Smad9基因干擾表達對鵝卵泡顆粒細胞增殖及內分泌的影響

余道倫,佘德勇,葛 凱,楊 磊,張瑞娜,左瑞華,胡文睿

(皖西學院 生物與制藥工程學院,安徽六安 237012)

禽類卵泡發育、成熟并排卵是受內外多種復雜生理生化因素調控的結果。在禽類產蛋期,卵巢上分布有大量正在發育的等級卵泡,這些卵泡按照直徑大小可以劃分為等級前卵泡和排卵前卵泡兩大類。按照直徑由小到大,等級前卵泡依次為小白卵泡(Small white follicles,SWF)、大白卵泡(Large white follicles,LWF)和小黃卵泡(Small yellow follicles,SYF);排卵前卵泡分別用F5/F6,F4,F3…F1 表示[1]。這些卵泡在經歷復雜的選擇過程之后,只有其中的一小部分可以發育成為成熟卵泡并最終排卵,絕大部分的卵泡會因凋亡、閉鎖等原因中途退出連續發育過程,因此,禽類的產蛋量與其卵巢上被選擇進入等級發育的卵泡數量密切相關,等級卵泡數目越多,產蛋序列就越長,產蛋性能也就越高。

研究表明,BMP/Smad信號通路在哺乳動物的卵泡發育、選擇和凋亡過程中發揮著重要作用[2-5]。然而,禽類卵泡發育過程與哺乳動物卵泡發育過程之間差異巨大,該通路在禽類的卵泡發育過程中是否發揮作用以及如何發揮作用目前尚不清楚。轉錄因子Smad9是BMP/Smad信號通路下游的重要成員,研究顯示,Smad9介導著眾多的細胞外信號向細胞內轉導,參與細胞的增殖和分化調控過程[6]。也有報道表明,Smad9可能參與了低產家禽——鵝卵泡的發育啟動,但對該基因在鵝卵泡發育過程中的潛在作用及其機制尚不明確[7]。

為闡明Smad9基因影響鵝卵泡發育的潛在機制,本研究利用免疫組化技術對Smad9在鵝卵泡的表達位置進行定位,再利用針對Smad9基因設計的siRNA序列干擾體外培養的鵝卵泡顆粒細胞,檢測Smad9基因的干擾效率,分析Smad9干擾后對鵝卵泡顆粒細胞增殖和內分泌功能的影響,探討Smad9在禽類卵泡發育過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

DMEM F12培養基(美國Hyclone公司),胎牛血清(美國Sigma公司),細胞用雙抗(北京索萊寶科技有限公司),Ⅳ型膠原酶(生工生物工程股份有限公司),SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司),RNA提取及qPCR檢測相關試劑(北京天根生化科技有限公司),BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo Scientific公司),CCK-8細胞增殖檢測試劑盒(碧云天生物技術有限公司),Smad9-siRNA設計合成、siRNA-mate轉染試劑(上海吉瑪制藥技術有限公司),E2和P4ELISA試劑盒(上海哈靈生物科技有限公司),Smad9一抗抗兔(美國Abcam公司),一抗抗鼠GAPDH(武漢博士德公司),二抗羊抗兔、羊抗鼠(北京中杉金橋公司),ELx808型酶標儀(美國BioTek公司),TY10HD-2000型超微量核酸蛋白分析儀(上海嘉鵬科技有限公司),2406-2型CO2培養箱(美國SHELLAB公司),Olimpus BX61型顯微鏡。

1.2 實驗動物與樣品處理

從安徽省皖西白鵝原種場購買產蛋期鵝2只,頸部放血處死后再鈍性分離暴露腹腔,將卵泡從卵巢上分離取出。其中1只鵝的卵泡去除卵黃后將卵泡壁置于Bouin’s溶液中固定制作石蠟切片。另1只鵝獲取新鮮的SYF卵泡,按照Gilbert等[8]的方法分離顆粒細胞,置于含有胎牛血清(10%)和雙抗(1%)的DMEM培養基中進行培養,后48 h換液。

1.3 試驗分組與轉染方法

將換液后再行培養24 h的細胞分為4組,每組設置3個重復(n=3)。分別為試驗組(Smad9-siRNA,干擾組)、無關序列組(NC-siRNA)、對照組(Blank,培養液組)和轉染試劑組(siRNA-mate)。每孔(12孔)Smad9-siRNA和siRNA-mate轉染劑量分別為2 μL和4 μL。39 ℃條件下靜置培養細胞,48 h后分別收獲細胞用于提取總RNA和總蛋白,同時分別收集細胞培養上清液用于激素水平檢測。試驗所用RNA干擾序列如表1所示。

1.4 SMAD9蛋白在鵝卵泡表達的免疫組化定位

將去除卵黃的卵泡壁制作成5 μm的石蠟切片,經抗原熱修復,再按照SABC免疫組化試劑盒說明書上的步驟對SMAD9蛋白在卵泡上的表達進行檢測,于顯微鏡下觀察SMAD9蛋白的定位情況。

