乙型肝炎病毒共價(jià)閉合環(huán)狀DNA 清除的研究進(jìn)展

李成，莫雪，牛文霞，李明明，付麗娟，，3

1.湖北省孝感市中心醫(yī)院，湖北孝感 432000；2.廈門(mén)大學(xué)附屬翔安醫(yī)院感染科，福建廈門(mén) 361000；3.廈門(mén)市感染性疾病質(zhì)量控制中心，福建廈門(mén) 361000

慢性乙型肝炎是乙型肝炎病毒持續(xù)感染引起的以肝臟慢性炎癥性改變?yōu)橹饕卣鞯囊活?lèi)傳染病。長(zhǎng)期慢性感染會(huì)導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化、肝癌等終末期肝病的發(fā)生，嚴(yán)重危害人民群眾的健康。慢性乙型肝炎病毒感染依然是全球公共衛(wèi)生健康問(wèn)題之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球約有20 億人曾經(jīng)感染過(guò)HBV，近2.57 億人為慢性感染者，其中每年約78 萬(wàn)人死于HBV 相關(guān)肝病及其并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康[1]。接種乙肝疫苗是預(yù)防乙肝病毒感染最有效的途徑。乙肝疫苗在我國(guó)廣泛接種使得新發(fā)感染率逐年下降，我國(guó)現(xiàn)在屬于HBV 中度流行區(qū)的國(guó)家，目前我國(guó)有7 400 萬(wàn)人為HBV 攜帶者[2]。

當(dāng)前臨床上使用的抗乙肝病毒治療藥物主要為聚乙二醇化干擾素α（polyethylene glycol interferon, PEG-IFNα）和核苷（酸）類(lèi)似物[nucleos(t)ide analogues, NAs][3]。雖然這兩類(lèi)藥物均能有效抑制HBV 復(fù)制，阻止炎癥進(jìn)展和改善預(yù)后。但兩者都不能影響最初形成的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA, cccDNA），同時(shí)對(duì)感染肝細(xì)胞核內(nèi)現(xiàn)存的cccDNA 沒(méi)有清除作用，也不能對(duì)整合到肝細(xì)胞染色體上的病毒基因起到清除作用。因此，患者往往需要長(zhǎng)期使用抗乙肝病毒藥物治療來(lái)抑制病毒復(fù)制。目前臨床上使用的抗病毒治療方案都無(wú)法徹底地清除感染肝細(xì)胞核內(nèi)cccDNA，難以實(shí)現(xiàn)慢性乙型肝炎的完全治愈[4]。為了達(dá)到徹底治愈HBV 感染的目標(biāo)，關(guān)鍵在于可以靶向根除感染肝細(xì)胞核內(nèi)cccDNA 的抗病毒治療策略[5]。本文對(duì)HBV cccDNA 清除的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在尋找徹底清除cccDNA 的方法。

1 靶向抑制cccDNA 的形成

感染肝細(xì)胞核內(nèi)的cccDNA 是HBV 感染肝細(xì)胞后由雙鏈環(huán)狀不完全閉合DNA（relaxed circular DNA, rcDNA）在核內(nèi)利用細(xì)胞的DNA 損傷修復(fù)機(jī)制轉(zhuǎn)化形成的。病毒以cccDNA 為模板轉(zhuǎn)錄合成所有的RNA 和子代病毒基因組。具有超螺旋結(jié)構(gòu)的cccDNA 與細(xì)胞組蛋白、非組蛋白等結(jié)合形成微染色體穩(wěn)定存在于被感染肝細(xì)胞核內(nèi)，加之目前缺乏直接靶向cccDNA 的抗病毒治療藥物，使得HBV 能長(zhǎng)期存在于乙肝患者肝臟內(nèi)并導(dǎo)致慢性感染。因此，研究HBV cccDNA 的形成機(jī)制和HBV 與宿主相互作用對(duì)于研發(fā)清除cccDNA 藥物、治愈慢性乙型肝炎具有重大意義。

