不同生長年限北蒼術次生代謝物累積對土壤礦質元素的響應

谷仙，趙艷云，張建云，王乾，鄭玉光，房慧勇

(1. 河北中醫學院藥學院，河北石家莊 050200；2. 河北省中藥炮制技術創新中心，河北石家莊 050200；3. 河北化工醫藥職業技術學院，河北石家莊 050026)

中藥蒼術為多年生菊科植物茅蒼術[Atractylodes lancea(Thunb.) DC. ] 或北蒼術[Atractylodes chinensis(DC.)Koidz.]的干燥根莖，味辛、苦，性溫，歸脾、胃、肝經，具有燥濕健脾、祛風散寒、明目等藥效《中華人民共和國藥典(2020版)》。 受新型冠狀病毒疫情(COVID－19)等影響，近年來蒼術的市場需求不斷擴大，主流品種以北蒼術為主，但質量參差不齊。 自然界中蒼術為多年生藥用植物，主要分布于河北、內蒙古等地區，繁殖能力弱和無節制采挖等因素導致該植物野生資源日益枯竭。 為保護北蒼術自然種群，減少環境破壞，如何通過人工栽培技術保證北蒼術質量成為科研人員亟待解決的核心問題[1]。

肥料組成及用量直接決定蒼術外部形態特征和次生代謝產物的差異。 有研究表明，低或高濃度氮素均會加速北蒼術細胞膜結構損傷，加重連作障礙的發生，次生代謝產物甚至低于野生蒼術[2－4]。 但也有研究發現低pH 值提高了蒼術根中β－桉葉醇含量[5]。 大田試驗發現北蒼術在施用氮肥(N)180 kg/hm2、磷肥(P2O5)225 kg/hm2、鉀肥(K2O)105 kg/hm2情況下藥用成分含量最高[6]。 增施鉀肥可以提高藥用植物干物質生產能力和根系產量[7]。 噴施鋅肥有助于提高關蒼術白術內酯Ⅱ和蒼術素含量，硼肥能顯著提高關蒼術花粉活力、花粉數量、結實率及百粒重等[8]。目前，多數研究停留在施肥對蒼術生長的短期影響，不同生長年限的北蒼術次生代謝產物積累對土壤礦質元素的響應尚不明確。 為此，本試驗以一年生、三年生和七年生北蒼術為研究對象，分析其主要藥用成分的差異，通過比較土壤中礦質元素和北蒼術次生代謝產物積累的特征，明確土壤礦質元素對北蒼術藥用成分影響的關鍵因子，以期為我國優質北蒼術生產提供理論借鑒。

1 材料與方法

1.1 種植地概況及試驗管理

種植基地位于河北省承德市隆化縣白虎溝村(117.078072°E，40.150558°N)。 該地區屬于溫帶大陸性季風氣候，四季分明、雨熱同季，光照充足，多年平均日照時數2 665.7 h，年均氣溫7.5℃，無霜期約153 d，年均降水量505.2 mm，屬于北蒼術主要道地產區之一。 該基地種植一年生、三年生和七年生蒼術，肥料、灌溉和除草等統一管理。 蒼術生長季施用氮肥(N)220 kg/hm2、磷肥(P2O5)190 kg/hm2、鉀肥(K2O)105 kg/hm2。

1.2 樣品采集

于2020 年10 月中旬北蒼術收獲期，按照五點取樣法采集土壤樣品，每處理重復3 次。 用土鉆鉆取0～20 cm 土樣，充分混合后采用四分法取舍。 將土樣充分混勻后，剔除其中石塊和動植物殘體等雜質，帶回實驗室。 土樣平鋪于陰涼處自然風干，研磨，過0.15 mm 孔徑篩，留存待測。

在對應土壤樣點處采集不同生長年限的北蒼術，選取長勢基本一致、無病蟲害的健壯植株，經河北中醫學院鄭玉光教授鑒定為北蒼術Atractylodes chinensis(DC.)Koidz.。 將北蒼術根莖帶回實驗室除去泥沙，自然陰干，撞掉須根，粉碎，過三號篩，用于各指標測定。

1.3 測定項目及方法

土壤pH 測定用電位法(土水比1 ∶2.5)，即準確稱取10.0 g 過篩鮮土放入燒杯中，加入25 mL經過煮沸后靜置至常溫的去離子水，充分振蕩1 min，靜置30 min 后使用pH 計測定。 參照魯如坤[9]的方法測定土壤養分含量。 土壤有機碳采用重鉻酸鉀氧化－外加熱法測定，用FeSO4標準溶液滴定剩余的重鉻酸鉀，并計算出有機碳含量。土壤全氮采用凱氏定氮法，借助FOSS KJELTEC 8200 測定，全磷、全鉀和鋅、氯、銅等元素采用電感耦合等離子質譜(ICP－MS)法測定。

供試儀器及標準品:LC－20AD 高效液相色譜儀(日本島津公司)，KQ－300VDE 型雙頻數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，BSA224S－CW 電子分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)。 蒼術素(批號:MUST－19051602，純度≥99.89%)，β－桉葉醇(批號:MUST-1911262，純度≥99%)， 白術內酯Ⅰ(批號: MUST －19101112，純度≥99.75%)，以上對照品均購自成都曼斯特生物科技有限公司。 乙腈為色譜純(Fisher Scientific Co. Ltd.)，水為Milli－Q 自制水，其他試劑均為分析純。

