竹葉花椒黃酮類(lèi)物質(zhì)抗氧化活性及其譜效關(guān)系

何鑫柱，李潮俊，周孟焦，康 明，梁曉峰

（1. 四川中醫(yī)藥高等專科學(xué)校川西北中藥材資源研究與開(kāi)發(fā)利用實(shí)驗(yàn)室，四川 綿陽(yáng) 621010；2．西南科技大學(xué)材料與化學(xué)學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621010）

竹葉花椒（Zanthoxylum armatum DC.） 為蕓香科花椒屬植物，又名藤椒、野花椒、蜀椒和山花椒等，近年來(lái)因其對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求低、易種植、產(chǎn)量大等特點(diǎn)已經(jīng)成為鄉(xiāng)村振興中備受關(guān)注的重要經(jīng)濟(jì)作物，廣泛分布在四川、甘肅、陜西和云南等地區(qū)[1]。竹葉花椒傳統(tǒng)主要用于調(diào)味品，也可用作中藥，在《本草圖經(jīng)》中有專門(mén)記載。竹葉花椒果皮中含有黃酮類(lèi)、揮發(fā)油、酰胺和生物堿等多種活性成分[2]。藥理學(xué)研究表明，黃酮類(lèi)物質(zhì)具有較強(qiáng)抗氧化活性[3]，可作為天然抗氧化劑研究的原材料。竹葉花椒中黃酮類(lèi)化合物成分復(fù)雜，其抗氧化活性物質(zhì)基礎(chǔ)研究還不夠深入。運(yùn)用譜效關(guān)系學(xué)的方法對(duì)其抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行分析[4]，通過(guò)研究共有特征峰的相似度和抗氧化活性特點(diǎn)，構(gòu)建竹葉花椒黃酮類(lèi)物質(zhì)化學(xué)指紋圖譜和抗氧化活性之間的關(guān)系，可用于評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)不同來(lái)源竹葉花椒的抗氧化活性[5]。

通過(guò)建立竹葉花椒黃酮類(lèi)物質(zhì)的HPLC 指紋圖譜，利用DPPH 法測(cè)試其抗氧化性，運(yùn)用偏最小二乘回歸法考查其抗氧化活性的譜效關(guān)系，為深入研究竹葉花椒黃酮類(lèi)抗氧化的活性物質(zhì)基礎(chǔ)、開(kāi)發(fā)天然抗氧化劑提供了試驗(yàn)參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

表兒茶素、蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、紫云英苷、異鼠李素- 3 - O -葡萄糖苷和山奈酚對(duì)照品，阿拉丁試劑（上海） 有限公司提供；甲醇、石油醚和無(wú)水乙醇，均為分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司提供；過(guò)硫酸鉀、DPPH（1,1 -二苯基- 2 -三硝基苯肼），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；聚酰胺和D101 型大孔吸附樹(shù)脂，上海麥克林生化科技提供。10 批不同來(lái)源的竹葉花椒，經(jīng)四川中醫(yī)藥高等專科學(xué)校江洪波教授鑒定為蕓香科花椒屬植物竹葉花椒（Zanthoxylum armatum DC.） 的果皮。

10 批次竹葉花椒來(lái)源信息見(jiàn)表1。

表1 10 批次竹葉花椒來(lái)源信息

1.2 儀器

UltiMate 3000 型高效液相色譜儀，美國(guó)賽默飛公司產(chǎn)品；752 N-Plus 型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司產(chǎn)品；Sartorius BSA124S 型分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器產(chǎn)品；RE52CS-2 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器產(chǎn)品；YTLG-12A 型冷凍干燥機(jī)，上海葉拓科技有限公司產(chǎn)品；XH-MC-1 型實(shí)驗(yàn)室微波合成儀，北京祥鵠科技產(chǎn)品；DHG-9075A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器產(chǎn)品。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹葉花椒黃酮的抗氧化活性測(cè)試

2.1.1 供試品溶液的制備

稱取竹葉花椒果皮粉末適量，加入1∶30（g∶mL） 的60%乙醇水溶液，用微波輔助法進(jìn)行提取，于80 ℃下反應(yīng)25 min，提取液用石油醚進(jìn)行脫脂處理[7]，再冷凍干燥得到黃酮粗提物，用聚酰胺-大孔吸附樹(shù)脂對(duì)提取物進(jìn)行純化，得到淡黃色粉末狀固體黃酮化合物。精密稱取黃酮純化物5.0 mg，加入乙醇溶解，用10 mL 容量瓶定容，配制成0.5 mg/mL的樣品溶液，再將其分別配制質(zhì)量濃度為0.005，0.010，0.020，0.040，0.080 mg/mL 的樣品溶液。

