus versicolo）r 一致性較高，因此該菌株應(yīng)為雜色曲霉。

雜色曲霉一直以來(lái)都是以產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物而著稱，近年來(lái)有多項(xiàng)研究報(bào)道雜色曲霉能產(chǎn)生生物堿、萜類、聚酮等結(jié)構(gòu)多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物，有統(tǒng)計(jì)達(dá)325 種[13]，這些產(chǎn)物表現(xiàn)出抗病原菌、抑制鼻咽癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞（H1299 和H520） 等活性[14]。然而，迄今沒有報(bào)道雜色曲霉產(chǎn)果膠酶的情況，因此研究能拓寬人們對(duì)該物種的認(rèn)識(shí)。

2.2 果膠酶的酶學(xué)性質(zhì)

pH 值對(duì)果膠酶活力的影響見圖2，溫度對(duì)果膠酶活力的影響見圖3，溫度對(duì)果膠酶穩(wěn)定性的影響見圖4。

圖2 pH 值對(duì)果膠酶活力的影響

圖3 溫度對(duì)果膠酶活力的影響

圖4 溫度對(duì)果膠酶穩(wěn)定性的影響

由圖2 可知，該果膠酶在pH 值4.5 時(shí)酶活力最高，并且在pH 值4.0 時(shí)的酶活力也接近最高酶活力，說(shuō)明該酶是酸性酶。很多水果的pH 值很接近該酶的適宜pH 值，例如有報(bào)道指出芭蕉、火龍果和芒果果汁的pH 值分別為4.71，4.56，4.52。雖然香蕉的pH 值為5.17[15]，但該果膠酶在pH 值5.0 時(shí)仍能發(fā)揮出80%的酶活力。該果膠酶在50 ℃下的酶活力最高，這與工業(yè)果汁生產(chǎn)使用的溫度相同[16]；該果膠酶在55 ℃的酶活力次之，能發(fā)揮出90%的酶活力（見圖3）。該酶在35 ℃下比較穩(wěn)定，保溫1 h 后酶活力無(wú)損失（見圖4）。隨著保溫溫度的提高，其熱穩(wěn)定性變差。

2.3 果膠酶用于香蕉果汁

果膠酶水解香蕉果汁見圖5。

圖5 果膠酶水解香蕉果汁

由圖5 可知，由于在企業(yè)生產(chǎn)果汁的時(shí)候難以實(shí)現(xiàn)高速離心，為了更接近企業(yè)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，采用的離心條件為轉(zhuǎn)速3 000 r/min 下離心1 min。當(dāng)?shù)润w積水加至等體積香蕉果汁中時(shí)，溫浴時(shí)間到后離心，可以看出香蕉果漿有大量絮狀沉淀。但當(dāng)?shù)润w積該菌株的果膠酶與等體積果汁混合后，溫浴時(shí)間到后離心，其沉淀的量明顯少于對(duì)照組，并且其沉淀的質(zhì)地的對(duì)照組致密，沒有絮狀沉淀，說(shuō)明香蕉果汁中的膠質(zhì)已經(jīng)被該果膠酶水解。膠質(zhì)的水解對(duì)工業(yè)有重要意義，意味著可以降低果汁黏度，增加流動(dòng)性，降低壓榨成本和增加果汁產(chǎn)率[16]。相關(guān)研究報(bào)道，使用果膠酶后香蕉果汁的產(chǎn)量提升幅度不一，這已被證實(shí)是與香蕉的栽培種和成熟的程度有關(guān)——不同栽培品種和不同成熟程度的香蕉，其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)存在較大差異，這些差異直接影響果膠酶的水解效果[15]。處理組的果汁產(chǎn)率比對(duì)照組增產(chǎn)了30.23%±1.89%，效果非常明顯，說(shuō)明該菌株果膠酶是有用的。

在還原性物質(zhì)方面，對(duì)照組中含量為23.01±0.20 g/L，處理組中含量為26.67±0.07 g/L，增產(chǎn)率為15.85%±0.36%。在已有的研究中少有測(cè)定還原物質(zhì)的增產(chǎn)情況[17]，但該項(xiàng)指標(biāo)是有必要測(cè)定的，因?yàn)檫€原性物質(zhì)的增加可以清晰指示果膠酶的效果，原因有2 個(gè)：①果膠是單條鏈的長(zhǎng)鏈分子，具有1 個(gè)還原性末端，果膠酶在果膠鏈中每次水解后釋放出的產(chǎn)物為2 個(gè)果膠寡聚物，使得還原性末端變?yōu)? 個(gè)；②如果果膠酶能夠使細(xì)胞崩解，就能釋放出細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)，而細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)中亦有還原性物質(zhì)（如果糖、葡萄糖等），同樣提升了可測(cè)定得到的果汁中的還原性物質(zhì)的量[16]。研究所得的增產(chǎn)率十分明顯，也從另一個(gè)方面說(shuō)明該菌株果膠酶是有用的。

香蕉是一種深受人們喜愛的、芳香、清甜、并且富有營(yíng)養(yǎng)的水果[18]，然而容易腐爛，特別是在采收期集中上市時(shí)會(huì)有滯銷、腐爛，造成變相減產(chǎn)的情況，上述研究為果汁可打開一條新的銷路，起到助農(nóng)的作用[19]。雖然有報(bào)道個(gè)別雜色曲霉菌株可能產(chǎn)生毒素[20]，導(dǎo)致該物種是否能直接用于食品工業(yè)中還存在擔(dān)憂，但下一步研究或可應(yīng)用基因工程方法專一性地將相關(guān)的基因克隆出來(lái)，轉(zhuǎn)到生物安全的物種中表達(dá)，可以更低廉的成本安全大量生產(chǎn)獲得目標(biāo)產(chǎn)物[21]。總之，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，該株真菌產(chǎn)生的果膠酶可以在香蕉果汁的生產(chǎn)中發(fā)揮作用，或能助力農(nóng)業(yè)發(fā)展。

3 結(jié)論

從采集自梧州的土壤樣品中分離獲得了一株產(chǎn)果膠酶的絲狀真菌，并將其鑒定為雜色曲霉。對(duì)其液體培養(yǎng)產(chǎn)的粗果膠酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定，得知其為酸性酶。后續(xù)將該果膠酶應(yīng)用于香蕉果汁的實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，該果膠酶可明顯促進(jìn)香蕉果汁的增產(chǎn)，說(shuō)明該菌株所產(chǎn)果膠酶或能成為果汁生產(chǎn)的候選酶。