研究表明進(jìn)入肝細(xì)胞核內(nèi)的rcDNA 轉(zhuǎn)化形成cccDNA 的過(guò)程至少包括負(fù)鏈5’端病毒聚合酶、負(fù)鏈5’端和3’端的冗余片段、正鏈5’端的RNA 引物的去除和正鏈3’端缺口及雙鏈間隙的填補(bǔ)[6]。在此過(guò)程中，酪氨酰-DNA-磷酸二酯酶2（tyrosyl-DNA-phosphodiesterase 2, TDP2）[7]參與去除rcDNA負(fù)鏈5’端共價(jià)連接病毒聚合酶的過(guò)程，促進(jìn)rcDNA向cccDNA 的轉(zhuǎn)化。然而，在另一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)TDP2 并不是體內(nèi)cccDNA 形成過(guò)程中不可或缺的宿主DNA 修復(fù)酶[8]。Flap 核酸內(nèi)切酶1（flap endonuclease 1, FEN1）[9]結(jié)合并切割rcDNA 負(fù)鏈5’端的冗余片段促使rcDNA 向cccDNA 的轉(zhuǎn)化。DNA 聚合酶κ、α、DNA 連接酶（DNA ligases, LIG）參與cccDNA形成過(guò)程中DNA 缺口的修復(fù)[10-12]，其中細(xì)胞內(nèi)cccDNA 擴(kuò)增需要DNA 聚合酶α、δ 和ε 的參與，HBV從頭感染過(guò)程中需要DNA 聚合酶κ 和λ 的參與。此外，研究發(fā)現(xiàn)DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶、共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張與RAD3 相關(guān)（ataxia telangiectasia and RAD3-related, ATR）途徑也參與了cccDNA 形成過(guò)程中rcDNA 的損傷修復(fù)[13-14]。

最近一項(xiàng)由rcDNA 底物經(jīng)過(guò)酵母和人肝癌細(xì)胞提取物及純化人蛋白修復(fù)形成cccDNA 的實(shí)驗(yàn)篩選確定了rcDNA 修復(fù)形成cccDNA 過(guò)程中的5 個(gè)關(guān)鍵宿主因子：增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）、復(fù)制因子C 復(fù)合物（replication factor C complex, RFC）、POLδ、FEN1 和LIG1[15]。rcDNA 向cccDNA 轉(zhuǎn)化過(guò)程中正鏈和負(fù)鏈缺口修復(fù)所需要的宿主因子不完全相同[16]，其中正鏈缺口修復(fù)需要PCNA、RFC、POLδ、FEN1 和LIG1 這5 個(gè)宿主因子的參與，而負(fù)鏈的修復(fù)只需要FEN1 和LIG1 的參與。這對(duì)于全面了解rcDNA 是如何轉(zhuǎn)化形成cccDNA 的過(guò)程及研發(fā)新的靶向藥物至關(guān)重要。

脫蛋白的松弛環(huán)狀DNA（deproteinized relaxed circular DNA, DP-rcDNA）是rcDNA 轉(zhuǎn)變形成cccDNA 過(guò)程中重要中間產(chǎn)物。通過(guò)HBeAg 的比例表達(dá)來(lái)監(jiān)測(cè)cccDNA 水平的細(xì)胞篩選策略研究發(fā)現(xiàn)兩種結(jié)構(gòu)相關(guān)的雙取代磺酰胺（disubstituted sulfonamides, DSS）（CCC-0975 和CCC-0346），DSS 化合物通過(guò)降低HepDES19 細(xì)胞中DP-rcDNA 的水平抑制rcDNA 向cccDNA 的轉(zhuǎn)化來(lái)減少cccDNA 的生物合成[17]。DSS 化合物有望成為臨床治療HBV 的新型藥物。一項(xiàng)對(duì)包含大約1 000 個(gè)參與DNA 損傷反應(yīng)、表觀遺傳和核酸結(jié)合途徑的基因文庫(kù)進(jìn)行siRNA 篩選研究確定了剪接體成分前mRNA 加工因子31（pre-mRNA processing factor 31, PRPF31）參與cccDNA 的形成[18]。該研究表明PRPF31 與HBx 共定位于細(xì)胞核內(nèi)，只有當(dāng)PRPF31-HBx 共同過(guò)表達(dá)時(shí)cccDNA 的形成才會(huì)顯著增加。PRPF31-HBx 復(fù)合物如何促進(jìn)cccDNA 形成機(jī)制有待進(jìn)一步研究。抑制PRPF31 與HBx 之間的相互作用可以作為抗HBV 治療的新靶點(diǎn)。

