豆芽菜中內源性生長素吲哚乙酸含量變化的研究分析

周建峰，葉大洲，杜蓓蓓

（1.溫州市質量技術檢測科學研究院，浙江 溫州 325000；2.浙江一鳴食品股份有限公司，浙江 溫州 325000）

為了提高豆芽菜產量，有不法商販在種植生產過程中違規使用植物生長調節劑，導致相關“毒豆芽”的安全事件頻發，使得消費者對購買食用豆芽菜存在安全憂慮[1]。植物生長調節劑，俗稱生長素，是從生物中提取的天然植物激素或者是人工合成的對植物生長發育有調節作用的化學物質，它的生理作用與相關內源激素相似，能夠加快植物根的形成、維管束的分化、葉片的擴大生長。它在人體內能夠通過新陳代謝排出體外，正確使用植物生長調節劑，使得其在豆芽菜中的殘留量控制在適量范圍內，不會對人體造成影響。但長時間食用含過量植物生長調節劑的豆芽菜等食品會對人體產生蓄積影響[2]。國家食品藥品監督管理總局、計劃生育委員會和農業部聯合發布了關于豆芽生產過程中禁止使用6 -芐基腺嘌呤等物質的公告（2015 年第11 號），明確表示4 -氯苯氧乙酸(4-CPA)、6-芐基腺嘌呤（6-BAP）等作為低毒農藥登記管理并做了使用范圍的限定，豆芽生產不在可使用范圍內[3]。

國內外關于豆芽菜中植物生長調節非法添加的方法開發樣品檢測文獻很多，在針對各種實際豆芽菜樣品中的測定中，4-氯苯氧乙酸(4-CPA)、6- 芐基腺嘌呤（6-BA） 和吲哚乙酸(IAA)的檢出率比較高。劉印平等人[4]對河北省近10 個區市31 份綠豆芽和21 份黃豆芽中豆芽菜進行了食品安全風險評估，吲哚乙酸（IAA） 檢出率為66.67%，含量為24~140 μg/kg。杜興蘭等人[5]對聊城市10 批市售豆芽菜進行檢測，吲哚乙酸（IAA） 檢出率為66.67%，含量在7.2~498 μg/kg。其他關于豆芽菜的植物生長調節測定的文獻中，也發現存在各個不同水平的吲哚乙酸（IAA）。我國僅僅發布了關于禁止4-CPA、6-BAP在豆芽中使用的公告，GB 2763—2016《食品安全國家標準 食品中?農藥最大殘留限量》中對2,4-D 在豆芽中的殘留限量沒有做具體的規定，吲哚乙酸（IAA） 也同樣沒有被列出[6]。

吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，indol-yl-3-acetic acid） 是植物中普遍存在的內源生長素，又名生長素、茁長素或異生長素，屬于吲哚類化合物。現行的檢驗標準豆芽中植物生長調節劑的測定（BJS 201703）[7]確定了吲哚乙酸（IAA） 的測定方法，但鑒于現已有的文獻資料，吲哚乙酸（IAA） 檢出含量范圍跨度較大，很難判定是否屬于商家企業違法添加。擬開展一項豆芽菜的吲哚乙酸（IAA） 含量調查，對其含量進行總結分析，為后續的豆芽菜生長激素的非法添加等食品安全檢驗檢測工作和風險監督工作提供一定的相關參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

吲哚乙酸標純品，純度98.5%，上海安譜公司提供；甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨，均為色譜純，上海安譜公司提供；鹽包：4 g 無水硫酸鎂和1 g 無水乙酸鈉，北京艾德森公司提供；QuEChERS 離心管（內含300 mg 無水硫酸鎂和100 mg C18），北京艾德森公司提供。

1.2 儀器和設備

Agilent1290/6470 型三重四極桿液相色譜-串聯質譜，配ESI 源，美國安捷倫產品；SIGMA 3K15 型冷凍離心機（轉速≥5 000 r/min），美國Sigma 公司產品；IKA MS3 型渦旋振蕩器，德國IKA 公司產品；氮吹儀，上海安譜公司產品；針式濾器，0.22 μm 有機相微孔濾膜，上海安譜公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

（1） 精密稱取吲哚乙酸標準物質10 mg，轉移到10 mL 容量瓶中，用甲醇試劑溶解并定容至刻度，搖勻，制成質量濃度各為1 mg/mL 標準貯備液，-20 ℃下保存。

（2） 中間工作液（10 μg/mL）：精密量取吲哚乙酸標準儲備液（1 mg/mL） 1 mL，置于100 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成質量濃度均為10 μg/mL 的混合標準中間液A。

