MicroRNA-205 通過甲基化修飾調節帕金森病多巴胺神經元LRRK2 表達

王洪偉，陶亮，呂祿廷，孫靜慧，張騰騰，李杰，王建東

1.齊齊哈爾醫學院附屬第二醫院神經內科，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫學院附屬第二醫院心內科，黑龍江齊齊哈爾 161006

帕金森病（parkinson disease, PD）是中樞神經系統常見的退行性疾病，嚴重影響老年患者的身體健康[1]。近年來研究表明，遺傳因素是PD 發生和發展的重要原因之一，在5%～10%的患者中可以鑒定出一些遺傳因素，并且與一般人群或對照組相比，受影響患者的一級家庭成員患該病的風險增加2～3倍[2]。另有研究發現PD 最常見的單基因形式之一是由編碼富亮氨酸重復激酶2（Leucinerichrepeatproteinkinase2, LRRK2）的基因突變引起的[3]，特發性PD 的發病機制中發揮作用，LRRK2-PD 和特發性PD 之間的密切相似性提示LRRK2-PD中神經退行性變機制的可能性，這可能為特發性PD 的病理生理學和治療提供新見解。

MicroRNAs（miRNAs）是進化上保守的小的非蛋白質編碼轉錄本，與靶信使RNA（mRNA）的3'-未翻譯區（3'-UTR）的部分互補位點結合，從而調控其靶基因的翻譯[4]，許多miRNAs 通過調節靶向基因的翻譯與神經系統中的神經元發育、突觸可塑性、記憶形成和神經退行性疾病相關[5-6]。目前，雖然有關于miR-205 在神經退行性病變中的相關研究，但其在PD 紋狀體中的表達以及對神經元凋亡的影響和機制尚未明確。因此，深入研究miR-205 與LRRK2 在PD 病理改變中的作用及作用機制對于治療PD 至關重要。本研究通過對PD 細胞模型進行相關實驗，探究PD 細胞模型中miR-205 與LRRK2之間的關系，試圖通過該實驗闡明PD 中miR-205對LRRK2 的調控機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

5%胎牛血清、1%的青霉素/鏈霉素雙抗、高糖DMEM 培養基、細胞培養12 孔板、維生素A、TPA（phorb-ol ester 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate）、MPP（1-methyl-4-phenyl-pyridiniumion）、10%胎牛血清、細胞培養箱、亞硫酸氫鹽、甲基化檢測試劑盒、miR-205 抑制劑、前體miR-205 及miR-205 陰性質粒、miRNA 提取試劑盒、電泳儀、PCR 儀。

1.2 方法

1.2.1 PD 模型細胞制備 人神經母細胞瘤細胞（SHSY5Y）購買后，采用含5%胎牛血清及1%的青霉素/鏈霉素雙抗在高糖DMEM 中培養進行培養，24 h更換1 次液體，細胞覆蓋皿底后用胰酶將其消化為單細胞，并制成1×104/mL 的細胞懸液。然后將細胞以1×104/孔的密度接種到包被明膠的12 孔板中，此時向培養液中添加10 μM 的維生素A，在5%CO2的濕培養箱中37℃條件下培養，48 h 后換液1 次，然后再繼續培養24 h。隨后，將培養液中的維生素A 替換為80 nM 的TPA，繼續培養3 d。SH-SY5Y 細胞誘導分化6 d 后，此時的SH-SY5Y 細胞已經具有多巴胺神經細胞的生物學特征。將分化后的SH-SY5Y細胞分為兩組，一組用含5% 胎牛血清的高糖DMEM 培養液培養作為對照組；一組用含1 mM 的MPP 及5%胎牛血清的高糖DMEM 培養液誘導為PD 模型細胞。培養48 h 后，多巴胺神經細胞誘導為PD 模型細胞。

1.2.2 PD 模型細胞中miR-205 甲基化檢測 提取SH-SY5Y 細胞的DNA，用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發生甲基化的胞嘧啶被轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變；隨后設計針對甲基化和非甲基化序列的引物進行PCR。通過電泳檢測MSP 擴增產物，確定miR-205 啟動子區域的甲基化，并進一步檢測miR-205 的轉錄水平，確定LRRK2 的表達水平。