2 沉默cccDNA 的轉(zhuǎn)錄

肝細(xì)胞核內(nèi)的cccDNA 并不都是以簡(jiǎn)單的超螺旋結(jié)構(gòu)游離形式存在，部分與組蛋白、非組蛋白等結(jié)合形成微染色體結(jié)構(gòu)。因此cccDNA 的轉(zhuǎn)錄受到微染色體上組蛋白及非組蛋白的化學(xué)修飾調(diào)控作用的影響，其中包括DNA 甲基化、組蛋白及非編碼RNA 修飾。HBV cccDNA 包含3 個(gè)CpG 島，該區(qū)域的甲基化狀態(tài)可以參與調(diào)控HBV 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，這為CpG 甲基化在調(diào)節(jié)HBV cccDNA 轉(zhuǎn)錄功能提供了新的見(jiàn)解[19]。此外，組蛋白甲基化、乙酰化等修飾也參與調(diào)節(jié)cccDNA 的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。陳娟等[6]通過(guò)篩選并確定了沉默交配類(lèi)型信息調(diào)控2 同源物3（silent mating type information regulation 2 homolog 3, SIRT3）可以通過(guò)與組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶協(xié)同作用來(lái)限制cccDNA 轉(zhuǎn)錄所需要的宿主因子而起到沉默cccDNA 轉(zhuǎn)錄的作用[20]。這為SIRT3 將來(lái)被應(yīng)用于治療慢性乙型肝炎提供了相關(guān)的理論依據(jù)。Pollicino T[21]等研究表明cccDNA 的轉(zhuǎn)錄水平受H3 和H4組蛋白乙酰化水平的影響，其乙酰化可以促進(jìn)cccDNA 的轉(zhuǎn)錄，反之則抑制cccDNA 的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)組蛋白脫乙酰基酶11（histone deacetylase 11, HDAC11）被招募到cccDNA 中，通過(guò)降低與cccDNA 結(jié)合的H3 組蛋白賴(lài)氨酸H3K9 和H3K27 的乙酰化水平來(lái)抑制cccDNA 的轉(zhuǎn)錄[22]。最近一項(xiàng)研究報(bào)道顯示，組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶1（histone acetylbased transferase 1, HAT1）可以促進(jìn)微染色體的組裝和組蛋白乙酰化修飾，由于HAT1 可以使新合成的組蛋白發(fā)生乙酰化修飾，使得新合成的組蛋白上的乙酰化狀態(tài)在宿主細(xì)胞中核小體的組裝過(guò)程中起到重要作用，進(jìn)一步解釋了cccDNA 調(diào)控的分子機(jī)制，這為宿主HAT1 信號(hào)調(diào)節(jié)游離病毒基因組復(fù)制機(jī)制提供了新的思路[23]。新的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)SIRT7 通過(guò)與HBx 相互作用催化與cccDNA 結(jié)合的組蛋白H3K122 脫琥珀酰化在表觀遺傳上沉默cccDNA 的轉(zhuǎn)錄[24]。該項(xiàng)研究將SIRT7 確定為研發(fā)抗HBV 感染的新型表觀遺傳治療提供潛在靶點(diǎn)。

除了DNA 甲基化及組蛋白修飾，非組蛋白也可以參與cccDNA 的表達(dá)調(diào)控。HBx 可以通過(guò)與宿主蛋白的相互作用降解維持染色體結(jié)構(gòu)復(fù)合物Smc5/6 來(lái)消除Smc5/6 對(duì)cccDNA 轉(zhuǎn)錄的抑制作用，從而促進(jìn)cccDNA 的轉(zhuǎn)錄[25]。一項(xiàng)在感染HBV 的原代肝細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)了一種噻唑類(lèi)抗感染藥硝唑尼特（nitazoxanide, NTZ）可以有效抑制HBx 和損傷特異性DNA 結(jié)合蛋白1（damage specific DNA binding protein 1, DDB1）的相互作用，進(jìn)而能夠恢復(fù)Smc5蛋白表達(dá)來(lái)沉默cccDNA 的轉(zhuǎn)錄及相關(guān)病毒蛋白的產(chǎn)生[26]。靶向HBV 相關(guān)病毒與宿主蛋白之間相互作用的NTZ 可能為治療慢性乙型肝炎提供新的抗病毒方案。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)具有先天傳感器來(lái)識(shí)別和結(jié)合細(xì)胞核中cccDNA 功能的干擾素誘導(dǎo)蛋白16（interferon-inducible protein 16, IF16）通過(guò)靶向作用于cccDNA 上的干擾素刺激反應(yīng)元件（interferonstimulated response element, ISRE）進(jìn)而表觀遺傳抑制cccDNA 的轉(zhuǎn)錄[27]。該項(xiàng)研究表明IF16 可以作為治療HBV 感染的潛在靶點(diǎn)。通過(guò)表觀遺傳修飾途徑沉默cccDNA 的轉(zhuǎn)錄來(lái)抑制HBV 的復(fù)制，這為抗HBV 藥物的研發(fā)提供新的思路。

