食品中膳食纖維酶解檢測法的改進研究

康茂約，張 晶，袁 妮，張 亮，林興義

（1.溫州市食品藥品檢驗科學研究院，浙江 溫州 325035；2.溫州市糧油產品質量檢測站，浙江 溫州 325041）

膳食纖維（DF） 是不能被人體小腸消化吸收但具有健康意義的、植物中天然存在或通過提取或合成的、聚合度DP≥3 的碳水化合物聚合物，包括纖維素、半纖維素、果膠及其他單體成分等[1]。它既不能被胃腸道消化吸收，也不能產生能量。曾一度被認為是一種“無營養物質”而長期得不到足夠的重視。而隨著營養學和相關科學的深入發展，人們逐漸發現了膳食纖維具有相當重要的生理作用，并被營養學界補充認定為繼傳統的6 類營養素后的第7 類營養素[2-4]。它分為可溶性膳食纖維（SDF） 和不溶性膳食纖維（IDF），兩者相加為總膳食纖維（TDF）[5]。

根據國標GB 5009.88—2014[6]的酶解檢測法為基礎，以測奶粉中的總膳食纖維為例子，對該檢測方法進行優化改進，縮短繁瑣的檢測步驟，減少檢測流程，降低檢測時間，提高檢測效率，并研究探討確定該方法檢測方案可行性。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

SA224S 型電子天平，浙江賽因科學儀器有限公司產品；DF-602 型膳食纖維測定儀，上海纖檢儀器有限公司產品；UFE500 型烘箱，德國MEMMERT 產品中；SX2-4 型箱式電阻爐，上海一恒科學儀器有限公司產品；K360 型凱氏定氮儀，瑞士BUCHI 產品。

熱穩定α -淀粉酶、蛋白酶和葡萄糖苷酶（Megazyme 和Sigma），酸洗硅藻土（Megazyme 和Sigma）等，其他試劑按照國標要求，試劑均為分析純；各種不同品牌的奶粉。

1.2 試驗步驟

（1） 將洗凈的配套坩堝烘干并稱量，稱取樣品1 g（精確至0.1 mg），為了減少誤差，盡量將雙份數據的稱樣質量差控制在0.002 g 以內。

（2） 將稱好質量的坩堝置于儀器上，直接按國標要求進行脫脂脫糖處理。

（3） 在脫脂脫糖后的坩堝中加入緩沖液，再加入熱穩定α -淀粉酶，同時開啟吹氣讓試樣處于微混勻狀態中，然后開始加熱，先加熱至80 ℃5 min，然后保持在98 ℃酶解35 min。

（4） 第一步結束后自動進行冷卻，冷卻25 min左右，加入蛋白酶（50 mg/mL） 進行蛋白酶酶解，60 ℃下酶解30 min[2，6-8]。

（5） 加入3 mol/L 乙酸溶液5 mL 進行溶液pH值調整，然后加入淀粉葡萄糖苷酶進行第3 次酶解，于60 ℃下酶解30 min[2，6-8]。

（6） 加入提前預熱至60 ℃的95%乙醇溶液大約180 mL，然后加入提前130 ℃烘干的硅藻土2 g 左右，用少量95%乙醇沖干凈，然后進入“室溫沉淀”階段，該階段60 min。

（7） 沉淀結束后，進行儀器自動統一抽濾。

（8） 再分別用78%乙醇、95%乙醇、丙酮進行洗滌，然后將坩堝連同殘渣一同放入105 ℃烘箱過夜，第2 天取出進行稱量。

（9） 取1 份測灰分，取1 份消化后測蛋白。（10） 計算結果。

2 結果與分析

2.1 原國標方法存在的問題

問題1：效率低。一是在熱穩定α -淀粉酶階段結束后，需將溫度冷卻至60 ℃。或等原水浴鍋慢慢冷卻至60 ℃，或將高腳燒杯直接轉至另外60 ℃水浴鍋，要么取出冷卻然后再放置于60 ℃水浴鍋，顯然前兩者效率都不高。而若選擇最后者，如果降溫沒控制好，就容易冷卻過頭，除非試驗人員實時監控著溶液溫度。二是縱觀整個試驗過程，國標方法需要用到不同的水浴溫度，不同的好幾臺儀器，同時監控，而該法則是全程溫度自動控制。三是國標法稱樣、脫脂脫糖、酶解、沉淀、抽濾全部分開操作，需要轉移好幾次，而該法則是上述步驟全部于一臺儀器操作完成，無需頻繁轉移，效率提高較多[9]。

問題2：時間長。一是國標GB 5009.88—2014規定水分>10%的試樣，應在70±1 ℃真空干燥箱內烘干至恒重；脂肪>10%的試樣應先進行3 次脫脂，再按水分>10%的試樣處理方法烘干；糖含量>5%的試樣，用85%乙醇進行脫糖，于40 ℃烘箱內過夜。而該法可直接稱樣、脫脂、脫糖后馬上開始酶解，無需上述繁瑣的步驟，此舉可以省去1~2 d 時間。二是應用本法小半天可以完成整個酶解、沉淀、抽濾過程，而如果按國標法，想縮短檢測時間就必須配備多臺水浴鍋，多臺抽濾裝置同時進行，若不然儀器不夠，會拉長整體檢測時間。