1.5 細胞增殖能力檢測

采用CCK-8法檢測轉染后各組細胞的增殖能力。于96孔板中每孔加入約2 000個細胞,細胞轉染后的6 h、12 h、18 h、24 h、36 h和48 h測定各組細胞培養孔的吸光度(OD值),在測定前 1 h每孔加入CCK-8溶液10 μL,39 ℃繼續培養 1 h后于酶標儀上450 nm波長測定OD值。

1.6 qPCR檢測與分析

采用Trizol法提取各試驗組轉染后細胞的總RNA,利用超微量核酸蛋白分析儀檢測總RNA樣品純度,合格后進行qPCR檢測。依據NCBI上公開發表的鵝Smad9、FSHR、LHR、CYP19A1、GAPDH基因序列,設計相應qPCR引物并由上海生工生物公司合成。具體qPCR引物序列如表2所示。每個檢測樣品設3個重復,以培養液組為對照組,GAPDH為內參,轉染后各基因的表達情況按照2-ΔΔCt方法進行分析[9]。

表2 qPCR所用引物

1.7 Western blot檢測與分析

采用RIPA法提取轉染后細胞的總蛋白,依據BCA蛋白檢測試劑盒說明書測定蛋白質濃度,將已知濃度的各組蛋白樣品用5×SDS-PAGE Loading buffer稀釋至終質量濃度為2 μg/μL蛋白溶液于-80 ℃保存,備用,電泳上樣時按照每孔15 μg加入。各組蛋白樣品經12%的SDS-PAGE分離1.5 h,再在冰浴中轉膜75 min,用 1×TBST 配制5%的BSA 10 mL于雜交盒中室溫封閉1.5 h,依次用一抗Smad9(1∶1 600)與PVDF膜于搖床上4 ℃孵育過夜,結束時用 1×TBST洗膜3次,每次8 min,再依次加入羊抗兔、羊抗鼠二抗(1∶5 000)于搖床上室溫孵育 1 h,結束時用1×TBST洗膜3次,每次8 min,最后將PVDF膜用ECL顯色,于暗房中將膠片曝光、顯影并定影。蛋白表達量采用Image J軟件進行分析。

1.8 ELISA檢測

將置于-80 ℃條件保存的細胞上清液取出于室溫下解凍,按照ELISA試劑盒說明書上的步驟檢測4個試驗組細胞培養上清液中的E2和P4濃度。

1.9 統計學分析

應用SPSS 19.0軟件進行數據統計分析,且所有試驗均獨立重復3次。結果以“平均值±標準誤”表示,采用One-Way ANOVA分析,兩兩分析比較采用t檢驗,P<0.05為有統計學差異。

2 結果與分析

2.1 鵝卵泡中SMAD9蛋白的表達定位

如圖1所示,免疫組化結果顯示SMAD9蛋白在鵝卵泡中僅表達于顆粒細胞。

F.卵泡;O.卵巢;T.卵泡內膜;箭頭指向顆粒細胞層上的SMAD9蛋白信號

2.2 Smad9-siRNA轉染顆粒細胞后干擾效率 分析

干擾48 h后各組細胞Smad9基因qPCR檢測結果顯示,試驗組(干擾組)較對照組(空白組)Smad9mRNA表達水平下降77%,差異極顯著(P<0.01,圖2-A)。SMAD9蛋白表達的Western blot分析表明,干擾48 h后試驗組較對照組下降73%,差異極顯著(P<0.01,圖2-B)。

** P<0.01,與對照組比較。下同

2.3 Smad9基因干擾表達對顆粒細胞增殖的 影響

細胞增殖試驗結果表明,顆粒細胞增殖效率試驗組低于對照組,差異顯著(P<0.05,圖3),其他各組之間無顯著差異。

不同字母表示差異顯著(P<0.05),相同字母表示差異不顯著(P>0.05)

2.4 Smad9基因干擾表達對FSHR、LHR和 CYP19A1基因表達的影響

促卵泡素(FSH)和促黃體素(LH)是卵泡發育成熟并排卵的重要調節因子,它們的作用發揮離不開卵泡上相應受體(FSHR、LHR)的介導。此外,雌激素合成過程受到CYP19A1基因編碼產物芳香化酶的嚴格調控,該基因的表達水平在一定程度上直接影響著體內雌激素的分泌水平。qPCR定量檢測結果顯示,siRNA轉染48 h后試驗組與對照組的FSHRmRNA表達量無明顯差異(P>0.05,圖4-A),LHR和CYP19A1的mRNA表達量試驗組較對照組分別下調85%和81%,差異極顯著(P<0.01,圖4-B和圖4-C)。

A.siRNA轉染48 h后FSHR mRNA的表達;B.siRNA轉染48 h后LHR mRNA的表達;C.siRNA轉染48 h后 CYP19A1 mRNA的表達