（3） 空白基質提取液：稱取空白試樣各10.0 g（精確至0.01 g），分別置于50 mL 具塞離心管中，與樣品同法處理，獲得空白基質提取液。

臨用時，用空白基質提取液配制成質量濃度為10，20，40，100，200 ng/mL 的工作液，繪制標準曲線（最高質量濃度點可依據待測樣品濃度增加）。

吲哚乙酸系列曲線MRM 掃描圖見圖1，對照品、陽性樣品和空白樣品MRM 掃描圖見圖2。

圖1 吲哚乙酸系列曲線MRM 掃描圖

圖2 對照品、陽性樣品和空白樣品MRM 掃描圖

1.3.2 試驗檢測過程

（1） 提取方式。用天平準確稱取10.0 g 待測樣品，置于50 mL 塑料密封離心管中，準確倒入20 mL的乙腈溶液（含1%甲酸），均質2 min，加入鹽包（4 g 無水硫酸鎂和1 g 無水乙酸鈉），旋渦混合1 min，以轉速8 000 r/min 離心5 min 使兩相分層。

（2） 凈化方式。準確移取乙腈層溶液4 mL，轉移到凈化離心管（含300 mg 無水硫酸鎂和100 mg C18） 中，旋渦混合1 min，以轉速10 000 r/min 離心5 min，移取全部上清液于10 mL 離心管中，于40 ℃水浴中氮吹近干，用甲醇試劑定容至1 mL，旋渦混合1 min，以轉速10 000 r/min 離心5 min，上清液經0.22 μm 有機相濾膜過濾后，取待測液，上機測定。

1.3.3 色譜和質譜條件

（1） 超高效液相色譜柱。Zorbax Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；液相流速0.3 mL/min，進樣體積1 μL，柱溫箱溫度30 ℃，流動相A：甲醇（含0.1%甲酸和5 mmoL/L 乙酸銨）；流動相B：水（含0.1%甲酸和5 mmoL/L 乙酸銨）；洗脫比例為0~2.0 min，30%A~70%A；2.0~6.0 min，70%A~70%A。

（2） 離子源參數。電噴霧離子源（ESI 源），正離子模式掃描，多反應監測（MRM），霧化器（GS1） 45 L/min，輔助氣壓力（GS2） 35 L/min，離子源溫度（TEM）：500 ℃。

吲哚乙酸質譜參數見表1。

表1 吲哚乙酸質譜參數

2 試驗設計與分析

2.1 分組試驗

以未發芽的黃豆和綠豆作為研究對象，分別獲取5 批次，共10 批次樣品，依據1.3.2 步驟進行檢測。

以上述其中未發芽的黃豆和綠豆進行水培發芽，分別定期摘取10 批次黃豆芽和綠豆芽，共20 批次作為研究對象，依據1.3.2 步驟進行檢測。

以市場購自的黃豆芽和綠豆芽為研究對象，分別獲取5 批次，共10 批次樣品，依據1.3.2 步驟進行檢測。

2.2 數據分析

通過Masshunter 工作站及數據處理系統采集分析質譜圖，空白樣品配標外標法定量，采用Excel 2007 進行數據表格和圖表處理。

吲哚乙酸實際樣品檢測數據見圖3。

圖3 吲哚乙酸實際樣品檢測數據

由圖3 可知，吲哚乙酸在樣品中的狀態分2 種情況，在豆芽未發芽，呈種子階段時的黃豆和綠豆中，吲哚乙酸均為未檢出。利用購買的黃豆和綠豆進行水培自發形成豆芽后，經過定期采摘并進行制樣檢測，發現在成長階段中的豆芽，自身開始產生吲哚乙酸，依據試驗分析，含量為0.007~0.064 mg/kg（僅限于本試驗研究中），超過方法定量限水平的有17 批次，未超過方法定量限水平的有3 批次，相當于檢出率為85.0%（方法定量限為0.010 mg/kg）。從市場購買的黃豆芽和綠豆芽共計10 批次，均有吲哚乙酸檢出，其中有8 批次含量在0.010~0.188 mg/kg，而另外2 批次含量水平尤其較高，分別為綠豆芽1.597 mg/kg 和黃豆芽4.979 mg/kg，檢出率為100.0%。

3 結論

通過試驗數據分析和研究發現，在豆芽成長代謝過程中，自然產生部分內源性生長調節劑吲哚乙酸，但是其含量會保持在穩定的低含量水平（依據試驗研究顯示為0.100 mg/kg 含量水平以下），保證其自身正常生長，若超過該水平，則可能有一定性的外部添加可能。目前，食品安全抽檢細則和食品添加標準并無針對豆芽產品中吲哚乙酸的限量強制要求，試驗的數據可為檢測機構的后續實際檢測作為參考分析。