1.2.3 miR-205 過表達以及抑制試驗 購買miR-205抑制劑、前體miR-205 及miR-205 陰性質粒[Ambion（Austin, TX, USA）]，準備進行RNA 干擾及過表達試驗，準備12 孔板，復蘇SH-SY5Y 細胞，然后將細胞以1×105/孔的密度接種后，用含10%胎牛血清的DMEM 培養液進行培養。細胞培養24 h 后，將其分為4 組：無處理組、陰性對照組、前體miR-205、miR-205 抑制劑。細胞轉染48 h 后，收集細胞，分別提取mRNA 進行檢測，確定miR-205 水平與LRRK2 表達量之間的關系，明確miR-205 抑制劑在PD 模型細胞的調控機制。

1.2.4 q-PCR 試驗 收集細胞，采用試劑盒提取mRNA。miRNA 試劑盒提取組織中總RNA，Qiagen miScript RT 試劑盒進行反轉錄。再以cDNA 為模板，在DNA 聚合酶作用下擴增合成miR-205 和LRRK2 片段。LRRK2 轉錄，使用SYBR Green Master mix，GAPDH 作為內源對照，方法參照試劑盒說明書。miR-205 轉錄水平分析，采用All-in-One?miRNA qRT-PCR Detection Kit 監測試劑盒，U6 作內源對照。PCR 條件：95℃加熱40 s；然后95℃加熱10 s，60℃延長30 s，總計40 個循環；最后72℃條件下處理5 min。表達量的計算方法采用2-ΔΔCt，ΔΔCt=[Ct（靶基因）-Ct（內參）]組1-[Ct（靶基因）-Ct（內參）]組2。

1.3 觀察指標

各組細胞模型中qRT-PCR 檢測miR-205、LRRK2 表達水平；使用miR-205 抑制劑后各組細胞模型LRRK2 表達水平；miR-205 過表達后各組細胞模型LRRK2 表達水平

1.4 統計方法

采用GraphPad Prism 軟件對數據進行分析，實驗的數據以（±s）表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，多組比較采用方差分析方法進行分析；方差分析兩兩比較結果采用Tukey-Kramer 多重比較檢驗確定統計學意義。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PD 模型細胞中miR-205 水平下調，LRRK2 水平上調

本研究提取正常細胞以及PD 模型細胞的總RNA，通過q-PCR 方法檢測兩種細胞中miR-205 以及LRRK2 的表達水平，發現相較于正常細胞（1.02±0.14），PD 模型細胞中miR-205 的表達水平明顯降低（0.59±0.03），差異有統計學意義（P=0.017），見圖1A；而相較于正常細胞（1.00±0.11），PD 模型細胞中LRRK2 水平上調（1.50±0.10），差異有統計學意義（P=0.033），見圖1B。

圖1 miR-205 及LRRK2 表達水平

2.2 miR-205 抑制劑促進LRRK2 表達

miR-205 抑制劑被設計用于特異性結合內源性miR-205 并抑制其活性。經鑒定，相較于正常細胞（1.02±0.11）以及PD 模型細胞（1.47±0.12），轉染miR-205 抑制劑后可誘導神經元培養物中LRRK2蛋白表達的劑量依賴性上調（1.87±0.11），差異有統計學意義（P=0.036），見圖2。

圖2 miR-205 抑制后LRRK2 表達水平

2.3 miR-205 過表達可抑制LRRK2 表達

為了進一步研究miR-205 對LRRK2 表達的影響，將前體miR-205 轉染到細胞中，通過q-PCR 分析LRRK2 轉錄水平。前體miR-205 進入細胞后被轉化為成熟miR-205。觀察到，相較于正常細胞（1.02±0.11）以及PD 模型細胞（1.47±0.12），使用前體miR-205 處理SH-SY5Y 細胞可持續抑制LRRK2蛋白表達約50%（0.87±0.11），差異有統計學意義（P=0.020），見圖3。