3 誘導(dǎo)cccDNA 的降解

HBV 慢性感染患者體內(nèi)的cccDNA 是不斷變化并維持相對(duì)平衡。機(jī)體可以通過(guò)細(xì)胞溶解和非細(xì)胞溶解兩個(gè)途徑來(lái)降解部分cccDNA。細(xì)胞溶解途徑是通過(guò)免疫損傷和細(xì)胞凋亡過(guò)程使被感染的肝細(xì)胞發(fā)生溶解破壞，cccDNA 從細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái)被巨噬細(xì)胞吞噬或與抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物后被巨噬細(xì)胞吞噬，從而清除cccDNA。相反，非細(xì)胞溶解途徑是在免疫應(yīng)答過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)胞因子（如干擾素、腫瘤壞死因子和白細(xì)胞介素等）在不發(fā)生細(xì)胞溶解的前提條件下清除細(xì)胞內(nèi)的cccDNA。Xia Y等[28]研究表明T 細(xì)胞產(chǎn)生的IFNγ 和TNFα 通過(guò)誘導(dǎo)cccDNA 脫氨基作用降低肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA 的表達(dá)水平。另外，有研究發(fā)現(xiàn)高劑量IFNα 和淋巴毒素β受體分別誘導(dǎo)胞嘧啶脫氨酶3A 和3B 的表達(dá)，通過(guò)HBV 核心蛋白與cccDNA 的相互作用，使cccDNA 發(fā)生脫氨基作用形成脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)，進(jìn)而降解cccDNA[29]。隨后，Bockmann JH[30]等研究發(fā)現(xiàn)與IFNα 相比，IFNβ 和IFNλ 可以更為持久地誘導(dǎo)載脂蛋白B 信使RNA 編輯酶催化多肽樣（apolipoprotein b messenger rna-editing enzyme-catalytic polypeptidelike, APOBEC）脫氨酶的表達(dá)，使肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA發(fā)生脫氨基作用造成G-A 序列的變化來(lái)降解cccDNA。

最近研究發(fā)現(xiàn)IFN 通過(guò)非細(xì)胞溶解途徑誘導(dǎo)cccDNA 的降解過(guò)程依賴(lài)于干擾素刺激基因20（interferon-stimulated Gene 20, ISG20）[31]。ISG20 是促使IFN 誘導(dǎo)cccDNA 降解的核酸酶，這為研發(fā)抗HBV 藥物提供潛在靶點(diǎn)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 在肝細(xì)胞中可以通過(guò)激活胞苷脫氨酶來(lái)誘導(dǎo)cccDNA 脫氨基作用進(jìn)而降解cccDNA[32]。目前，隨著對(duì)細(xì)胞因子的研究及PEG-IFNα 在臨床上慢性乙型肝炎表現(xiàn)出的治療效果來(lái)看，細(xì)胞因子相關(guān)藥物的研發(fā)將成為臨床上治療HBV 感染新型抗病毒治療方案。然而，有關(guān)細(xì)胞因子如何通過(guò)非細(xì)胞溶解途徑來(lái)降解cccDNA 機(jī)制仍需要深入進(jìn)行研究。

近年來(lái)隨著基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展并在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用，部分研究學(xué)者在構(gòu)建的體外細(xì)胞或動(dòng)物模型中采用基因編輯技術(shù)方法研究cccDNA 降解機(jī)制，其中包括鋅指核酸酶（zinc finger nuclease, ZFNs）[33]、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（transcription activator like effector nucleases, TALENs）[34]和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/CRISPR 相關(guān)蛋白9（CRISPR/Cas9）技術(shù)[35]。但是，由于目前基因編輯技術(shù)存在脫靶效應(yīng)和缺乏相應(yīng)的體內(nèi)遞呈載體，使得靶向降解cccDNA 的基因編輯技術(shù)在臨床上無(wú)法得到有效的應(yīng)用，需要進(jìn)行相關(guān)研究并找到解決這些問(wèn)題的對(duì)策。

4 結(jié)語(yǔ)

HBV 復(fù)制周期的復(fù)雜性和cccDNA 的穩(wěn)定性是治療慢性乙型肝炎達(dá)到完全治愈的難題。隨著對(duì)HBV 在宿主肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制周期和cccDNA 形成過(guò)程的深入研究，這將為作用在HBV 復(fù)制周期各階段潛在靶點(diǎn)的新型抗病毒藥物的研發(fā)提供新的思路。因此，應(yīng)用多途徑的免疫治療聯(lián)合多靶點(diǎn)的藥物治療是目前抑制HBV 基因組表達(dá)并促使cccDNA 清除的有效抗病毒策略[36]。隨著國(guó)內(nèi)外學(xué)者們對(duì)HBV與宿主相互作用是如何參與cccDNA 形成確切機(jī)制的不斷探索和研究，相信未來(lái)一定會(huì)實(shí)現(xiàn)對(duì)cccDNA 的清除和慢性乙型肝炎的治愈。