2.5 Smad9基因干擾表達對細胞上清中E2和P4濃度的影響

家禽卵泡的發育過程受到眾多內分泌激素的調節,其中的類固醇激素E2和P4是這些激素的代表。轉染48 h后,細胞上清液中E2和P4濃度的ELISA檢測結果顯示,試驗組E2濃度較對照組下降33%,差異顯著(P<0.05,表3),試驗組P4濃度與對照組無顯著差異。

表3 轉染siRNA 48 h后細胞上清液中E2和P4的濃度

3 討 論

Smad9是BMP/Smad信號通路下游重要的轉錄因子,其在體內多種生命活動的生理調節過程中發揮著重要作用[10-14]。前期研究顯示Smad9參與了鵝卵泡發育的啟動過程,然其具體作用機制不明[7]。大量研究已經表明,禽類卵泡的發育、成熟和排卵是體內外多因素綜合作用的結果,這其中卵泡顆粒細胞與卵子之間的相互作用至關重要。本研究采用免疫組化技術對SMAD9蛋白在鵝卵巢的表達進行定位,結果顯示SMAD9蛋白僅表達于卵泡的顆粒細胞層,推斷Smad9可能與鵝卵泡的顆粒細胞發育及其功能發揮存在關聯。

為闡明Smad9基因在鵝卵泡發育中的潛在作用,采用RNA干擾技術對體外培養的鵝卵泡顆粒細胞轉染針對Smad9基因的siRNA干擾序列,熒光定量PCR檢測結果顯示,干擾后顆粒細胞Smad9mRNA的表達水平較對照組下降77%,進一步的蛋白水平檢測也顯示較對照組下降73%,差異具有統計學意義。這些結果表明,本研究針對Smad9基因所設計的siRNA干擾序列是有效的。

研究表明,細胞的增殖和發育水平與其功能密切相關,顆粒細胞在卵泡成熟過程中發揮著關鍵作用,因此顆粒細胞自身的發育狀況將決定著卵泡的發育命運[15-17]。本研究利用CCK-8法對處理后各組顆粒細胞的增殖情況進行檢測,結果顯示,干擾組細胞的增殖能力較其他組顯著減弱。進一步的檢測發現,與卵泡發育、成熟直接相關的雌激素合成基因CYP19A1和促黃體素受體基因LHR的表達在干擾組細胞均顯著下調。另有研究表明,卵泡的發育成熟是多種內分泌激素綜合作用的結果,其中垂體促性腺激素FSH和LH以及類固醇激素E2和P4在這一過程中起關鍵作用。FSH和LH的協同作用對卵泡生長、卵泡細胞增殖以及卵母細胞排出具有重要影響[18-21]。然而這些激素必須通過卵泡上相應受體的介導才能發揮對卵泡發育過程的調節作用[22-26]。此外,類固醇激素E2和P4與體內其他因子的協同作用是卵泡發育、成熟和排卵的內在誘因[27-28]。其中E2是卵巢上卵泡產生的重要激素,研究表明,E2通過改變雌激素敏感基因的活性影響卵泡顆粒細胞的增殖和分化過程[29-30]。另有研究表明,CYP19A1基因編碼產物芳香化酶是卵泡顆粒細胞內將雄激素(雄烯二酮或睪酮)轉化為雌激素的限速酶,卵泡雌激素合成和分泌水平顯著受到CYP19A1基因編碼的芳香化酶生成量的影響[31-32]。本研究在Smad9基因干擾后的qPCR檢測結果顯示,干擾組細胞的LHRmRNA表達水平較對照組下降85%,差異具有統計學意義,而FSHRmRNA的表達在干擾前后無顯著差異。同期檢測結果也顯示,芳香化酶基因CYP19A1mRNA表達水平較對照組顯著下降了81%。與此同時,細胞上清液中E2和P4濃度的ELISA檢測結果顯示,干擾組E2濃度較對照組顯著下降33%, P4濃度在各處理組間無顯著變化。這些結果表明,Smad9基因干擾后顆粒細胞的增殖能力和內分泌功能均顯著下降,可能是Smad9基因干擾后阻斷或抑制了BMP/Smad信號通路或與該通路具有協同作用的其他信號通路對顆粒細胞生理功能的調控過程,導致顆粒細胞合成相關激素和表達相關激素受體的能力顯著下降,其具體作用機制尚不明確,有待進一步深入分析。

綜上所述,本研究采用免疫組化技術將Smad9基因在鵝卵巢的表達準確定位在卵泡顆粒細胞層,在此基礎上,通過RNAi技術,證實了Smad9基因表達變化可以直接影響顆粒細胞的E2合成和LHR的表達,進而影響顆粒細胞的增殖過程。今后,伴隨對Smad9基因功能的深入認識,未來也許可以通過調節體內Smad9基因的表達,實現對卵泡發育過程的調控,為提高動物,尤其是低產動物的繁殖力提供新的思路和途徑。