2.1.2 DPPH·溶液的配制

DPPH（1,1 -二苯基- 2 -三硝基苯肼） 是一種穩(wěn)定的含氮自由基。在DPPH·清除試驗(yàn)中，黃酮類(lèi)化合物等抗氧化劑能提供氫原子與DPPH·相結(jié)合，從而導(dǎo)致溶液中的自由基減少，吸光度大小會(huì)發(fā)生變化，在波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)其吸光度變化大小來(lái)評(píng)價(jià)受試物清除DPPH·的能力。精密稱取7.9 mg 的DPPH固體粉末，加入乙醇溶解，用100 mL 容量瓶定容，配成濃度為2×10-4mol/L 的DPPH·溶液。

2.1.3 DPPH·清除率的測(cè)定

利用紫外分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)試2 mL乙醇和DPPH·混合溶液2 mL、受試物2 mL 和DPPH·混合溶液2 mL、乙醇2 mL 和受試物混合溶液2 mL 的吸光度，分別記為A0，A1和A2；測(cè)試前需在暗處反應(yīng)30 min，進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，清除率計(jì)算公式如下：

2.1.4 抗氧化活性測(cè)試結(jié)果

應(yīng)用IBM SPSS Statistics 25 軟件進(jìn)行Probit 回歸分析，預(yù)測(cè)出受試物的IC50。IC50表示樣品清除一半自由基的溶液濃度，IC50值越小，說(shuō)明受試物對(duì)自由基清除效果越好，其抗氧化能力越強(qiáng)。DPPH 法測(cè)定10 批次竹葉花椒黃酮抗氧化的IC50值結(jié)果。

10 批次竹葉花椒黃酮抗氧化的IC50值見(jiàn)表2。

表2 10 批次竹葉花椒黃酮抗氧化的IC50 值 /μg·g-1

由表2 可知，10 批次竹葉花椒黃酮清除DPPH·的能力大小為S2>S8>S3>S5>S9>S4>S6>S10>S1>S7。

2.2 竹葉花椒黃酮類(lèi)物質(zhì)的HPLC 指紋圖譜

2.2.1 供試品溶液的制備

2.2.2 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取竹葉花椒黃酮純化物5.0 mg，用甲醇定容至10 mL 容量瓶中，即得供試品溶液。

精密稱取表兒茶素、蘆丁、金絲桃苷、紫云英苷、槲皮苷、異鼠李素- 3 - O -葡萄糖苷和山奈酚7 個(gè)對(duì)照品適量，用甲醇定容至10 mL 容量瓶中，配成混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 HPLC 測(cè)試條件

色譜柱為反相PA2 C18（50 mm×4.6 mm，3 μm）；流動(dòng)相A 為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B 為甲醇溶液；梯度洗脫（0~1 mim，5% B；1~3 min，5%~10% B；3~16 min，10%~90% B；16~22 min，90%B；22~22.1 min，90%~5% B；22.1~30 min，5% B）；柱溫25 ℃，進(jìn)樣量30 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)300 nm，流速1 mL/min。

2.2.4 精密度試驗(yàn)

取同一批竹葉花椒黃酮純化物為考查對(duì)象，按2.2.1 的方法配制溶液，按2.2.3 的色譜條件重復(fù)測(cè)試一供試品溶液5 次，計(jì)算它們共有峰峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果各共有色譜峰的相對(duì)峰面積的RSD 值為0.61%~2.90%，表明儀器的精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批竹葉花椒黃酮純化物為考查對(duì)象，按2.2.1 的方法配制溶液，按2.2.3 的色譜條件對(duì)一供試品溶液在0，4，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)行測(cè)試，計(jì)算它們共有峰峰面積的RSD。結(jié)果各共有色譜峰的相對(duì)峰面積RSD 值在0.23%~2.53%，表明樣品溶液在24h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批竹葉花椒黃酮純化物為考查對(duì)象，按2.2.1 的方法配制溶液，按2.2.3 的色譜條件對(duì)5 組平行供試品溶液進(jìn)行測(cè)試，計(jì)算它們共有峰峰面積的RSD。結(jié)果各共有色譜峰的相對(duì)峰面積RSD 值在0.44%~2.43%，表明建立的HPLC 測(cè)試方法具有良好的重復(fù)性。