采用高效液相色譜法測定北蒼術樣品中β－桉葉醇、白術內酯Ⅰ、蒼術素三種有效成分含量。色譜柱:Inertsil ODS－3 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相:乙腈(B) －0.1% 甲酸水溶液(A)；梯度洗脫(0 ～30 min，50%B；30 ～35 min，52%B；35～45 min，55%B；45～48 min，58%B；48 ～58 min，60%B；58 ～70 min，80%B；70 ～75 min，82%B)；流速:1.0 mL/min；檢測波長:220 nm(白術內酯Ⅰ，45 ～55 min)，203 nm(β－桉葉醇，55 ～60 min)，340 nm (蒼術素，60 ～70 min)；柱溫:25℃；進樣量:10 μL。 方法學考察結果顯示蒼術素精密度、重復性、穩定性RSD 分別為1.28%、0.85%、1.51%；白術內酯Ⅰ精密度、重復性、穩定性RSD 分別為1.34%、0.98%、1.72%；β－桉葉醇精密度、重復性、穩定性RSD 分別為1.47%、1.43%、1.87%； 加樣回收率分別為99. 98%、99.86%、100.08%，RSD 分別為1.95%、0.98%、1.29%；線性關系:Y蒼術素＝1×108X＋621976，R2＝0.9998；Y白術內酯Ⅰ＝4×107X＋189482，R2＝0.9997；Yβ－桉葉醇＝2×107X＋283364，R2＝0.9997。

1.4 數據處理與分析

試驗數據采用Microsoft Excel 2019 整理，SPSS 22.0 軟件進行統計分析，Duncan’s 新復極差法進行差異顯著性分析(P＜0.05)，OriginPro 2019 軟件繪圖。 采用Pearson 法進行相關性分析， Canoco 5.0 軟件進行冗余分析(Redundancy analysis，RDA)。

2 結果與分析

2.1 不同生長年限北蒼術土壤pH 值及礦質元素含量

由表1 看出，隨著生長年限的延長，北蒼術土壤pH 值呈顯著下降趨勢，七年生北蒼術土壤pH 值較一年生低3.23%。 七年生和三年生北蒼術土壤有機碳含量顯著低于一年生，其中七年生土壤有機碳含量下降6.81%。 土壤全氮和全磷含量與土壤有機碳相反，均呈增加趨勢。 土壤全氮含量從1.06 g/kg 增加到1.24 g/kg，但是不同生長年限土壤全氮含量差異均不顯著；土壤全磷含量存在顯著差異，其中七年生土壤全磷含量較一年生高17.39%。三年生土壤全鉀含量顯著高于一年生和七年生，一年生雖然低于七年生，但二者差異不顯著。

表1 不同生長年限北蒼術土壤理化性狀 (g/kg)

由表2 可以看出，一年生北蒼術土壤中氯含量最高，但與三年生和七年生差異不顯著。 一年生和三年生北蒼術土壤中鈉含量均顯著高于七年生，分別為1.27 mg/kg 和1.25 mg/kg。 對微量元素而言，不同生長年限北蒼術土壤中含量有差異。其中七年生北蒼術土壤中鋅含量最高，達到66.74 mg/kg，比一年生顯著高5.79%。 七年生土壤中銅含量比一年生高7.41%；鉛含量為一年生最高，其次是七年生，三年生最低，為27.33 mg/kg，但兩種元素不同生長年限間差異均不顯著；土壤中鉻含量表現為三年生最低，七年生最高，達到62.53 mg/kg，顯著高于一年生和三年生北蒼術土壤中鉻含量。

表2 不同生長年限北蒼術土壤礦質元素含量 (mg/kg)

2.2 不同生長年限北蒼術次生代謝產物的差異分析

比較不同生長年限下北蒼術干燥根莖的次生代謝產物含量發現，三年生北蒼術的蒼術素、白術內酯Ⅰ和β－桉葉醇含量均最高(圖1)。 三年生北蒼術的蒼術素含量達到0.69%，顯著高于一年生和七年生，七年生蒼術素含量最低，為0.24%。一年生和七年生白術內酯Ⅰ含量接近，差異不顯著，分別比三年生顯著低47.20%和49.50%。 就β－桉葉醇而言，盡管三年生北蒼術中含量最高(0.78%)，但是與一年生差異不顯著，僅比一年生高1.8%；七年生北蒼術β－桉葉醇含量均顯著低于一年生和七年生，為0.52%。

圖1 不同生長年限北蒼術次生代謝產物差異比較

2.3 北蒼術次生代謝產物對土壤礦質元素的響應

土壤礦質元素與北蒼術次生代謝產物的相關性分析結果(圖2)顯示，土壤有機碳含量顯著影響北蒼術中β－桉葉醇含量，土壤全磷含量則與β－桉葉醇含量呈顯著負相關，土壤全鉀含量與蒼術素、白術內酯Ⅰ呈顯著正相關。