問題3：易損失。在熱穩定α -淀粉酶階段，由于水浴溫度過高，溶液很容易暴沸，導致樣品容易黏壁，若不及時刮下壁上附著物，容易造成該部分物質沒酶解，導致結果不準。在抽濾階段，需要將乙醇沉淀液轉移至坩堝中抽濾，此步驟容易使殘渣留在高腳燒杯中導致損失。

問題4：難操作。縱觀整個膳食纖維的操作過程，稍有不慎對結果就有較大的影響，尤其是空白試驗的操作。在進行比較分析時，國標脫脂、脫糖的稱樣量不少于50 g，脫脂是用石油醚25 mL/g 進行添加，然后干燥恒重；而脫糖是用85%乙醇10 mL/g進行添加，然后于40 ℃條件下過夜。一方面會由于量大造成脫脂脫糖不均勻，另一方面會造成烘干恒重比較困難，如果沒做好，則直接造成損失因子換算不準確而影響最終結果。

2.2 改進方法的研究

對于國標繁瑣的步驟而言，該方法省去了很多步驟，并對部分步驟進行深入優化、改進研究，具體如下：

（1） 與國標法不同，將稱樣、脫脂、脫糖、酶解、沉淀、抽濾全部一體化操作，效率上會提高不少，而且試驗人員只需定時去添加不同的試劑和酶即可，無需一直守在實驗旁寸步不離[1]。

（2） 將樣品稱取在坩堝中，中途無需頻繁轉移樣液，整個試驗一氣呵成，減少誤差。酶解法主要的就是模擬樣品在腸道被酶解的過程，結果計算是按照質量法，如果轉移過程黏壁或者酶解過程中黏壁都可能會造成酶解不完全或者樣品量減少，影響最終結果，尤其對膳食纖維較低的奶粉樣品而言稍有操作不慎就對結果影響很大。

（3） 對于奶粉試樣而言，第一步就是稱樣在坩堝內，然后脫脂脫糖后馬上開始酶解步驟，而無需像國標法需要烘干恒重或者烘干過夜后再進行稱樣，然后根據損失因子進行折算。同理，對于無需脫脂脫糖，而要進行脫水干燥的試樣而言，該法可直接稱樣開始酶解檢測，無需先烘干再進行折算，此舉節省很多時間。

在進行實際奶粉樣品分析時，發現僅改進脫脂、脫糖方法，而其余檢測步驟不變的情況下進行結果驗證比對，其比對結果符合國標要求的精密度要求。

（4） 所用儀器設有吹氣泵，在脫脂、脫糖、酶解等步驟都可以起吹散混勻作用，而無需人工再去攪拌干預。

（5） 無需將硅藻土進行干燥稱重，而只需將硅藻土提早烘干，大致倒入2 g 即可。根據國標公式，試樣殘渣灰分質量mA=試樣殘渣灰化后灰分加坩堝硅藻土質量mZ-坩堝加硅藻土質量mG，而試樣質量殘渣mR為105 ℃烘干后殘渣加坩堝硅藻土質量mGR-坩堝加硅藻土質量mG，則國標公式（3） 中的mR則可簡化為105 ℃烘干后殘渣加坩堝硅藻土質量mGR-試樣殘渣灰化后灰分加坩堝硅藻土質量mZ-試樣殘渣蛋白質質量mP即可，公式簡化后，無需再對坩堝加硅藻土質量mG進行帶入計算，省去坩堝和硅藻土的稱量步驟。

而在進行膳食纖維試驗空白的時候，許多食品檢測同行甚至包括酶試劑廠家、儀器廠家都會經常出現空白灰分為負數的現象，所以上述公式的簡化可以避免這個誤差帶來的不準確性[2]。

（6） 用到的儀器較國標法要少，省去了水浴鍋、抽濾裝置、高腳燒杯等，也節省許多試驗空間。

綜合來看，將原來的試驗時間由4~5 d 縮短至2 d 即可完成，縮短試驗時間，提高檢測效率，減少頻繁轉移，以及由此引起的試驗誤差，而且未偏離國標法的精髓。同時對公式簡化處理后，簡便計算技巧，方便結果計算。

2.3 驗證性試驗結果

（1） 選取已知數值的質控樣品采用該法進行檢測，檢測結果與標準值進行比較分析，符合要求。

膳食纖維實際檢測結果與質控值比對見表1。

（2） 空白比對：根據檢測得出空白灰分幾乎為0甚至為負數，空白蛋白大致在5~15 mg，試劑空白質量為10~14 mg，此空白數據與酶制劑、硅藻土廠家Megazyme、上海纖檢等公司進行數據比較，發現并無明顯差異。但是，由于試劑空白質量對低含量膳食纖維的結果影響非常大，所以如何準確檢測空白值至關重要。

（3） 試驗選取了不同品牌、種類的奶粉進行檢測，同時與國標法、其他單位檢測結果比對分析，結果符合國標精密度要求。

奶粉試樣膳食纖維檢測結果比對見表2。

表2 奶粉試樣膳食纖維檢測結果比對/g·（100 g）-1

3 結論

通過試驗研究，開展的膳食纖維檢測法研究可以快速、準確地檢測食品中的膳食纖維，該方法耗時短、效率高、重復性好，同時也可應用于SDF 和IDF 檢測，改進方法的研究具有一定的意義。