圖3 miR-205 過表達后LRRK2 表達水平

3 討論

miR-205 參與代謝、神經營養素信號調節等生物學過程，其異常表達與PD 的發生有關，但其在PD 患者紋狀體中的表達以及對神經元凋亡的影響和機制尚未明確[7]。LRRK2 是常染色體遺傳性PD最常見的病因。LRRK2 突變導致全球多達5%的家族性病例[8]。LRRK2 的錯義突變與家族性和散發性PD 相關。LRRK2 基因表達的簡單改變可能導致常見散發性PD 的可能性[9]。LRRK2 酶結構域的7個點突變（G2019S、I2020T、R1441C/G/H、Y1699C、N1437H）導致常染色體顯性PD。重要的是，LRRK2的遺傳變異體也是克羅恩病、麻風病和結核病的危險因素，這提示LRRK2 蛋白在中樞神經系統之外發揮重要作用，有研究表明LRRK2 蛋白在全身低水平表達，在腎臟、肺和免疫細胞中水平最高，在大腦中有少量表達[10]。此前已有研究嘗試檢測家族性和散發性PD 患者大腦中LRRK2 蛋白的表達水平[11]。

有研究表明，LRRK2 可能與miRNA 處理途徑相互作用，調節蛋白質合成[12]。Chen Q 等[13]研究表明MALAT1/miR-205-5p 軸通過靶向LRRK2 調控MPP+誘導的MN9D 細胞凋亡，Cho HJ 等[14]檢測了散發性PD 患者額葉大腦皮層中LRRK2 蛋白和LRRK2 靶向miR-205 的水平。他們發現，LRRK2 蛋白表達水平在PD 患者大腦中顯著升高，而miR-205表達水平降低，進一步研究發現miR-205 可以直接調控LRRK2 的表達。并且體外細胞模型也已明確，LRRK2 蛋白的表達水平在PD 組中的表達顯著增加[15]，與本文出的結論一致，本研究在PD 模型細胞中也發現LRRK2 蛋白表達水平升高，而miR-205表達水平降低，當過表達miR-205 后，LRRK2 蛋白表達下降；與前期研究結論相似[15]，本研究也進一步證明了miR-205 能抑制LRRRK2 的表達。因此，深入研究miR-205 與LRRK2 在PD 的病理改變中的作用及作用機制對于治療PD 至關重要，研究miRNA-205 在PD 病理改變中的調控作用對于尋找PD 治療新靶點具有重要意義。

為了研究PD 患者中miR-205 的過表達或抑制是否影響LRRK2 的表達，本研究使用SH-SY5Y 成功誘導出PD 細胞模型，并對PD 細胞模型進行miR-205 過表達及抑制實驗，發現在PD 細胞模型中miR-205 可以抑制LRRK2 的表達，miR-205 的下調可能導致了LRRK2 蛋白在散發性PD 患者腦內的潛在致病性升高，而過表達miR-205 可能為抑制LRRK2 蛋白在PD 中的異常上調提供一種適用的治療策略，這些結果表明內源性miR-205 是細胞中LRRK2 蛋白表達的抑制因子。本研究推測microRNAs 可能負責LRRK2 的轉錄調控，因為它們以序列依賴的方式結合到靶基因3'-UTR 的特定區域，從而抑制基因轉錄，進一步證實了miR-205 在調節LRRK2 表達中的作用。因此，本研究結果表明，miR-205 可能是PD 的潛在生物標志物，上調miR-205 水平可能為抑制散發性PD 中LRRK2 的表達提供一種可能的治療途徑。但是目前尚不清楚miR-205 在PD 患者大腦中的表達是如何下調的。因此進一步研究PD 患者腦內miR-205 基因位點的DNA 甲基化或其他修飾，可能為闡明散發性PD 患者miR-205 表達變化的機制提供線索。

綜上所述，本研究進一步揭示了miR-205 調控LRRK2 蛋白表達的新機制，提示miR-205 可能作為散發性PD 的生物標志物和治療靶點。