圖2 土壤礦質元素與北蒼術次生代謝產物的相關性分析

冗余分析發現，前兩軸共解釋變量的94.8%，其中，第一軸解釋變量的86.2%，第二軸解釋變量的8.6%(圖3)。 對北蒼術次生代謝成分而言，重金屬鉻與北蒼術藥用成分含量呈顯著負相關，其次是鋅。 土壤全鉀含量對北蒼術根莖藥用成分含量影響最大，但未達顯著水平， 其次為鈉、pH 值和有機碳(SOC)。

圖3 土壤礦質元素與北蒼術次生代謝產物的冗余分析

3 討論

隨著對蒼術研究的不斷深入，已從蒼術中分離出了200 多種化合物，主要為萜類和烯炔類[10 [。 《中華人民共和國藥典(2020 版)》規定，本品按干燥品計算，蒼術素(C13H10O)含量不得少于0.30%。 本試驗結果表明，隨著生長年限延長，北蒼術主要藥用活性成分含量先升高后降低，一年生、三年生和七年生蒼術素含量均超過藥典規定標準，三年生蒼術素、白術內酯Ⅰ和β－桉葉醇含量均為最高。 這與崔馨月[8]研究發現三年生根莖中蒼術酮含量高于四年生和五年生的結論基本一致。 原因可能與連續施用化肥加劇北蒼術連作障礙有關，造成北蒼術土壤微環境惡化。 有報道指出河北北部和遼西的北蒼術品質較好[11]。如果為了追求短期產量而無節制施用化肥，忽視道地藥材產區土壤質量的提升，勢必導致蒼術產業的不良循環。 土壤礦質元素不僅影響中藥材產量和品質，還會影響土壤及植物－植食性昆蟲－天敵的營養關系及藥用植物微生態系統[12]。 因此，加強北蒼術道地產區生態種植模式研究至關重要，金永超[13]采用生物質炭浸提液對茅蒼術進行灌根，顯著增加了茅蒼術中蒼術素含量。 有學者發現茅蒼術和花生間作能夠提高花生產量，降低連作土壤酚酸類物質含量，調控花生土壤微生物群落組成[14]。

本研究表明土壤全鉀含量對北蒼術次生代謝產物累積正向影響最大。 前人研究也發現類似結果，如低鉀脅迫下茅蒼術葉片光合受阻，導致揮發油主要成分β－桉葉醇、茅蒼術醇含量降低[15]。另一方面，鉀素能夠協同其他營養元素共同提升藥用植物質量，楊燕燕[16]研究表明施鉀量與蒼術不同部位的含氮量呈正相關。 楊雪等[7]指出當前鉀素對藥用植物的研究多集中在藥材產量、有效成分含量及生理代謝等方面，未來應加強鉀素對藥效成分及體內代謝與基因調控的研究。 近年來藥理活性研究發現蒼術還具有降血糖、抗菌抗炎、心血管保護和抗腫瘤等作用[17，18]。 對北蒼術而言，需要明確人工栽培中鉀肥最佳施用量，進一步研究鉀素調控北蒼術中蒼術素、白術內酯Ⅰ等藥用成分的內在機制。

微量元素是藥用植物生長發育中不可或缺的，土壤中微量元素供給水平將直接影響北蒼術品質形成。 適量銅肥能顯著提高關蒼術超氧化物歧化酶活性、筒長、花冠長度、花冠寬度、花粉數量[19]，而對于關蒼術蒼術酮、白術內酯Ⅱ和β－欖香烯來說鋅肥是關鍵因素[8]。 對藥用植物來說，微量元素越多并不意味著藥材質量越好，同時也面臨著重金屬污染的風險。 本研究中，土壤重金屬鉻(Cr)、鋅(Zn)、銅(Cu)和鉛(Pb)元素含量雖然均未超過我國當前規定的農用地土壤環境質量標準[20]，但相關性分析表明鉻(Cr)、鋅(Zn)和銅(Cu)元素與北蒼術藥用成分呈負相關，這可能與復合肥中含有重金屬元素有關，并且隨著化肥施用年限的延長，農田中Cr、Cu 和Zn 元素含量呈現累積態勢。 因此，對于以地下根莖入藥的北蒼術而言，必須高度重視土壤潛在的重金屬污染風險，提倡有機肥改良土壤和有機－無機肥料配施改良土壤微生態環境。

4 結論

隨著北蒼術生長年限的延長，土壤礦質養分的變化不盡相同。 連續施用化肥導致北蒼術土壤pH 值和土壤有機碳含量均呈下降趨勢，而土壤全氮和全磷含量則呈現增加趨勢；土壤中鉀元素是正向影響北蒼術次生代謝產物的關鍵因子，鉻和鋅元素等則對北蒼術品質產生一定負效應。 就本研究所涉及的藥用成分來講，生長年限越長并不意味著北蒼術活性物質含量越高，而以三年生北蒼術質量最好，其蒼術素、白術內酯Ⅰ和β－桉葉醇含量均高于一年生和七年生。 未來應加強北蒼術的生態友好型種植模式研究，避免濫用化肥影響北蒼術質量。