2.2.7 竹葉花椒黃酮HPLC 的疊加指紋圖譜

將10 批次竹葉花椒黃酮的HPLC 圖譜導(dǎo)入相似度評(píng)價(jià)軟件中，對(duì)其HPLC 指紋圖譜進(jìn)行解析，生成一個(gè)對(duì)照指紋圖譜（R） 和HPLC 共有疊加指紋圖譜。

10 批次竹葉花椒黃酮樣品的疊加指紋圖譜見(jiàn)圖1，混合對(duì)照品和竹葉花椒黃酮對(duì)照的指紋圖譜見(jiàn)圖2；10 批次竹葉花椒黃酮的共有峰峰面積見(jiàn)表3。

圖1 10 批次竹葉花椒黃酮樣品的疊加指紋圖譜

圖2 混合對(duì)照品和竹葉花椒黃酮對(duì)照的指紋圖譜

表3 10 批次竹葉花椒黃酮的共有峰峰面積

由圖2 可知，10 批次竹葉花椒黃酮的HPLC 指紋圖譜共指認(rèn)出16 個(gè)特征共有峰，其中峰5，11，12，13，14，15 和16 代表的化合物分別為表兒茶素、蘆丁、金絲桃苷、紫云英苷、槲皮苷、異鼠李素- 3 - O -葡萄糖苷和山奈酚。每一個(gè)HPLC 指紋圖譜中共有色譜峰的面積之和大于總面積的90%，表明該HPLC 指紋疊加圖譜符合指紋圖譜的評(píng)價(jià)要求，能用于竹葉花椒黃酮的譜效關(guān)系研究。

2.3 竹葉花椒黃酮抗氧化的譜效關(guān)系

采用偏最小二乘回歸（PLSR） 法分析竹葉花椒黃酮的HPLC 指紋圖譜共有峰峰面積與DPPH 法得到的抗氧化IC50值之間的關(guān)系。

DPPH 法的PLSR 方程的回歸系數(shù)和VIP 值見(jiàn)圖3。

圖3 DPPH 法的PLSR 方程的回歸系數(shù)和VIP 值

通過(guò)SPSS 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，得到的PLSR 方程為：

Y=0.010X1+0.002X2-0.014X3+0.084X4-0.266X2-0.121 X6+0.084X7-0.117X8-0.145X9+0.101X10+0.232 X11-0.075X12-0.150X13+0.159X14+0.072 X15-0.427X16.

16 個(gè)共有峰中的峰3，5，6，8，9，12，13 和16 對(duì)應(yīng)的回歸系數(shù)為負(fù)值，表明這些共有峰的峰面積越大，IC50值就越低，即清除DPPH·的能力越強(qiáng)。變量投影重要性值（VIP） 是PLSR 分析中一個(gè)重要的指標(biāo)，VIP 值越大，表明該活性成分對(duì)藥效的貢獻(xiàn)率越大；當(dāng)VIP 值> 1 時(shí)，表明該活性成分對(duì)藥效呈顯著相關(guān)。在DPPH 法的PLSR 分析中，VIP 值>1 的共有峰有峰1，2，4，5，6，7，9，12，13 和16，表明這些共有峰代表的化合物與竹葉花椒黃酮抗氧化活性的大小呈顯著相關(guān)。結(jié)合PLSR 方程的回歸系數(shù)和VIP 值，表明5，6，9，12，13 和16 對(duì)抗氧化活性的貢獻(xiàn)值較大，這6 個(gè)共有峰代表的化合物是竹葉花椒黃酮抗氧化的主要活性物質(zhì)。

3 結(jié)論

利用DPPH 法對(duì)竹葉花椒黃酮提取物的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)試，并建立了10 批次不同來(lái)源竹葉花椒黃酮的HPLC 指紋圖譜，用偏最小二乘回歸法分析了竹葉花椒黃酮抗氧化的譜效關(guān)系。通過(guò)相似度評(píng)價(jià)軟件對(duì)10 批次竹葉花椒黃酮的HPLC 指紋圖譜進(jìn)行解析，得到其疊加指紋圖譜，共指認(rèn)出16 個(gè)共有色譜峰；峰5（表兒茶素）、6、9、12（金絲桃苷）、13（紫云英苷） 和16（山奈酚） 這6 個(gè)共有峰所代表的化合物是竹葉花椒黃酮抗氧化的主要活性成分。